En murinmodell av fostereksponering for maternal betennelse for å studere effekten av akutt chorioamnionitt på nyfødt tarmutvikling

Summary

Vi utviklet en modell av chorioamnionitis for å simulere fostereksponering for mors betennelse (FEMI) uten komplikasjoner av levende organismer for å undersøke effekten av FEMI på utviklingen av avkommets tarmkanal. Dette gjør det mulig å studere mekanistiske årsaker til utvikling av tarmskade etter chorioamnionitis.

Abstract

Chorioamnionitis er en vanlig utfelling av preterm fødsel og er forbundet med mange av morbiditeter av prematuritet, inkludert nekrotiserende enterokolitt (NEC). Imidlertid er det ennå ikke oppdaget en mekanistisk kobling mellom disse to forholdene. Vi har tatt i bruk en murinmodell av chorioamnionitt som involverer lipopolysakkarid (LPS)-indusert fostereksponering for mors betennelse (FEMI). Denne modellen av FEMI induserer en steril mors, placental og fosterinflammatorisk kaskade, som også er tilstede i mange tilfeller av klinisk chorioamnionitis. Selv om modeller eksisterer som bruker levende bakterier og mer nøyaktig etterligner patofysiologien til en stigende infeksjon som resulterer i chorioamnionitis, kan disse metodene forårsake indirekte effekter på utviklingen av den umodne tarmkanalen og tilhørende utviklende mikrobiom. Ved hjelp av denne protokollen har vi vist at LPS-indusert FEMI resulterer i en doseavhengig økning i graviditetstap og preterm fødsel, samt forstyrrelse av normal tarmutvikling hos avkom. Videre har vi vist at FEMI øker tarmskaden og serumcytokiner i avkom betydelig, samtidig som de reduserer beger og Paneth-celler, som begge gir en første linje med medfødt immunitet mot tarmbetennelse. Selv om en lignende modell av LPS-indusert FEMI har blitt brukt til å modellere sammenhengen mellom chorioamnionitis og påfølgende abnormiteter i sentralnervesystemet, til vår kunnskap, er denne protokollen den første til å forsøke å belyse en mekanistisk kobling mellom chorioamnionitis og senere perturbasjoner i tarmutvikling som en potensiell kobling mellom chorioamnionitis og NEC.

Introduction

De chorioniske membranene spiller en integrert rolle i pattedyr graviditet. De inkluderer kor og amnion, som tjener flere funksjoner. De omgir og beskytter fosteret, letter parakrinesignalering mellom mors og fosterrom¹, og skaper lokale tilbakemeldingsløkker i de chorioniske membranene, som kan være involvert i å initiere parturition¹. Nåværende forståelse av membranene indikerer at fosteret gir strukturell barrierefunksjon, og koreksjonen gir en immunologisk buffer primært for å beskytte det utviklende fosteret fra mors immunsystem². Betennelse i disse membranene er kjent som chorioamnionitis. Historisk ble diagnosen klinisk chorioamnionitis gjort etter tilstedeværelsen av mors feber pluss ett eller flere foster- eller mors kliniske funn^3,4. Men selv om denne definisjonen er klinisk nyttig, har mangelen på presisjon gjort chorioamnionitis forskning utfordrende. I 2015, i et forsøk på å avklare diagnosen, definerte et ekspertpanelverksted av Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development chorioamnionitis som intrauterin betennelse, eller infeksjon, eller begge (trippel I)³. Denne avklaringen er viktig fordi selv om mikrobiell indusert infeksjon er en viktig årsak til livmor/fosterbetennelse, forekommer den sjeldnere enn steril livmor/fosterbetennelse^5,6,7. Totalt sett er chorioamnionitis fortsatt et betydelig folkehelseproblem, som det ses i 2 \ u20124% av terminleveranser og 25 \ u201230% av premature leveranser^8,9.

Chorioamnionitis kan ha betydelige effekter på fosteret og neonatet. Det har blitt godt dokumentert i litteraturen at chorioamnionitis er forbundet med økt risiko for mange av sykelighetene i prematuritet, inkludert bronkopulmonal dysplasi¹⁰, cerebral hvit materieskade¹¹, intraventricular blødning¹², retinopati av prematuritet¹³, og både mistenkt og bekreftet tidlig start neonatal sepsis^14,15. Som vi er interessert i skade- og reparasjonsmekanismer i den umodne tarmkanalen, er det viktig å merke seg at chorioamnionitis også er forbundet med senere utvikling av nekrotiserende enterokolitt (NEC)^15,16. NEC er en ødeleggende gastrointestinal sykdom hos premature spedbarn som resulterer i en dysregulert vertsrespons på betennelse og påfølgende intestinal nekrose¹⁷. Hvert år påvirker NEC over 4000 spedbarn i USA, og opptil en tredjedel av disse spedbarnene dør av sykdommen¹⁸. Patogenesen av NEC innebærer sannsynligvis en kombinasjon av intestinal umodenhet, dysregulering av det umodne immunsystemet, tarmbetennelse og bakteriell translokasjon¹⁹, som kulminerer i en endelig felles vei for tarmnekrose. Det er viktig at utbruddet av NEC ofte oppstår uker etter fødselen og potensiell eksponering for chorioamnionitis, noe som gjør den mekanistiske koblingen mellom chorioamnionitis og påfølgende utvikling av NEC uklar²⁰. En potensiell mekanisme som chorioamnionitis kan bidra til patofysiologien til NEC er gjennom oppregulering av mors immunsystem, og produserer deretter en sterk fosterinflammatorisk respons som kan forstyrre normale fosterutviklingsmønstre^21,22,23.

Flere pattedyrmodeller av chorioamnionitis finnes hos gnagere og sauer^{24,25,26,27,28,29,30,31,32}. Det finnes imidlertid få data om utviklingen av tarmkanalen utover den første nyfødte perioden etter chorioamnionitis-indusert fostereksponering for mors betennelse (FEMI). For å utforske forholdet mellom FEMI og påfølgende utvikling av skade i den umodne tarmkanalen, har vi tilpasset den lipopolysakkarid (LPS)-induserte FEMI-modellen. Lipopolysakkarider er en viktig del av den ekstracellulære overflaten på gram negative bakterier og er et potent stimulerende middel i det medfødte immunsystemet til flere eukaryote arter, inkludert mennesker³³. Maternal LPS injeksjon resulterer i en steril inflammatorisk kaskade uten forvirrende effekter av levende bakterier, og det er en veletablert modell for induksjon av preterm fødsel³⁴, samt en modell av akutt chorioamnionitis og fosteret inflammatorisk respons syndrom (FIRS), som er den mest alvorlige formen for chorioamnionitis^24,35. Det har også vist seg å indusere både cerebral hvit og grå materie skade i en sauemodell³⁶ og en murine modell^37,38,39,40. Men så vidt vi vet, er vi de første til å bruke denne modellen av chorioamnionitis og FEMI for å undersøke dens effekter på utviklingen av mage-tarmkanalen forbi fødselen, samt å undersøke en mulig mekanistisk sammenheng mellom chorioamnionitis og senere utvikling av NEC^41,42.

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble godkjent av University of Iowa Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol #8041401). Alle dyrene ble plassert i en forening for vurdering og akkreditering av laboratorie dyrepleie (AALAC) godkjent vivarium ved Universitetet i Iowa. Alle mus var vill type stamme C57Bl /6J. 1. Etablering av FEMI hos gravide mus LPS-forberedelse Bruk LPS avledet fra Escherichia coli O55:B5 (lagerkonsentrasjon 2 mg/ml). Fortynn LPS-lagerkonse…

Representative Results

Eksponering for FEMI på embryonal dag 15 fører til et doseavhengig tap av graviditet og en doseavhengig grad av preterm labor (Figur 1)42. For forsøkene valgte vi å bruke en LPS-dose på 100 μg/kg for å minimere graviditetstap og prematuritet (50% tap mellom både prematuritet og intrauterin fosterdemping) mens vi utsatte fostrene for en betydelig inflammatorisk fornærmelse. Ved hjelp av denne tilnærmingen undersøkte vi deretter ef…

Discussion

Chorioamnionitis påvirker 2\u20124% av perioden og 25\u201230% av premature leveranser^8,9. Imidlertid kan virkningen av chorioamnionitis strekke seg lenge etter fødselen, da det har vist seg å ha betydelige effekter på fosteret og neonat^{10,11,12,13,14,15,</su…}

Materials

10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
Alcian blue stain	Newcomer supply	1003A
C57Bl6/J mice	Jackson Laboratories	664
Ethanol	Decon labs	2701
HCl	Sigma	H1758
Hematoxylin stain	Leica	381562
LPS	Sigma	L2880
NaHCO3	Sigma	S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope	Nikon	2CE-MQVJ-1
Periodic Acid	ACROS	H5106	CAS# 10450-59-9
RNAlater	Thermofisher	Am7021
Schiff's reagent	Sigma	S5133
Secor Imager 2400	Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay	Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene	Sigma	534056