Un modelo murino de exposición fetal a la inflamación materna para estudiar los efectos de la coleamnionitis aguda en el desarrollo intestinal neonatal

Summary

Desarrollamos un modelo de coleamnionitis para simular la exposición fetal a la inflamación materna (FEMI) sin complicaciones de organismos vivos para examinar los efectos del FEMI en el desarrollo del tracto intestinal de la descendencia. Esto permite el estudio de causas mecanicistas para el desarrollo de lesiones intestinales después de la coleamnionitis.

Abstract

La colemonionitis es un precipitante común del parto prematuro y se asocia con muchas de las morbilidades de la prematuridad, incluida la enterocolitis necrosante (NEC). Sin embargo, aún no se ha descubierto un vínculo mecanicista entre estas dos condiciones. Hemos adoptado un modelo murino de colemonionitis que implica lipopolisacáridos (LPS) de exposición fetal inducida a la inflamación materna (FEMI). Este modelo de FEMI induce una cascada inflamatoria materna, placentaria y fetal estéril, que también está presente en muchos casos de colemonionitis clínica. Aunque existen modelos que utilizan bacterias vivas e imitan con mayor precisión la fisiopatología de una infección ascendente que resulta en corioamnionitis, estos métodos pueden causar efectos indirectos en el desarrollo del tracto intestinal inmaduro y el microbioma en desarrollo asociado. Utilizando este protocolo, hemos demostrado que el FEMI inducido por LPS resulta en un aumento dependiente de la dosis en la pérdida del embarazo y el parto prematuro, así como la interrupción del desarrollo intestinal normal en la descendencia. Además, hemos demostrado que el FEMI aumenta significativamente las lesiones intestinales y las citoquinas séricas en la descendencia, al tiempo que disminuyen las células de copa y paneth, que proporcionan una primera línea de inmunidad innata contra la inflamación intestinal. Aunque se ha utilizado un modelo similar de FEMI inducido por LPS para modelar la asociación entre la coleamnionitis y las anomalías posteriores del sistema nervioso central, hasta donde sabemos, este protocolo es el primero en intentar dilucidar un vínculo mecanicista entre la coleamnionitis y perturbaciones posteriores en el desarrollo intestinal como posible vínculo entre la corioamnionitis y el NEC.

Introduction

Las membranas corionicas desempeñan un papel integral en el embarazo de mamíferos. Incluyen el coro y la amnion, que cumplen múltiples funciones. Rodean y protegen el feto, facilitan la señalización paracrina entre los compartimentos materno-fetal¹y crean bucles de retroalimentación locales dentro de las membranas corionicas, que pueden estar involucrados en el inicio de la parturición^1. La comprensión actual de las membranas indica que la amnion proporciona una función de barrera estructural, y la coral proporciona un amortiguador inmunológico principalmente para proteger al feto en desarrollo del sistema inmunitario materno^2. Inflamación de estas membranas se conoce como colemonionitis. Históricamente, el diagnóstico de colemonionitis clínica se realizó a raíz de la presencia de fiebre materna más uno o más hallazgos clínicos fetales o maternos^3,4. Sin embargo, si bien esta definición es clínicamente útil, su falta de precisión ha hecho que la investigación de la colemonionitis sea un desafío. En 2015, en un intento de aclarar el diagnóstico, un taller de panel de expertos del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver definió la colemonionitis como inflamación intrauterina, o infección, o ambas (triple I)^3. Esta aclaración es importante porque si bien la infección inducida por microbianos es una causa importante de inflamación uterina/amniótica, ocurre con menos frecuencia que la inflamación estéril uterina/amniótica^5,6,7. En general, la colemonionitis sigue siendo un problema importante de salud pública, como se observa en 2\u20124% de los partos a término y 25\u201230% de los partos prematuros^8,9.

La colemonionitis puede tener efectos significativos en el feto y el neonato. En la literatura se ha documentado bien que la colemonionitis está asociada con un mayor riesgo de muchas de las morbilidades de la prematuridad, incluyendo displasia broncopulmonar^10,lesión de materia blanca cerebral^11,hemorragia intraventricular^12,retinopatía de prematuridad^13,y sepsis neonatal de inicio temprano sospechosa y confirmada^14,15. Como estamos interesados en los mecanismos de lesiones y reparación del tracto intestinal inmaduro, es importante tener en cuenta que la colemonionitis también se asocia con el desarrollo posterior de enterocolitis necrosante (NEC)^15,16. Nec es una enfermedad gastrointestinal devastadora de los bebés prematuros que resulta en una respuesta disregulada del huésped a la inflamación y la necrosis intestinal posterior¹⁷. Cada año, nec afecta a más de 4000 bebés en los Estados Unidos, y hasta un tercio de estos bebés mueren a causa de la enfermedad^18. La patogénesis de NEC probablemente implica una combinación de inmadurez intestinal, desregulación del sistema inmunitario inmaduro, inflamación intestinal y translocación bacteriana^19,que culmina en una vía común final de necrosis intestinal. Es importante destacar que la aparición de NEC a menudo ocurre semanas después del nacimiento y la exposición potencial a la colemonionitis, haciendo que el vínculo mecanicista entre la colaamnionitis y el desarrollo posterior de NEC no esté claro²⁰. Un mecanismo potencial por el cual la colemonionitis puede contribuir a la fisiopatología de nec es a través de la regulación del sistema inmune materno, produciendo posteriormente una fuerte respuesta inflamatoria fetal que puede interrumpir los patrones normales de desarrollo fetal^21,22,23.

Existen múltiples modelos de corioamnionitis en roedores y ovejas^{24,25,26,27,28,29,30,31,32.} Sin embargo, existen pocos datos sobre el desarrollo del tracto intestinal más allá del período inicial del recién nacido después de la exposición fetal inducida por corioamnionitis a la inflamación materna (FEMI). Con el fin de explorar la relación entre FEMI y el posterior desarrollo de lesiones del tracto intestinal inmaduro, hemos adaptado el modelo FEMI inducido por lipopolisacáridos (LPS). Los lipopolisacáridos son un componente importante de la superficie extracelular sobre bacterias gram negativas y son un potente estimulante del sistema inmune innato de múltiples especies eucariotas, incluidos los seres humanos^33. La inyección de LPS materno da como resultado una cascada inflamatoria estéril sin los efectos confusos de las bacterias vivas, y es un modelo bien establecido para la inducción del nacimiento prematuro^34,así como un modelo de colemonionitis aguda y el síndrome de respuesta inflamatoria fetal (FIRS), que es la forma más grave de colemonionitis^24,35. También se ha demostrado que induce lesiones cerebrales de materia blanca y gris en una oveja modelo³⁶ y una murina modelo^37,38,39,40. Sin embargo, hasta donde sabemos, somos los primeros en utilizar este modelo de coleamnionitis y FEMI para investigar sus efectos en el desarrollo del tracto gastrointestinal más allá del nacimiento, así como para investigar un posible vínculo mecanicista entre la coleamnionitis y el desarrollo posterior de NEC^41,42.

Protocol

Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Iowa (Protocolo #8041401). Todos los animales fueron alojados en un vivarium aprobado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AALAC) en la Universidad de Iowa. Todos los ratones eran cepa de tipo salvaje C57Bl/6J. 1. Establecimiento de FEMI en ratones embarazadas Preparación lps Utilice LPS…

Representative Results

La exposición al FEMI el día embrionario 15 conduce a una pérdida de embarazo dependiente de la dosis y a una tasa de dosis dependiente del trabajo de parto prematuro (Figura 1)42. Para los experimentos, elegimos utilizar una dosis de LPS de 100 μg/kg para minimizar la pérdida del embarazo y la prematuridad (50% de pérdida entre la prematuridad y la muerte fetal intrauterina) mientras exponía a los fetos a un insulto inflamatorio significativo. <p class="jo…

Discussion

La colemonionitis afecta al 2\u20124% del plazo y al 25\u201230% de los partos prematuros^8,9. Sin embargo, el impacto de la coleamnionitis puede extenderse mucho más allá del nacimiento, ya que se ha demostrado que tiene efectos significativos en el feto y neonato^{10,11,12,13,14,}<sup class=…

Materials

10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
Alcian blue stain	Newcomer supply	1003A
C57Bl6/J mice	Jackson Laboratories	664
Ethanol	Decon labs	2701
HCl	Sigma	H1758
Hematoxylin stain	Leica	381562
LPS	Sigma	L2880
NaHCO3	Sigma	S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope	Nikon	2CE-MQVJ-1
Periodic Acid	ACROS	H5106	CAS# 10450-59-9
RNAlater	Thermofisher	Am7021
Schiff's reagent	Sigma	S5133
Secor Imager 2400	Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay	Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene	Sigma	534056