Un modello murino di esposizione fetale all'infiammazione materna per studiare gli effetti della corioamionite acuta sullo sviluppo intestinale appena nato

Summary

Abbiamo sviluppato un modello di corioamionite per simulare l’esposizione fetale all’infiammazione materna (FEMI) senza complicazioni di organismi vivi per esaminare gli effetti del FEMI sullo sviluppo del tratto intestinale della prole. Ciò consente lo studio delle cause meccaniche per lo sviluppo di lesioni intestinali a seguito della corioamionite.

Abstract

La corioamionite è un precipitante comune di nascita pretermine ed è associata a molte delle morbilità della prematurità, inclusa l’enterocolite necrotizzante (NEC). Tuttavia, un legame meccanicistico tra queste due condizioni rimane ancora da scoprire. Abbiamo adottato un modello murino di corioamnionite che coinvolge l’esposizione fetale indotta dal lipoppiosaccaride (LPS) all’infiammazione materna (FEMI). Questo modello di FEMI induce una cascata infiammatoria sterile materna, placentare e fetale, che è presente anche in molti casi di corioamionite clinica. Sebbene esistano modelli che utilizzano batteri vivi e imitano più accuratamente la fisiopatologia di un’infezione ascendente con conseguente corioamionite, questi metodi possono causare effetti indiretti sullo sviluppo del tratto intestinale immaturo e del microbioma in via di sviluppo associato. Utilizzando questo protocollo, abbiamo dimostrato che il FEMI indotto dall’LPS si traduce in un aumento dose-dipendente della perdita della gravidanza e della nascita pretermine, nonché in interruzione del normale sviluppo intestinale nella prole. Inoltre, abbiamo dimostrato che il FEMI aumenta significativamente la lesione intestinale e le citochine siere nella prole, riducendo contemporaneamente calice e cellule di Paneth, entrambe forniscono una prima linea di immunità innata contro l’infiammazione intestinale. Sebbene un modello simile di FEMI indotto dall’LPS sia stato utilizzato per modellare l’associazione tra corioamionite e successive anomalie del sistema nervoso centrale, a nostra conoscenza, questo protocollo è il primo a tentare di chiarire un legame meccanicistico tra corioamionite e successive perturbazioni nello sviluppo intestinale come potenziale legame tra corioamninite e NEC.

Introduction

Le membrane corioniche svolgono un ruolo fondamentale nella gravidanza dei mammiferi. Includono il chorion e l’amnion, che servono più funzioni. Circondano e proteggono il feto, facilitano la segnalazione paracrina tra i compartimenti materno e^{fetale 1}e creano anelli di feedback locali all’interno delle membrane corioniche, che possono essere coinvolti nell’avvio della parto¹. La comprensione attuale delle membrane indica che l’amnione fornisce una funzione di barriera strutturale e il corione fornisce un buffer immunologico principalmente per proteggere il feto in via di sviluppo dal sistema immunitario^{materno 2}. L’infiammazione di queste membrane è nota come corioamionite. Storicamente, la diagnosi di corioamionite clinica è stata fatta in seguito alla presenza di febbre materna più uno o più risultati clinici fetali o^{materni 3,4}. Tuttavia, sebbene questa definizione sia clinicamente utile, la sua mancanza di precisione ha reso difficile la ricerca sulla corioamionite. Nel 2015, nel tentativo di chiarire la diagnosi, un workshop del gruppo di esperti dell’Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development ha definito la corioamniionite come infiammazione intrauterina, o infezione, o entrambi (tripla I)³. Questo chiarimento è importante perché mentre l’infezione indotta microbica è una causa importante di infiammazione uterina / amniotica, si verifica meno comunemente dell’infiammazione uterina / amniotica sterile^5,6,7. Nel complesso, la corioamniionite rimane un problema significativo di salute pubblica, come si vede nel 2\u20124% delle consegne a termine e nel 25\u201230% delle consegne pretermine^8,9.

La corioamionite può avere effetti significativi sul feto e sul neonato. È stato ben documentato in letteratura che la corioamionite è associata ad un aumento del rischio di molte delle morbilità della prematurità, tra cui la displasia broncopolmonare^10,la lesione cerebrale della materia bianca^11,l’emorragia intraventricolare^12,la retinopatia della prematurit๳e la sepsi neonatale ad esordio precoce sospetta e confermata^14,15. Poiché siamo interessati a meccanismi di lesione e riparazione del tratto intestinale immaturo, è importante notare che la corioamniionite è anche associata a un successivo sviluppo di enterocolite necrotizzante (NEC)^15,16. Il NEC è una devastante malattia gastrointestinale dei neonati pretermine che si traduce in una risposta dell’ospite disregolata all’infiammazione e alla successiva necrosi^{intestinale 17}. Ogni anno, il NEC colpisce oltre 4000 neonati negli Stati Uniti e fino a un terzo di questi neonati muore a causa della malattia¹⁸. La patogenesi del NEC probabilmente comporta una combinazione di immaturità intestinale, disregolazione del sistema immunitario immaturo, infiammazione intestinale e traslocazione^{batterica 19}, che culmina in un ultimo percorso comune di necrosi intestinale. È importante sottolineare che l’insorgenza del NEC si verifica spesso settimane dopo la nascita e la potenziale esposizione alla corioamionite, rendendo poco chiaro il legame meccanicistico tra corioamniionite e successivo sviluppo del NEC²⁰. Un potenziale meccanismo con cui la corioammintite può contribuire alla fisiopatologia del NEC è attraverso l’upregolazione del sistema immunitario materno, producendo successivamente una forte risposta infiammatoria fetale che può interrompere i normali modelli di sviluppo^{fetale 21,22,23}.

Nei roditori e nelle pecore esistono più modelli di corioamionite di mammiferi^{24,25,26,27,28,29,30,31,32}. Tuttavia, esistono pochi dati relativi allo sviluppo del tratto intestinale oltre il periodo iniziale appena nato a seguito dell’esposizione fetale indotta dalla corioamnite all’infiammazione materna (FEMI). Al fine di esplorare la relazione tra il FEMI e il successivo sviluppo della lesione del tratto intestinale immaturo, abbiamo adattato il modello FEMI indotto dal lipoppiosaccaride (LPS). I lipopatolisaccaridi sono un componente importante della superficie extracellulare sui batteri gram negativi e sono un potente stimolante del sistema immunitario innato di più specie eucariotiche, compresi gli esseri^{umani 33}. L’iniezione materna di LPS si traduce in una cascata infiammatoria sterile senza gli effetti confondenti dei batteri vivi, ed è un modello ben consolidato per l’induzione della nascita pretermine³⁴, così come un modello di corioamionite acuta e la sindrome da risposta infiammatoria fetale (FIRS), che è la forma più grave di corioamniionite^24,35. È stato anche dimostrato che induce lesioni cerebrali di materia bianca e grigia in una pecora modello³⁶ e un murino modello^37,38,39,40. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, siamo i primi a utilizzare questo modello di corioamionite e FEMI per indagare i suoi effetti sullo sviluppo del tratto gastrointestinale dopo la nascita, nonché per indagare un possibile legame meccanicistico tra corioamionite e successivo sviluppo di NEC^41,42.

Protocol

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali dell’Università dell’Iowa (Protocol #8041401). Tutti gli animali sono stati ospitati in un vivarium approvato dall’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) presso l’Università dell’Iowa. Tutti i topi erano ceppo di tipo selvatico C57Bl/6J. 1. Istituzione del FEMI nei topi gravidi Preparazione LPS Utilizzare LPS derivato d…

Representative Results

L’esposizione al FEMI il giorno 15 embrionale porta ad una perdita di gravidanza dose-dipendente e ad un’intensità dose-dipendente di lavoro pretermine (Figura 1)42. Per gli esperimenti, abbiamo scelto di utilizzare una dose LPS di 100 μg /kg per ridurre al minimo la perdita di gravidanza e la prematurità (perdita del 50% sia tra prematurità che per scomparsa fetale intrauterina) esponendo i feti a un significativo insulto infiammatorio. <p class="jove_content…

Discussion

La corioamniionite ha un impatto sul 2\u20124% del termine e sul 25\u201230% delle consegne pretermine^8,9. Tuttavia, l’impatto della corioamionite può estendersi a lungo oltre la nascita in quanto ha dimostrato di avere effetti significativi sul feto e sul neonato^{10,11,12,13,14,}<sup class="…

Materials

10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
Alcian blue stain	Newcomer supply	1003A
C57Bl6/J mice	Jackson Laboratories	664
Ethanol	Decon labs	2701
HCl	Sigma	H1758
Hematoxylin stain	Leica	381562
LPS	Sigma	L2880
NaHCO3	Sigma	S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope	Nikon	2CE-MQVJ-1
Periodic Acid	ACROS	H5106	CAS# 10450-59-9
RNAlater	Thermofisher	Am7021
Schiff's reagent	Sigma	S5133
Secor Imager 2400	Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay	Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene	Sigma	534056