Summary
Этот протокол описывает построение недорогой системы микроинъекций, ее стереотаксическую имплантацию в глубокие мозговые структуры и процедуру временных микроинъекций тетродотоксина у бодрствующих и несдержанных крыс. Цель – выявить участие гипоталамиковых структур в регуляции овуляции путем угнетения их нервной активности.
Abstract
Многие экспериментальные подходы были использованы для изучения роли мозга в регуляции овуляции. Примеры включают поражение и глухоту групп нейронов, которые являются инвазивными методами, которые постоянно ухудшают целостность целевой области. Эти методы сопровождаются побочными эффектами, которые могут повлиять на анализ острых и временных регуляторных механизмов. Стереотаксическая имплантация направляющих банюл, направленная на определенные области мозга, с последующим восстановительным периодом, позволяет исследователям микроинъектировать различные препараты после исчезновения нежелательных эффектов операции. Тетродотоксин был использован для определения роли нескольких областей мозга в различных физиологических процессах, поскольку он временно ингибирует натриезависимые потенциалы действия, тем самым блокируя всю нейронную активность в целевой области. Этот протокол сочетает этот метод со стратегиями оценки эстрального цикла и овуляции, чтобы выявить роль дискретных областей мозга в регуляции овуляции в определенные моменты любой заданной стадии эстрального цикла. Бодрствующие и несдержанные крысы(Rattus norvegicus)использовались, чтобы избежать блокирующих эффектов, которые анестетики и гормоны стресса оказывают на овуляцию. Этот протокол может быть легко адаптирован к другим видам, мишеням мозга и фармакологическим агентам для изучения различных физиологических процессов. Будущие усовершенствования этого метода включают в себя проектирование системы микроинъекции с использованием стеклянных капилляров малого диаметра вместо направляющих канюль. Это уменьшит количество ткани, поврежденной во время имплантации, и уменьшит распространение инфузии лекарств за пределы целевой области.
Introduction
Овуляция - это процесс, при котором один или несколько зрелых ооцитов высвобождаются из яичников один раз в каждый эстральный / менструальный цикл. Поскольку все виды млекопитающих зависят от производства гамет для размножения, понимание механизмов, регулирующих овуляцию, оказывает огромное влияние в областях, начиная от биомедицины, животноводства и содержания исчезающих видов. Овуляция регулируется гипоталамико-гипофизарно-яичниковой осью, которая включает в себя несколько гипоталамиковых и экстрагипоталамиковых областей, гонадотропы в передней гипофизе и клетки теки и гранулезы, которые вместе с ооцитами образуют фолликулы яичников внутри яичников1.
Фолликулы яичников растут, развиваются и в конечном итоге овулируют в ответ на тонизирующую и фазовую секрецию фолликулостимулирующего гормона и лютеинизирующего гормона, двух гонадотропинов, секретируемых гонадотропами. Структура секреции гонадотропина имеет решающее значение для правильного развития фолликулов и овуляции и регулируется гонадотропин-рилизинг-гормоном (ГнРГ)1,2. Этот нейропептид синтезируется нейронами, разбросанными по всему базальному диэнцефалону, а затем секретируется в воротную сосудистую, которая связывает гипоталамус и передний гипофиз. Секреторная активность ГнРГ-нейронов, в свою очередь, модулируется синаптическим входом, возникающим из различных структур мозга. Эти структуры передают информацию о состоянии внешней и внутренней среды организма, включая доступность пищи, длину фотопериода и концентрацию гормонов в крови. В этом смысле они формируют репродуктивную модель каждого вида, и конкретные роли таких структур должны быть определены, чтобы правильно понять механизмы, управляющие овуляцией. В качестве примера было показано, что колебания уровня эстрадиола во время эстрального цикла регулируют секрецию ГнРГ; однако ГнРГ-нейроны не экспрессируют изоформу рецептора эстрадиола, необходимую для обнаружения таких изменений. Две популяции нейронов, экспрессирующих эти рецепторы, расположены в ростральной перивентрикулярной области третьего желудочка и в дугообразном ядре соответственно, и стаблируют синапсы с ГнРГ-нейронами. Есть данные, свидетельствующие о том, что эти нейроны интерпретируют концентрацию эстрадиола, а затем стимулируют активность ГнРГ-нейронов, высвобождая кисспептин, мощный индуктор секрецииГнРГ 3.
Эксперименты с участием термических или химических поражений, а также механической глухоты, позволили исследователям определить вовлечение нескольких структур мозга в регуляцию овуляции4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Эти эксперименты, однако, имеют недостаток в том, что они являются инвазивными и травматичными, требующими нескольких дней восстановления, прежде чем оценивать эффекты лечения, что препятствует анализу острых эффектов лечения. Кроме того, они постоянно воздействуют на целевые участки и нарушают другие физиологические процессы в долгосрочной перспективе. Из-за этих проблем результаты этих экспериментов обычно затемняются гомеостатическими компенсаторными механизмами в организме животного и извлечение точной информации о временной регуляторной динамике, в которой задействована область, довольно сложно.
Микроинъекция препаратов, которые временно нарушают активность нейронов через направляющие канюли, является подходящей альтернативой, которая превосходит недостатки, упомянутые выше. Канюли могут быть помещены в любую область мозга с помощью стереотаксической операции, что позволяет исследователю начать медикаментозное лечение после того, как смешанные эффекты операции исчезнут. Временная микроинъекция препаратов позволяет исследователям проверять гипотезы относительно вклада региона в ту или иную ступень процесса и может быть выполнена у бодрствующих сдерживающих или свободно движущихся животных. Различные препараты, включая местные анестетики, агонисты, антагонисты, обратные агонисты и биологические токсины, такие как тетродотоксин (TTX), могут быть микроинъецированы в интересующее вас время.
TTX является биологическим токсином, синтезируемым бактериями, живущими в организме рыбы фугу, а также других позвоночных и беспозвоночных. TTX подавляет нейронную активность посредством селективной и преходящей блокады натриевых каналов, что приводит к ингибированию натриезависимых потенциалов действия. В присутствии TTX клетки испытывают изменения в фазе деполяризации и, таким образом, не возбудимы, а остаются живыми. Блокирующий эффект TTX объясняется его молекулярным составом: группа гуанидиния способна проходить через внеклеточный аспект натриевого канала, но остальная часть молекулы не может пройти из-за своих размеров, поэтому она застревает и блокирует канал13,14,15,16,17 . Механизм действия ТТХ позволил использовать его в качестве инструмента для изучения нервной системы как in vitro, так и in vivo. Внутримозговая инъекция этого токсина была использована для изучения роли дискретных областей мозга в нескольких процессах, таких как сохранение памяти18,сон и возбуждение19,распознавание места20,пространственная навигация21,злоупотребление наркотиками22,терморегуляция23,развитие шизофрении24,сексуальное поведение25 и регуляция овуляции26 среди прочих. В этом протоколе описано влияние на овуляцию транзиторной инактивации гипоталамического ядра микроинъекцией TTX у бодрствующих и несдержанных крыс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры, касающиеся животных, были одобрены Комитетом по этике Высшего факультета высшего времени Сарагосы, УНАМ. Это учреждение работает в строгом соответствии с мексиканскими правилами обращения с животными, официальной нормой: NOM-062-ZOO-1999, которая согласуется с международными руководящими принципами.
1. Строительство двусторонних канюл
- Извлеките вал из нержавеющей стали из ступицы двух подкожных игл по 23 г с помощью пинцета под давлением, а затем удалите оставшийся клей с помощью лезвия скальпеля.
- Протяни линию на расстояние 15 мм от тупого конца валов тонким перманентным маркером. Используйте режущий пинцет, чтобы удалить скошенные концы.
- Удерживайте сегменты диаметром 15 мм с помощью тонкого гемостата и прижимайте их перпендикулярно с помощью отсечного диска, прикрепленного к вращательному инструменту, до получения 14-миллиметровых сегментов трубки. Этот шаг делается для того, чтобы устранить закупоренный участок валов, создав открытые и тупые концы. Наконец, вставьте иглу 30 G через сегменты, чтобы устранить любую внутреннюю обструкцию.
- Определить расстояние между интересуемыми структурами в левом и правом полушариях мозга с помощью атласа мозга27. Используйте формовочную глину, чтобы прикрепить два 14-миллиметровых сегмента к слайду микроскопа и убедиться, что оба находятся на одном горизонтальном уровне. Наблюдайте через глазной микрометр (10x) и регулируйте сегменты тонким пинцетем до тех пор, пока не будет получено желаемое расстояние.
- Смешайте паяную пасту с 10% соляной кислотой в пропорции 2:1 и добавьте каплю смеси на 2 мм ниже тупого конца сегментов. Припаяйте оба сегмента одной точкой с помощью паяльника и паяльной проволоки диаметром 0,5 мм. Убедитесь, что припой не препятствует просвету сегментов.
- Создайте опору для крепления канюли к стереотаксическому держателю, разрезав 10-миллиметровый сегмент упругой проволоки из нержавеющей стали диаметром 0,3 мм. Используйте формовочную глину, чтобы поместить 2 мм проволоки в контакт с предыдущей точкой припоя, а остальную часть положить выше тупого конца канюль. Припаять проволоку к канюлям.
- Очистите поверхность канюль 70% этанолом, чтобы удалить избыток паяльной пасты. Промывайте внутреннюю часть канюли стерильной водой для удаления металлических частиц. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока под микроскопом не будут обнаружены частицы при 10-кратном увеличении.
2. Конструкция обтураторов и колпачков
- Для сборки обтураторов вырезаны два 16-мм сегмента круглой мягкой проволоки из нержавеющей стали (диаметром 0,35 мм). Держите двустороннюю канюлю с гемостатами, перпендикулярную лабораторной скамье, и вставьте один из этих сегментов в каждую канюлю, пока они не достигнут скамейки. Согните остаток под углом 90°.
- Для колпачков вырежьте два сегмента силиконовой трубки по 2 мм (внутренний диаметр = 0,76 мм) и нанесите каплю силиконового клея на один из концов каждого сегмента. Не позволяйте клею попасть в трубку. Дайте высохнуть не менее 24 часов.
3. Конструкция микроинжекторов
- Повторите шаг 1.1, используя вместо этого подкожные иглы 30 Г для создания валов.
- Протяните линию на 18,5 мм друг от друга от тупого конца валов и удалите остатки скошенных концов режущим пинцетом.
- Повторите шаг 1.1 с одной иглой 23 G для создания адаптеров путем разрезания двух сегментов длиной 6 мм, начиная с тупого конца.
- Удалите закупоренные участки 6-мм сегментов, прижав их перпендикулярно к отсечке до получения двух 4-мм адаптеров. Устраните любые внутренние препятствия.
- Вставьте скошенный конец сегментов 30 G в адаптеры. Посмотрите через стереомикроскоп, чтобы убедиться, что конец обоих сегментов и адаптеров находится на одном уровне. Нанесите цианоакрилатный клей на дистальный сустав ватным тампоном и дайте высохнуть в течение 15 минут.
- Замочите два разъема тефлоновых трубок в 70% этаноле в течение 5 минут, а затем прикрепите их к микроинжекторам через адаптеры. Подождите, пока диаметр соединителей не уменьшится в течение не менее 24 часов, а затем стерилизуйте микроинжектор низкотемпературным методом, чтобы избежать повреждения соединителей (рекомендуется стерилизация окиси этилена).
4. Уход за животными и вагинальные мазки
- Используйте циклические взрослые самки крыс с капюшоном(Rattus norvegicus,штамм CIIZ-V) весом от 230 до 260 граммов. Размещать крыс группами по четыре человека в стандартных полипропиленовых клетках в комнате со светло-темным фотопериодом 14:10. Установите температуру и влажность на уровне 22 ± 2 °C и на уровне 40% соответственно. Обеспечьте питание и воду ad libitum.
- Принимайте вагинальные мазки каждый день с 10:00 до 12:00 ч.
- Стерилизуют модифицированную бактериологическую петлю внутренним диаметром 1 мм с помощью спиртовой лампы и охлаждают ее стерильной водой. Удерживайте крысу надежной хваткой и вводите 5 мм бактериологической петли во влагалище, касаясь его внутренних стенок. Удалите бактериологическую петлю. В случае успеха на кончике будет видно облачное падение. Поместите эту каплю на слайд микроскопа.
- Повторите этот процесс для каждой крысы, стерилизуя и охлаждая петлю между каждым животным.
- После того, как капли высохнут, окрашивают гематоксилин-эозином и наблюдают образцы под микроскопом в 10 раз.
- Определить пропорцию лейкоцитов, эпителиальных ядерных клеток и ороговевшие клетки на каждом мазке и классифицировать его по критериям стадий эстрального цикла, представленным на фиг.1,что согласуется с предыдущей литературой28,29.
5. Стереотаксическая имплантация канюли
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните имплантацию канюли после регулярной асептической стереотаксической хирургии и соблюдения институциональных норм.
- Перед операцией
- Стерилизуйте хирургические инструменты, канюли, хирургические винты, обтураторы, марлевые и деревянные ватные тампоны за 24 часа до операции с помощью парового автоклава. Стерилизуйте наконечники металлических инструментов между последовательными операциями, очищая их 10% перекисью водорода с последующей водой, а затем поместите их в горячий стерилизатор.
- Подготовьте рабочие зоны и стереотаксический инструмент перед удалением животного из домашней комнаты. Подготовьте животное к операции в области, которая расположена как можно дальше от стола для операции, чтобы избежать загрязнения во время процедуры.
- Очистите подготовительные и хирургические участки 70% этанолом с последующим нанесением 10% раствора хлорида в течение десяти минут. Очистите основание, раму и манипуляторы стереотаксического инструмента 70% этанолом и стерилизуйте кончики ушных вкладышей с помощью горячего стерилизатора и охладите их воздухом перед операцией.
- Выполните операцию в специальном лабораторном халате, маске для лица, головном чепце, хирургических рукавах, бахилах и хирургических перчатках. Попросите помощника подготовить животных к операции и проверить их общее состояние во время процедуры.
- Прикрепите канюлю к стереотаксическому держателю. Попросите помощника принести в комнату первое животное, которое будет прооперировано. Выбирайте крыс в диеструсе для операции, так как наблюдения из нашей лаборатории показывают, что эти животные восстанавливают правильные циклы эструса быстрее, чем крысы, оперированные на других стадиях, вероятно, потому, что реакция на стресс изменяется вместе с эстровым циклом.
- Взвесьте животное и индуцировать анестезию 4% изофлураном в 100% кислороде внутри индукционной камеры для крыс, подключенной к испарителю изофлурану. Чтобы избежать стресса для животных, не заправляйте камеру предварительно. Подтвердите хирургическую плоскость анестезии, проверив расширение зрачка и потерю боли, измеренную тестами на защемление хвоста и уха после того, как вы наблюдаете потерю правильного рефлекса.
- Обезболить крысу внутрибрюшинной инъекцией смеси кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг), если испаритель изофлурана отсутствует.
- Выньте крысу из индукционной камеры и используйте носовой конус в подготовительном столе для поддержания эффектов анестезии с 2,5% изофлураном в 100% кислороде. Подстригните волосы кожи головы с помощью кусачек и удалите распущена волосы ворсовым валиком. Вводят предоперационную подкожную дозу 2 мг/кг мелоксикама и 5 мг/кг энрофлоксацина в качестве нестероидного противовоспалительного/анальгетика и антибиотика соответственно.
- Нанесите гипромеллозу искусственных слез на каждый глаз, чтобы избежать высыхания во время операции.
- Установите животное в стереотаксический инструмент над согревающей прокладкой, используя неразорвавные ушные вкладыши и анестезирующее маску. Отрегулируйте зажим для носа, чтобы голова животного была плоской. Выполните хирургический скраб в бритой области, чередуя повидон-йод с мылом и 70% этанола один раз, а затем используя повидон-йод и 70% этанол два раза. Вставьте ректальный термометр, чтобы записать температуру животного во время процедуры, а затем накройте его стерильным хирургическим полем.
- Во время операции
- Используйте скальпель, чтобы сделать разрез 2 см в коже и мышцах в середине выбритой области. Удалите покостница из черепа с помощью ватного тампона, покрытого 2% перекисью водорода, чтобы выявить брегму или лямбду, ориентиры, которые будут использоваться для расчета целевых координат. Высушите череп воздухом для лучшей визуализации ориентира.
- Используйте манипуляторы стереотаксического инструмента, чтобы переместить канюлю в положение непосредственно над выбранным ориентиром. Регистрируйте передне-задние и медиалально-боковые координаты со стереотаксического прибора и используйте их для вычисления координат целевой области согласно атласу мозга27.
- Установите рассчитанные координаты в стереотаксическом инструменте и поместите кончик канюли на поверхность черепа. Зарегистрируйте дорсально-вентральную координату и используйте ее для расчета глубины до целевой области.
- Снимите рычаг манипулятора, открутив его от рамы. Используйте зубной заусенец, прикрепленный к вращательному инструменту со скоростью 15 000 оборотов в минуту, чтобы сделать отметку в месте, где будет выполняться краниотомия. Затем с помощью заусенца сделать три отверстия, образуя равносторонние треугольники вокруг метки. Эти отверстия не должны прокалывать череп. Вставьте хирургические винты в отверстия, убедив, что они плотно размещены.
- Сделайте краниотомию достаточно широкой, чтобы вместить расстояние между целевыми областями в каждом полушарии. Она должна быть как можно меньше в диаметре, но достаточно большой, чтобы позволить опускать канюлю, не касаясь границ черепа, так как это изменит траекторию. Выполняйте краниотомию постепенно, применяя минимально возможное давление. Череп грызуна имеет толщину всего несколько миллиметров, и он имеет решающее значение для сохранения целостности тканей ниже.
- Как только церна будет видна, используйте стерильную иглу 21 г с наконечником, изогнутым под углом 90°, чтобы удалить осколки кости и сделать передне-задний разрез в менинге. Используйте технику Wirtshafter и коллег30, чтобы избежать повреждения верхнего сагиттального синуса, если целевая область расположена близко к средней линии.
- Поместите держатель с канюлью в раму и используйте дорсально-вентральный манипулятор для достижения вентральной координаты. Убедитесь, что игла не касается границ во время спуска и при необходимости увеличьте диаметр краниотомии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы наконечник направляющих канюль был нацелен на область в диапазоне от 0,5 до 2,0 мм над интересуемой областью. Это связано с воспалительной реакцией головного мозга в ответ на введение инородных тел и на разрушение тканей. Это особенно важно, если интересующая область невелика и рабочее расстояние должно быть рассчитано эмпирически заранее.
- Поместите держатель с канюлью в раму и используйте дорсально-вентральный манипулятор для достижения вентральной координаты. Убедитесь, что игла не касается границ во время спуска и при необходимости увеличьте диаметр краниотомии.
- Нанесите зубной цемент, чтобы прикрепить канюлю к черепу и дайте ей высохнуть. Убедитесь, что зубной цемент не покрывает тупой конец канюли, так как это необратимо затруднит ее. Подождите, пока цемент полностью затвердеет.
- Вставьте обтураторы, чтобы избежать дальнейших препятствий и обеспечить проходимость во время исследования. Наденьте силиконовый колпачок, чтобы избежать загрязнения.
- После операции
- Заменить потерянные жидкости внутрибрюшинной инъекцией 1,0 мл стерильного физиологического раствора при физиологической температуре. Поместите животное в клетку восстановления с тепловой поддержкой до тех пор, пока оно не оправится от анестезии. Периодически проверяйте температуру и частоту дыхания/дыхания животного. Эффект изофлурана длится в течение нескольких минут после прерывания газового потока, в то время как эффект кетамина/ксилазина длится в течение 40-50 мин.
- Проводят послеоперационные инъекции антибиотика, обезболивающих и противовоспалительных препаратов (в тех же дозах и путях, которые указывались ранее) в течение 48-72 ч и ежедневно внимательно осматривают животных в течение остальной части эксперимента. Сообщайте о любых признаках боли, стресса или потери веса ветеринарным службам или обученному члену лаборатории. Не выполняйте никаких других манипуляций с крысами в этот период.
- Начните принимать вагинальные мазки после послеоперационного лечения и продолжайте делать это до тех пор, пока животное не покажет три последовательных эстральных цикла по четыре дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хронические яремные катетеры могут быть имплантированы хирургическим путем, что позволяет исследователю взять серийные образцы крови для анализа секреции гормонов, таких как эстрадиол, прогестерон, тестостерон, лютеинизирующий гормон, фолликулостимулирующий гормон и кортикостерон. Мы рекомендуем поставить такой катетер, как только животное оправится от операции на головном мозге, так как это улучшит выживаемость, а также позволит избежать засорения катетера, которое может возникнуть в результате длительного времени восстановления.
6. Обработка тетродотоксинов и приготовление растворов
ВНИМАНИЕ: TTX является одним из самых токсичных известных веществ. Действует на скелетные мышцы и нервную ткань. Интоксикация контактным путем маловероятна, но любая открытая рана является потенциальным путем для инокуляции в организм. Основными проблемами при работе с TTX являются прокол кожи острыми инструментами, которые были в контакте с токсином, и генерация аэрозолей, которые могут достигать рта, глаз и слизистых оболочек. В зависимости от дозы, TTX может быть смертельным при вдыхании, проглатывании или прививке кожей. Это вызовет сильное раздражение глаз. LD50 был протестирован на мышах путем перорального и внутривенного введения, и он составляет 334 мкг / кг и 7,3 мкг / кг соответственно. В настоящее время нет доступного антитоксина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инактивирующим веществом является 1,0% NaOCl с или без 0,25 N NaOH или 10% раствором отбеливателя. Полная инактивация происходит после 30 мин воздействия. TTX не может быть полностью инактивирован любым производным хлорида в концентрации ниже 10%, автоклавированием или сухой тепловой стерилизацией при температуре ниже 500 °F. Все процедуры, связанные с TTX, должны выполняться двумя знающими людьми, одетыми во внутреннюю и внешнюю пары нитриловых перчаток, специальное лабораторное пальто, защитные очки, одноразовую маску для лица, закрытую обувь и брюки во всю длину.
- Приготовление складского раствора
- Поместите прокладку, пропитанную инактивирующим веществом, в вытяжной шкаф, чтобы предотвратить загрязнение в случае разлива. Перед запуском убедитесь, что вытяжной капюшон работает правильно. Подготовьте сосуд с инактивирующим раствором для утилизации наконечников пипетки.
- Повторное суспендирование стерильного ЦИТРАТНОГО лиофилизированного порошка TTX в соответствии с инструкциями производителя путем чрезвычайно тщательного и медленного титрования стерильной искусственной спинномозговой жидкостью, промывая стенки флакона в процессе. Избегайте образования пены и аэрозоля. Следуйте асептической технике, чтобы избежать загрязнения раствора TTX, поскольку он будет введен в мозг живых животных. Используйте шприц с иглой вместо микропипетки, если ваши флаконы TTX имеют внешнюю мембрану для предотвращения образования аэрозолей.
- Аликвотирует стоковый раствор в стерильные микропробирки. Сделайте аликвоты как можно меньше, так как циклы замораживания/оттаивания могут изменить стабильность молекул. Не заполняйте более половины трубок, потому что вода увеличивается в объеме при замораживании, что может привести к открытию крышки и загрязнению трубки и других образцов, хранящихся в контейнере.
- Обеззараживайте внешнюю часть трубок и поверхности, где использовался TTX, инактивирующим веществом. Храните тубы при -20 °C во флаконе внутри вторичного контейнера.
- Разбавление бульонного раствора до рабочей концентрации
- Готовьте свежевыведенные растворы в день их использования, так как разбавленные растворы менее стабильны. Поместите прокладку, пропитанную инактивирующим веществом, в вытяжку и микротрубку поверх нее. Подготовьте сосуд с инактивирующим раствором для утилизации наконечников пипетки.
- Пипетка бульонного раствора на дно стерильной микропробирки и затем добавление расчетного количества искусственной спинномозговой жидкости для достижения концентрации 10 нг/мкл. Как описано для повторной приостановки порошка TTX, выполните чрезвычайно тщательное и медленное титрование, промыв стенки флакона и избегая образования пены и аэрозоля.
- Если образцы, которые были на морозильной камере, будут использоваться для микроинъекции, им должно быть позволено уравновешиваться при комнатной температуре в течение не менее одного часа до эксперимента.
7. Микроинъекция TTX или транспортных растворов в свободно движущихся крыс
- Настройте микроинъекционный насос со скоростью инфузии и общим временем инъекции в соответствии с экспериментом. Рассчитайте эти параметры заранее, учитывая объем, занимаемый целевой структурой, и количество раствора, который будет введен. Для этого эксперимента вводят 200 нЛ раствора со скоростью 50 нЛ в минуту для общего времени инфузии 4 минуты.
- Наполните два 10-мкл шприца Гамильтона стерильной дистиллированной водой, вставьте кусок стерильной тефлоновой трубки в разъем трубки каждого микроинжектора, убедив, что длина трубки не ограничивает движение крысы (трубки могут быть стерилизованы с использованием оксида этилена).
- Поместите над ней прокладку, пропитанную инактивирующим веществом, и квадрат парафиновой пленки 2 см х 2 см. Пипетка достаточного количества TTX для заполнения иглы инжектора и на 1 см трубки над пленкой. Впитайте каплю TTX, осторожно втягивая плунжер. Установите шприцы в микроинжекционном насосе и используйте его элементы управления для манипулирования плунжером до тех пор, пока на кончике каждого микроинжектора не будет видно капли TTX. Выбросьте капли в прокладку, пропитанную инактивирующим веществом.
- Выберите крыс, которые будут микроинъекцией. Используйте только крыс, которые показали не менее трех последовательных циклов после операции. Учитывайте их стадию цикла и время суток. И время, и стадия зависят от конкретной гипотезы, которую вы будете проверять, для этого эксперимента выбрано 14:00 часов проэструса, так как нервные предовуляторные сигналы, управляющие фазовой секрецией ГнРГ, происходят в этот момент. Транспортировать их в помещение, где будет происходить инъекция, внутри их собственных жилых клеток, чтобы избежать стресса.
- Держите крысу крепкой хваткой, снимите с канюли колпачок и обтураторы, вставьте микроинжекторы в направляющие канюли и верните животное в клетку.
- Включите насос и подождите, пока микроинъекция не закончится. Наблюдайте за животным в этот период, чтобы обнаружить возможное отслоение микроинъекторов и избежать скручивания тефлоновых трубок.
- Оставьте микроинъекторы на месте в течение двух дополнительных минут, чтобы избежать рефлюкса раствора. Удалите их, очистите поверхность имплантата антисептическим раствором йодоповидона, избегая его протекания внутрь направляющих канюли. Вставьте стерильные обтураторы, наденьте колпачок и верните животное в комнату колонии. Периодически наблюдайте за животным, чтобы обнаружить любые возможные побочные эффекты препарата.
- Включите насос с теми же параметрами, что и во время микроинъекции, и проверьте правильный поток, чтобы убедиться, что проходимость системы была сохранена во время процедуры.
- Нажмите на плунжер, чтобы вытолкнуть TTX/транспортное средство из микроинжектора до тех пор, пока пузырь воздуха не достигнет кончика иглы. Вспомните TTX в его микропробире. Наполните шприц дистиллированной водой и используйте ее для очистки внутренней части трубок. Выбросьте воду в инактивировающее вещество и повторите этот процесс не менее трех раз. Очистите внешнюю сторону шприцев, трубок и микроинъекторов тканью, пропитанной инактивирующим веществом.
8. Эвтаназия и обработка тканей
- В день прогнозируемой или вагинально подтвержденной течки вводят крысе с внутрибрюшинной передозировкой пентобарбитала натрия (75 мг/кг). Проверьте потерю сознания и введите 200 нЛ 0,5% раствора метиленового синего через направляющие канюли, как описано в шагах 7.1-7.9. Проверьте наличие болевых признаков с помощью теста на защемление носка или хвоста и, если они не обнаружены, обезглавить крысу с помощью гильотины грызунов.
- Используйте ножницы, чтобы открыть брюшную полость и найти яичники. Используйте тонкие ножницы радужной оболочки, чтобы рассекать каждый яичник, разрезая на внутриутробно-трубном соединении с помощью увеличительного стекла. Избегайте повреждения яйцевода, потому что это приведет к потере ооцитов.
- Поместите яичники под стереомикроскоп и используйте лезвие бритвы, чтобы удалить всю жировую ткань, не повредив орган. Удалите яйцевод из каждого яичника, разрезав бритвенным лезвием как можно дальше от области ампулы. Установите каждый яйцевод на разную горку и накройте каплей воды. Храните яичники во флаконе, содержащем раствор Буина.
- Аккуратно высушите яйцеводы абсорбирующим бумажным полотенцем и найдите ампулу под стереомикроскопом. Недоминирующей рукой удерживайте яйцевод на месте, зажав далеко от ампулы иглой 23 Г, затем используйте еще одну иглу 23 г в доминирующей руке, чтобы сделать разрез 1 мм в средней области ампулы. Кучевые-ооцитарные комплексы будут выступать из разреза в виде капли вязкой жидкости(рисунок 2D). Используйте иглу в доминирующей руке, чтобы осторожно и медленно вытащить каплю далеко от яйцевода. Надавите на остаток ампулы, чтобы убедиться, что внутри не осталось ооцитов. Извлеките ооциты из яйцеводов как можно быстрее, так как высыхание яйцевода необратимо задержит ооциты внутри.
- Удалите яйцевод из горки и подождите, пока высохнет капля жидкости, содержащая ооциты. Окрашивают образец гематоксилин-эозином. Используйте монтажную среду для чехлов. Наблюдают под микроскопом (10х) для определения количества ооцитов, выбрасываемых каждым яичком.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жертвоприношение путем сердечной перфузии не выполняется в этом протоколе, поскольку ооциты будут захвачены в яйцеводах и, следовательно, для оценки овуляции потребуются гистологические методы. Если пользователь должен перфьюироваться для анализа других тканей, яичники могут быть удалены первыми, а нисходящие артерии зажаты толстыми гемостатами ниже печени, чтобы избежать утечки фиксатора. - Снимите кожу головы и погруите череп в стеклянную емкость с 10% раствором формалина. Дайте фиксации головки не менее десяти дней перед удалением канюли, чтобы избежать искажения ткани. Чтобы удалить канюлю, используйте ножницы, чтобы отсоединать все мышцы в области черепа, которая ее окружает. Разрезайте между носовой и лобной костями с помощью костных триммеров, а затем удалите затылочную кость. Вставьте кончик триммеров в форамен magnum и начните прорезать сагиттальные гребни, достигающие остатка носовой кости.
- Изолированная область верхней части черепа должна содержать лобную и теменной кости. Удалите имплантированную канюлю, прикрепленную к верхней части черепа, медленно подтягивая ее вверх перпендикулярно голове. Срежьте любую прикрепленную часть мозговых обеззалений тонкими ножницами радужной оболочки, чтобы избежать деформации мозга.
- Сделайте передне-задний разрез на мозговых огнях и отложите их в сторону, чтобы удалить мозг от основания черепа. Вставьте тупой пинцет ниже обонятельных луковиц и осторожно подтягивайте мозг, пока зрительные нервы не будут видны. Перережьте нервы тонкими ножницами радужной оболочки и вытащите мозг. Сохраните мозг в фиксаторном растворе.
- Получите участки мозга толщиной 50 мкм с помощью вибратома, установите их в слайды с поли-L-лизином (0,1% в дистиллированной воде) и окрашивайте с помощью метода Nissl. Наблюдать за слайдами под микроскопом (10х) для определения конечного положения канюль(рисунок 2А-2С)и распространения красителя с помощью атласа мозгакрысы 27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол, описанный выше, был протестирован путем оценки воздействия одного TTX или транспортного средства (искусственная спинномозговая жидкость; ACSF) микроинъекция в одно из двух различных ядер, которые, как известно, участвуют в регуляции овуляции у крыс: супрахиазматическое и дугообразное ядро. Супрахиазматическое ядро было выбрано, поскольку оно содержит центральный циркадный кардиостимулятор у млекопитающих. Он участвует в регуляции циклических событий в виде секреции гонадотропинов. Дугообразное ядро было выбрано, потому что оно содержит популяцию нейронов, которые экспрессируют рецепторы эстрадиола, что стимулирует секрецию ГнРГ в течение большей части эстрального цикла. Микроинъекция проводилась в 14:00 часов стадии проэструса, которая является периодом, известным как «критическое окно» из-за возникновения многих центральных механизмов, регулирующих предовуляторное высвобождение гонадотропинов. После лечения каждый день брали вагинальные мазки и усыпляли крыс в 09:00 часов прогнозируемого дня течки, что совпало с вагинальным мазком, характерным для течки. В качестве дополнительной контрольной группы использовали пять интактных крыс, усыпленных на стадии течки. Доля велосипедных животных после операции и доля овулирующих крыс каждой группы (овулятирующих крыс / n) были рассчитаны и проанализированы с использованием точного вероятностного теста Фишера. Количество выбрасываемых яичников было проанализировано с помощью теста Крускала-Уоллиса, за которым последовал тест Данна. Были проведены соответствующие статистические тесты для обеспечения адекватного размера выборки.
В общей сложности 30 самкам крыс были имплантированы направляющие канюли, нацеленные на одну из двух целевых областей. Как показано на рисунке 3,все животные были циклическими до операции, но только семь из них не показали изменений эстрального цикла после процедуры каннюляции. Двадцать три животных показали преходящие изменения своих циклов, характеризующиеся увеличением количества дней с лейкоцитарными мазками. Такие изменения, вероятно, связаны со стрессом, вызванным операцией и постепенно уменьшаемым. К пятому циклу двадцать восемь крыс считались циклическими, а оставшиеся две были выброшены из эксперимента. Этот результат показывает, что после времени восстановления в четыре эстровых цикла (16 дней) большинство канюлированных животных пригодны для дальнейших экспериментов.
На рисунках 4A и 4B показан процент овулирующих животных и количество выбрасываемых ове, соответственно, интактными животными и группами, получавшими ЛИБО ACSF, либо TTX в супрахиазматическое ядро. Все неповрежденные крысы овулировали, и то же самое было верно для группы ACSF. Однако ни одно из животных, микроинъекцировав с TTX, не овулировало. Система впрыска автомобиля не изменила количество ова-сараев. Однако было бы интересно оценить жизнеспособность и качество высвобождающихся ооцитов. Аналогичные результаты можно наблюдать на рисунке 4C и рисунке 4D для крыс, микроинъекции в дугообразное ядро. В обоих случаях этот метод доказал участие дискретной области мозга в регуляции овуляции в критическом окне стадии проэструса, что было впервые выведено из исследований поражения, но не подтверждено. Эффекты микроинъекции TTX, по-видимому, преходящи, а не постоянны, поскольку предыдущий эксперимент показал, что крысы, введенные в супрахиазматическое ядро за пределами «критического окна», овулировали в ожидаемый день течки26. Тем не менее, включение контрольных групп, в которых животные приносятся в жертву в течение 24 часов или до достижения четкого вагинального мазка течки, также рекомендуется для решения этого вопроса.
Результаты на рисунке 5A-B представляют овуляторный исход животных, которых лечили ACSF или TTX. Однако, как было установлено после гистологического подтверждения, их канюли находились за пределами предполагаемой области. Большинство из этих канюл были помещены в переднюю комиссуру или ретрохиазматическую область, две области, которые не способствуют регуляции овуляции. Обе эти структуры вместе с супрахиазматическим и дугообразным ядром находятся очень близко от третьего желудочка, учитывая это, блокада овуляции ожидается у всех животных, если препарат просочится в желудочек. Тот факт, что микроинъекция TTX вне мишеней не смогла блокировать овуляцию, предполагает, что объем TTX, введенного с выбранной скоростью, не просачивался в желудочек, что выявляло специфические для региона эффекты TTX. В поддержку этой идеи гистологический анализ срезов мозга показал только окрашенные нейроны возле кончика направляющих канюли. Однако мы должны уточнить, что прямая оценка распространения препарата не проводилась, и, следовательно, этот вывод должен быть дополнительно рассмотрен.
Рисунок 1: Вагинальные мазки, представляющие каждую стадию эстрального цикла крысы. Течка(А)характеризуется наличием эпителиальных ороговенных клеток без ядра, которое может быть найдено либо самостоятельно образующимся кумулированным в результате эпителиального десквамации. В метеструсе(B)некоторые из этих ороговевших клеток все еще могут присутствовать, но их превосходят лейкоциты, которые также являются преобладающим типом клеток у Diestrus(C). Пробы Proestrus(D)характеризуются вязкой консистенцией и преобладанием эпителиальных ядер клеток. Шкала в каждой панели представляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Гистологическое исследование образцов после эвтаназии. Корональные срезы мозга в дугообразном ядре (ARC) и срединной области возмещения (EM) интактной крысы(A),двусторонне канюлированной крысы(B)и крысы с неуместной канюлью(C). Звездочки указывают на область, где были расположены кончик направляющих канюль, в B - на кончиках, где на базальном краю вентромедиального ядра (VMH), позволяя выступающим инжекторам достигать верхнего края ДУГИ. В С одна канюля располагалась внутри третьего желудочка (3В), что приводило к нелокализованной желудочковой микроинъекции. Это распространенная ошибка, когда цель находится близко к средней линии и данные от этих животных должны быть отброшены. При правильном выполнении экстракция ооцитов должна привести к одной капле вязкой жидкости, содержащей все ооциты из исследуемого яйцевода, как показано на панели(D). Шкала на каждой панели представляет 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Кумулятивный процент велосипедных животных до и после имплантации канюли (***p≤0,0001; **p = 0,0003 по сравнению с циклом до операции, точный вероятностный тест Фишера). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Процент овуляционных животных и медиана с межквартильным диапазоном (полосы погрешностей) числа выбрасываемых животными микроинъекции в целевую структуру No1 (супрахиазматическое ядро, А-В) или No2 (дугообразное ядро, С-D) с искусственной спинномозговой жидкостью (ОКСФ) или тетродотоксином (ТТХ) в 14:00 стадии проэструса. Неповрежденная группа была добавлена к каждому графику для целей сравнения, а число внутри полос представляет собой долю овулирующих самок (***p≤0,01 против групп Intact и ACSF, точный вероятностный тест Фишера и тест Крускала-Уоллиса, соответственно). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Процент овулирующих животных (А) и медиана с межквартильным диапазоном (полосы погрешности) от числа овасшедших (В) животных, чьи канюли были определены как наступающие за пределами целевых районов. Эти животные были микроинъекированы с искусственной спинномозговой жидкостью (ACSF) или тетродотоксином (TTX) в 14:00 проэструса. Неповрежденная группа была добавлена к каждому графику для целей сравнения, а число внутри полос представляет собой долю овулирующих самок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье описывается метод временной инактивации в любой момент времени дискретной области в мозге бодрствующих и неограниченных крыс. Также предусмотрен простой метод отслеживания их эструционного цикла и оценки овуляции. Этот протокол позволяет провести простой анализ вклада конкретных областей мозга в механизмы, которые управляют овуляцией, путем сравнения овуляторного исхода животных, получавших TTX, с результатом овуляции животных, получавших TTX. За исключением стереотаксического прибора и микроинъекционных насосов, которые распространены в лабораториях нейробиологии, этот метод не требует дорогостоящих материалов. Коммерческие канюли и микроинжекторы являются обычным выбором для такого рода экспериментов, но простая в сборке система, описанная здесь, снижает затраты, а результаты неразличимы. Используя этот протокол и материалы, перечисленные в таблице, которая сопровождает эту статью, можно изготовить в десять раз больше канюл, потратив ту же сумму денег, что и коммерческий набор для десяти животных. Строительство десяти двусторонних канюли, независимо от настройки, необходимой для исследования, может быть выполнено за несколько часов. Кроме того, все компоненты можно повторно и использования, что повышает экономическую эффективность.
Наряду с соотношением выгоды и затрат, этот протокол подходит для любой лабораторной среды, поскольку он может выполняться любым персоналом, включая студентов, со знанием манипуляций с грызунами, стереотаксической хирургии и обращения с биологическими токсинами и связанными с ними отходами. Кроме того, он может быть адаптирован для использования у любых видов грызунов и других мелких млекопитающих, включая кроликов, хорьков, игрунков и даже у немемкопитающих видов, таких как птицы и рептилии. Помимо характеристик, отмеченных выше, основным преимуществом данного протокола является то, что он может быть легко адаптирован для изучения других процессов под регуляцию головного мозга, таких как деятельность периферических органов, гомеостатическая реакция на вызовы окружающей среды и различное поведение.
Существует несколько критических шагов, которые необходимо выполнить перед началом эксперимента, чтобы достичь желаемых результатов. Во-первых, координаты целевой структуры должны быть рассчитаны эмпирически, поскольку те, которые сообщаются в атласах мозга, не обязательно будут совпадать с животными, назначенными для исследования в результате их штамма, пола или возраста. Несколько исследований показали, что имплантированные электроды и инфузионные зонды изменяют функцию поврежденной зоны не только разрушением нервных тел и волокон, но и активацией глиальных клеток. Воспалительная реакция, которая инициируется сразу после имплантации, обычно вызывает инкапсуляцию инородного тела глиальными клетками. Эти клетки образуют плотную оболочку, которая препятствует потоку нейротрансмиттеров и смещает нейроны, инициируя процесс нейродегенерации31. Вредных последствий процедуры имплантации не избежать, и следует позаботиться о том, чтобы такие эффекты происходили как можно дальше от интересующих областей мозга. Координаты должны быть рассчитаны для размещения направляющих канюли в целевой зоне только в том случае, если она достаточно велика, чтобы гарантировать, что не более 10% площади будет повреждено канюлой. Такой подход полезен, например, если будут изучаться большие участки коры. Даже в этом случае необходимо провести детальный анализ контрольной группы, чтобы учесть влияние имплантата на интересуемый процесс. Для небольших структур, таких как дискретные ядра гипоталамуса, мы советуем исследователям рассчитать координаты для размещения направляющих канюль на расстоянии от 0,5 до 2 мм от верхней границы целевой структуры в средней области в передне-задней и медиалально-латеральной плоскостях согласно атласу мозга(рисунок 2B). Для такого подхода инжекторы должны быть спроектированы так, чтобы выступать достаточно, чтобы достичь границы мишени. Мы проверили это для двух ядер, описанных в этом протоколе, и обнаружили, что эти крысы восстановили свой эстровый цикл и способность овулировать быстрее, чем животные с канюлями, имплантированными внутрь мишеней.
Растворимость фармакологических средств, вводимых в инъекцию, следует учитывать таким образом, чтобы раствор носителя был максимально похож на раствор спинномозговой жидкости. TTX можно приобрести в виде лиофилизированного порошка, либо отдельно, либо с цитратом. Первый имеет низкую растворимость в воде, и для его восстановления рекомендуется кислотный буфер с рН около 5,0, но это может привести к возможности повреждения ткани в результате инъекций только транспортного средства. С другой стороны, TTX-цитрат может быть растворен в воде или 0,9% физиологическом растворе, которые обычно используются в качестве транспортных средств. Мы рекомендуем не использовать оба этих носителя и предлагаем вместо этого использовать искусственную спинномозговую жидкость или раствор лактата Рингера. Предыдущее исследование показало, что физиологический раствор, микроинжекционированный в супрахиазматическое ядро, оказывает пагубное воздействие на овуляцию при выполнении при течке или диеструсе26. В нескольких статьях сообщалось, что перфузия нервной ткани растворами, которые не соответствуют физико-химическим характеристикам спинномозговой жидкости, изменяет анатомию и физиологию нейронов и способствует воспалительным реакциям и гибели клеток32,33,34,35. Учитывая эти результаты, использование искусственной спинномозговой жидкости в качестве носителя настоятельно рекомендуется во всех экспериментах, связанных с микроинъекцией лекарств в мозг.
Прежде чем начать эксперименты, исследователи должны эмпирически определить оптимальный объем раствора для инъекции, поскольку как утечка в соседние структуры, так и недостаточный охват могут сбить с толку интерпретацию результатов. Это может быть достигнуто путем микроинъектирования водорастворимого красителя в прозрачные агаровые или желатиновые кубики. Затем дисперсия красителя может быть оценена и сравнена с ожидаемым размером мишени, как сообщается в атласе мозга. Тем не менее, свойства интересующей области мозга, такие как плотность ее клеток и наличие волоконных трактов или желудочковых границ, будут влиять на динамику диффузии, и результаты могут отличаться от тех, которые содержатся в агаре и желатине. Соответственно, исследователь должен затем проверить параметры, полученные in vitro в целевой области нескольких животных. Несколько красителей были успешно использованы для внутримозговой микроинъекции у крыс с целью очерчить диффузию заданного объема раствора. Наиболее распространенными примерами являются крезиловый фиолетовый, тиониновый синий, метиленовый синий, синий Эвана, быстрый зеленый и индийские чернила. Эти красители растворяют в дистиллированной воде в концентрации 0,5% или ниже. Преимущество синевого эвана в том, что он обнаруживается в флуоресцентном микроскопе (возбуждение при 620 нм и излучение при 680 нм), что позволяет проводить более количественный анализ распространения. Латексные микрошрухи также могут подойти для этого подхода. Важно отметить, что объемы, превышающие 2,0 мкл, не должны вводиться в мозг с помощью этой техники, поскольку механическое повреждение и смещение тканейпроизойдет 36.
Скорость потока раствора также является важным фактором для контроля, так как микроинъекция больших объемов на высокой скорости вызывает смещение тканей и механические поражения40. Кроме того, высокая скорость инфузии также увеличивает распространение препарата, в результате чего инактивация соседних структур. Трехкратное увеличение площади, покрытой раствором, может быть вызвано изменением скорости инфузии со 100 нЛ/5 минут до 100 нЛ/1 минута36. Гистологические наблюдения мозга крыс, которым вводили метиленовый синий, показывают, что скорость инфузии 50 нл/мин не смещает ткань при стягивании препарата в целевую область (личные наблюдения). Это было протестировано только с объемами, равными или ниже 200 нЛ, и, следовательно, исследователи должны провести пилотные эксперименты, если будут использоваться большие объемы.
После того, как рабочий объем определен, также рекомендуется оценить распространение на каждом животном. Это можно сделать, либо путем совместного введения красителя с препаратами, либо путем инъекции его за несколько минут до эвтаназии, как описано в этом протоколе. Первая модель позволяет красителю распространяться вместе с токсином, обеспечивая тем самым более точную оценку пораженной области. Недостатком этого метода является то, что краситель может мешать активности препарата, а также может быть цитотоксичным. Наконец, клиренс из нервной ткани может возникнуть, если животному необходимо выжить в течение нескольких дней после процедуры инъекции, что повлияет на оценку распространения. Если этот подход будет использоваться, влияние красителя на исследуемый процесс должно быть рассмотрено путем сравнения результатов группы транспортное средство + краситель с результатами группы интактных животных. Если инъекция красителя произойдет до эвтаназии, рекомендуется делать это по тем же параметрам, что и во время микроинъекции (скорость инфузии и объем). Это должно быть выполнено по крайней мере за 10 минут до эвтаназии, чтобы обеспечить распространение раствора. С помощью этого метода было установлено, что 200 нл раствора TTX/метиленового синего покрывает сферу диаметром 0,6 мм и дисперсия существенно не изменяется, если микроинъекция происходит за 1 час до жертвоприношения (личное наблюдение). Это согласуется с исследованием Фройнда и его коллег37,а также Журавина и Буреса38,которые обнаружили, что 1 мкл раствора TTX распространяется в сферическом объеме диаметром около 3 мм. В целом, было показано, что дисперсия препарата зависит от его молекулярной массы и объема вводимогопрепарата, 39, а результаты, указанные выше, соответствуют диффузии красителей с молекулярной массой, аналогичной таковой у TTX. Если необходим более точный контроль дисперсии, инъекция радиомаркированного TTX или осуществление иммуногистохимии против обычного TTX с коммерчески доступными антителами может быть выполнена37. Помимо лучшего разграничения области, охватываемой препаратом, эти два подхода ограничены очисткой TTX от ткани, что необходимо учитывать, если животное выживет через несколько дней после микроинъекции, с другой стороны, работа и утилизация радиоактивного материала приведут к новым шагам и вопросам безопасности, которые не могут быть совместимы со всеми лабораториями и протоколами.
Рекомендуется включение контрольной группы, состоящей из животных, вводимых в область мозга, не имея роли в регуляции изучаемого процесса. Эта группа поможет исследователю определить специфичность целевой области в регуляции этого процесса и отбросит возможность того, что препараты, вводимые в любую структуру, могут вызвать блокирующий сигнал, основанный на более распространенном механизме, таком как активация напряжения или иммунной оси. Поскольку даже самые экспериментированные стереотаксические хирурги не могут получить 100% успеха, когда небольшие структуры нацелены, эти эксперименты обычно сопровождаются канюлями, помещенными за пределы желаемой структуры, и, следовательно, эта контрольная группа непреднамеренно достигается. Результаты от животных, у которых канюля была потеряна, являются ценными и не должны быть выброшены; вместо этого необходимо проводить всесторонний анализ с учетом области инъекции и дисперсии препарата. Особый интерес представляют результаты, которые показывают другой эффект (или отсутствие) у животных, вводимых в области, близкие к целям.
Этот протокол имеет ограничения, присущие хроническому размещению канюл. Избежать постоянного разрушения волокон прохода и тел нейронов в траектории канюли не удается. Использование стеклянных капилляров с диаметром наконечника в несколько микрометров является методом выбора для доставки лекарств в головной мозг с минимальным повреждениемткани 41. Эта методология, однако, использовалась в основном в экспериментах, в которых животное анестезировалось и/или голова прикреплялась к стереотаксическому аппарату или другим устройствам держателя. В основном это связано с хрупкостью самого капилляра, что затрудняет его прикрепление к бодрствующем и несдержанному животному. Система, использующая стеклянные капилляры, соединенные с осмотическими насосами, вместо направляющих канюль, показала значительное улучшение количества поврежденной мозговой ткани и глиальной реакции на травму42. В этой системе, однако, инфузия лекарств является хронической, а не временной и, следовательно, не полезна в экспериментах, в которых время инъекции должно точно контролироваться. Система микроинъекции на основе стеклянного капилляра, вставленного в целевую область через ранее имплантированную направляющую канюлю, была описана Акинори и его коллегами43. Эта система позволяет впрыскивать бодрствующее животное в нужное время, но она не очень надежна и животное должно быть ограничено во время процедуры, что может привести к активации реакции на стресс. В этом протоколе последствия повреждения нервной ткани в траектории направляющей канюли можно контролировать путем сравнения интактной и транспортной групп. Здесь был показан схожий овуляторный исход для обеих групп, и был сделан вывод, что пораженная ткань, а также инъекция транспортного средства не мешали овуляции. Исследователи должны провести пилотные исследования, чтобы определить, участвуют ли структуры, расположенные дорсально к их целевой области, которая будет разрушена канюлью, в регуляции изучаемого процесса. Тем не менее, многообещающим будущим направлением для этой работы является разработка системы доставки, которая использует сильные стороны как направляющих канюль, так и стеклянных капилляров.
Еще одним важным соображением для исследователей является время действия TTX. Журавин и Бурес38 показали, что TTX требуется несколько минут, чтобы достичь максимальной блокады нейронной передачи, которая длится около полутора часов, постепенно уменьшаясь в течение нескольких часов. Это делает TTX препаратом выбора, когда требуется длительная инактивация. Если эксперимент требует более быстрой инактивации, можно использовать местные анестетики, такие как лидокаин, поскольку для достижения максимальной блокады требуется всего несколько секунд. Эффекты этого препарата длятся менее 20 минут, обеспечивая более тонкое временное разрешение, чем TTX. Характеристики, изложенные выше, делают TTX хорошим инструментом для исследовательских экспериментов, изучающих наличие нейронных сигналов, которые генерируются в менее четко определенных временных окнах. Лидокаин, с другой стороны, полезен для очертки этого окна44. Недостатком обоих препаратов является то, что они блокируют передачу потенциалов действия в волокнах прохождения, вводя артефакты в интерпретацию данных, поскольку сигнал потенциально может исходить из другой структуры, которая посылает аксональные проекции в область инъекции. В этом случае очень важен тщательный анализ инъекций, которые, как установлено, находятся за пределами целевой области. Например, в этой статье было показано, что инфузия TTX в область, непосредственно перед супрахиазматическим ядром, и в область между ним и дугообразным ядром не блокирует овуляцию. Такие результаты показали, что волокна и клетки в этих областях не участвуют в регуляции овуляции, что было неожиданным из-за наличия реципрокной сети волокон, связывающих супрахиазматическое ядро как с дугообразным ядром, так и с передними областями, содержащими нейроны ГнРГ.
Альтернативой, которая не блокирует передачу по волокнам прохождения в инъецируемой области, является использование двухвалентных катионов, таких как кобальт и магний, которые ингибируют высвобождение нейротрансмиттеров пресинаптическими терминалями. Проблема с этим подходом, однако, заключается в очень коротком времени инактивирующего действия и высокой токсичности44. Другими вариантами предотвращения блокады волокон являются оптогенетический и хемогенетический подходы, оба из которых являются стратегиями манипулирования активностью конкретных нейронных популяций. Селективность приобретается путем трансфекции нейронов вирусными векторами, предназначенными для вставки последовательностей, кодифицированных либо для опсинов, связанных с ионными каналами, либо для модифицированных рецепторов, экспрессируемых под конкретными промоторами. Микроинъекция вектора выполняется у обезболиваемых животных с использованием стеклянных капилляров, вызывая небольшое нарушение окружающих тканей. Имплантация оптических волокон или системная инъекция синтетических наркотиков позволяет очень точно манипулировать целевой популяцией45. Эти методы оказались полезными в исследовании, либо отдельно, либо в сочетании с такими методами, как микроинъекция TTX, представленная в этомпротоколе 46. Тем не менее, несколько аспектов этих методов должны быть рассмотрены для разработки успешных экспериментов, включая проверку специфичности экспрессии, контроль количества трансфективных клеток, оценку токсичности и оценку побочных эффектов световой и химической стимуляции.
Важнейшие компоненты этого протокола включали надлежащее определение стадии эстрального цикла для каждого животного. Для успешного выполнения этой процедуры решающее значение имеет получение качественных образцов эпителия влагалища и правильная интерпретация результатов (советуем следовать рисунку 1). Кроме того, исследователи должны тщательно заполнить систему инъекций, чтобы предотвратить включение пузырьков воздуха, которые могут привести к инъекции неточных объемов лекарств. Также важно следить за животными во время микроинъекции, чтобы они не кусали трубку или иным образом не мешали системе. Наконец, исследователи, слепые к экспериментальным условиям, должны проанализировать исход овуляции, конечное положение канюли и дисперсию раствора в целевой области, чтобы обеспечить непредвзятость интерпретации результатов.
Здесь был описан надежный, экономичный и простой метод анализа вклада дискретных участков мозга в регуляцию овуляции. Эта процедура выполняется у бодрствующих и несдержанных крыс, превосходя вредные эффекты блокады нейротрансмиссии, а также ингибирующие эффекты, которые гормоны стресса, такие как кортизол и кортикостерон, оказывают на секрецию ГнРГ. Этот метод полностью настраиваемый и может быть использован для доставки любого препарата в любую структуру мозга. Кроме того, он может быть легко адаптирован для обычных видов грызунов и негрызунов, используемых в лаборатории. Наконец, этот протокол может быть использован в сочетании с методами количественной оценки таких веществ, как гормоны и метаболиты в крови, оценки экспрессии генов в клетках и тканях, регистрации активности нейронов, а также производительности бодрствующих животных в поведенческих тестах для определения роли конкретных областей мозга в различных поведенческих и физиологических процессах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать относительно этой статьи.
Acknowledgments
Мы благодарны Раймонду Санчесу из Вашингтонского университета за его ценную помощь в редактировании рукописей и M.Sc Джорджине Кортес и M.Sc Синтии Хавьер за их техническую поддержку в стандартизации этой техники. Мы также благодарны членам ветеринарных служб факультета высших исследований Сарагосы: MVZ. Адриана Альтамирано, MVZ. Роман Эрнандес и MVZ. Долорес-Элизабет Гусман за отличное содержание и уход за подопытными животными. Эксперименты, описанные в этом протоколе, были поддержаны номером гранта DGAPA-PAPIIT: IN216015 и номером гранта CONACyT: 236908 Роберто Домингесу. Карлос-Камило Сильва является докторантом Программы доктора в области биомедицины, Национального университета мексики (УНАМ) и поддерживается Советом национального совета по вопросам науки и технологии (номер гранта: 294555).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
References
- Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
- Fink, G. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. Conn, M., Freeman, E. , Springer Science Business Media. New York. 107-133 (2000).
- Herbison, A. E. The Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator. Endocrinology. 159 (11), 3723-3736 (2018).
- Morello, H., Taleisnik, S. Changes of the release of luteinizing hormone (LH) on the day of proestrus after lesions or stimulation of the raphe nuclei in rats. Brain Research. 360 (1-2), 311-317 (1985).
- Slusher, M. A., Critchlow, V. Effect of Midbrain Lesions on Ovulation and Adrenal Response to Stress in Female Rats. Experimental Biology and Medicine. 101 (3), 497-499 (1959).
- Sawyer, C. H., Haun, C. K., Hilliard, J., Radford, H. M., Kanematsu, S. Further Evidence for the Identity of Hypothalamic Areas Controlling Ovulation and Lactation in the Rabbit. Endocrinology. 73 (3), 338-344 (1963).
- Schiavi, R., Jutisz, M., Sakiz, E., Guillemin, R. Stimulation of Ovulation by Purified LH-Releasing Factor (LRF) in Animals Rendered Anovulatory by Hypothalamic Lesion. Experimental Biology and Medicine. 114 (2), 426-429 (1963).
- Bagga, N., Chhina, G. S., Mohan Kumar, V., Singh, B. Cholinergic activation of medial preoptic area by amygdala for ovulation in rat. Physiology & Behavior. 32 (1), 45-48 (1984).
- Barraclough, C. A., Yrarrazaval, S., Hatton, R. A Possible Hypothalamic Site of Action of Progesterone in the Facilitation of Ovulation in the Rat. Endocrinology. 75 (6), 838-845 (1964).
- Critchlow, V. Blockade of ovulation in the rat by mesencephalic lesions 1, 2. Endocrinology. 63 (5), 596-610 (1958).
- Terasawa, E., Wiegand, S. J. Effects of Hypothalamic Deafferentation on Ovulation and Estrous Cyclicity in the Female Guinea Pig. Neuroendocrinology. 26 (4), 229-248 (1978).
- Halász, B., Köves, K., Molnár, J.
- Narahashi, T.
- Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. Tetrodotoxin blockage of sodium conductance increase in lobster giant axons. The Journal of General Physiology. 47 (5), 965-974 (1964).
- Narahashi, T., Deguchi, T., Urakawa, N., Ohkubo, Y. Stabilization and rectification of muscle fiber membrane by tetrodotoxin. American Journal of Physiology-Legacy Content. 198 (5), 934-938 (1960).
- Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiological Reviews. 54 (4), 813-889 (1974).
- Ritchie, J. M., Rogart, R. B. The binding of saxitoxin and tetrodotoxin to excitable tissue. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 79 (1), 1-50 (1977).
- Bermudez-Rattoni, F., Introini-Collison, I. B., McGaugh, J. L. Reversible inactivation of the insular cortex by tetrodotoxin produces retrograde and anterograde amnesia for inhibitory avoidance and spatial learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5379-5382 (1991).
- Tang, X., Yang, L., Liu, X., Sanford, L. D. Influence of Tetrodotoxin Inactivation of the Central Nucleus of the Amygdala on Sleep and Arousal. Sleep. 28 (8), 923-930 (2005).
- Klement, D., Pašt’alková, E., Fenton, A. A. Tetrodotoxin infusions into the dorsal hippocampus block non-locomotor place recognition. Hippocampus. 15 (4), 460-471 (2005).
- Conejo, N. M., Cimadevilla, J. M., González-Pardo, H., Méndez-Couz, M., Arias, J. L. Hippocampal Inactivation with TTX Impairs Long-Term Spatial Memory Retrieval and Modifies Brain Metabolic Activity. PLoS ONE. 8 (5), 64749 (2013).
- Grimm, J., Ronald, E. Dissociation of Primary and Secondary Reward-Relevant Limbic Nuclei in an Animal Model of Relapse. Neuropsychopharmacology. 22 (5), 473-479 (2000).
- Hasegawa, H., et al. Inhibition of the preoptic area and anterior hypothalamus by tetrodotoxin alters thermoregulatory functions in exercising rats. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1458-1462 (2005).
- Meyer, F., Louilot, A. Early Prefrontal Functional Blockade in Rats Results in Schizophrenia-Related Anomalies in Behavior and Dopamine. Neuropsychopharmacology. 37 (10), 2233-2243 (2012).
- Rothfeld, J. M., Harlan, R. E., Shivers, B. D. Reversible disruption of lordosis via midbrain infusions of procaine and tetrodotoxin. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 25 (4), 857-863 (1986).
- Silva, C., Cortés, G. D., Javier, C. Y., Flores, A., Domínguez, R. A neural circadian signal essential for ovulation is generated in the suprachiasmatic nucleus during each stage of the estrous cycle. Experimental Physiology. , (2019).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (7th Ed). , Academic Press. California. (2014).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS ONE. 7 (4), 35538 (2012).
- Wirtshafter, D., Asin, K., Kent, E. W. Simple technique for midline stereotaxic surgery in the rat. Physiology & Behavior. 23 (1), 409-410 (1979).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
- Kazim, S. F., Enam, S. A., Shamim, M. S. Possible detrimental effects of neurosurgical irrigation fluids on neural tissue: An evidence based analysis of various irrigants used in contemporary neurosurgical practice. International Journal of Surgery. 8 (8), 586-590 (2010).
- Miyajima, M., et al. Role of cerebrospinal fluid as perfusate in neuroendoscopic surgery: A basic investigation. Acta Neurochirurgica. 113, 103-107 (2012).
- Mori, K., et al. Potential risk of artificial cerebrospinal fluid solution without magnesium ion for cerebral irrigation and perfusion in neurosurgical practice. Neurologia Medico-Chirurgica. 53 (9), 596-600 (2013).
- Oka, K., Yamamoto, M., Nonaka, T., Tomonaga, M. The significance of artificial cerebrospinal fluid as perfusate and endoneurosurgery. Neurosurgery. 38 (4), (1996).
- James, T. A., Starr, M. S. Effects of the rate and volume of injection on the pharmacological response elicited by intraingral microapplication of drugs in the rat. Journal of Pharmacological Methods. 1 (3), 197-202 (1978).
- Freund, N., Manns, M., Rose, J. A method for the evaluation of intracranial tetrodotoxin injections. Journal of Neuroscience Methods. 186 (1), 25-28 (2010).
- Zhuravin, I. A., Bures, J. Extent of the tetrodotoxin induced blockade examined by pupillary paralysis elicited by intracerebral injection of the drug. Experimental Brain Research. 83 (3), 687-690 (1991).
- Myers, R. Injection of solutions into cerebral tissue: relation between volume and diffusion. Physiology and Behavior. 1 (2), 171-174 (1966).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal of Visualized Experiments. (46), e2082 (2010).
- McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. J Neuroimmunol. 194 (1-2), 27-33 (2008).
- Cunningham, M. G., O'Connor, R. P., Wong, S. E. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of VisualizedExperiments. (13), e716 (2008).
- Akinori, A., Masamichi, S., Hiroshi, T. A new device for microinjection of drugs into the lower brain stem of conscious rats: Studies on site of action of morphine. Journal of Pharmacological Methods. 2 (4), 371-378 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K.
- de Sousa, A. F., et al. Optogenetic reactivation of memory ensembles in the retrosplenial cortex induces systems consolidation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences. 116 (17), 8576-8581 (2019).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
