Unraveling rollen av diskreta områden av råttahjärnan i regleringen av ägglossning genom reversibel inaktivering av tetrodotoxin mikroinjektioner

Summary

Detta protokoll beskriver byggandet av ett lågkostnadsmikroinjektionssystem, dess stereotaxiska implantation i djuphjärnstrukturer och förfarandet för tidsbetonade mikroinjektioner av tetrodotoxin hos vakna och obegränsade råttor. Målet är att avslöja deltagandet av hypotalamus strukturer i regleringen av ägglossning genom att hämma deras neurala aktivitet.

Abstract

Många experimentella metoder har använts för att studera hjärnans roll i regleringen av ägglossning. Exempel inkluderar lesion och deafferentation av neuronala grupper, som båda är invasiva metoder som permanent försämrar målområdets integritet. Dessa metoder åtföljs av sidoeffekter som kan påverka analysen av akuta och tidsmässiga regleringsmekanismer. Stereotaxisk implantation av guide kanyler riktade till specifika hjärnregioner, följt av en återhämtningsperiod, gör det möjligt för forskare att mikroinjektering olika läkemedel efter försvinnandet av de oönskade effekterna av operationen. Tetrodotoxin har använts för att bestämma rollerna för flera hjärnområden i olika fysiologiska processer eftersom det tillfälligt hämmar de natriumberoende åtgärdspotentialerna och därmed blockerar all neural aktivitet i målregionen. Detta protokoll kombinerar denna metod med strategier för bedömning av estrous cykeln och ägglossning för att avslöja rollen av diskreta hjärnregioner i regleringen av ägglossning vid särskilda tidpunkter av ett givet stadium av estrous cykeln. Vakna och ohämmade råttor (Rattus norvegicus) användes för att undvika de blockerande effekterna som bedövningsmedel och stresshormoner utövar på ägglossning. Detta protokoll kan enkelt anpassas till andra arter, hjärnmål och farmakologiska medel för att studera olika fysiologiska processer. Framtida förbättringar av denna metod inkluderar utformningen av ett mikroinjektionssystem med hjälp av glas kapillärer med liten diameter istället för guidekanyler. Detta kommer att minska mängden vävnad som skadas under implantationen och minska spridningen av de infunderade läkemedlen utanför målområdet.

Introduction

Ägglossning är den process genom vilken en eller flera mogna äggceller frigörs från äggstockarna en gång varje estral / menstruationscykel. Eftersom alla däggdjursarter är beroende av produktion av gameter för att odla, har förståelsen av de mekanismer som reglerar ägglossning en enorm inverkan i områden som sträcker sig från biomedicin, boskapsindustrin och underhåll av utrotningshotade arter. Ägglossning regleras av hypotalamus-hypofysen-äggstocksaxeln, som involverar flera hypotalamus och extra-hypotalamus områden, gonadotropes i främre hypofysen och theca och granulosa celler som, tillsammans med äggcellerna, bildar äggstockssäckarna inuti äggstockarna¹.

Äggstockssäckar växer, utvecklas och så småningom ägglossning som svar på tonic och phasic utsöndring av follikelstimulerande hormon och luteinizing hormon, de två gonadotropiner utsöndras av gonadotropes. Mönstret av gonadotropin utsöndring är avgörande för korrekt follikulär utveckling och ägglossning och det regleras av gonadotropin-frigörande hormon (GnRH)^1,2. Denna neuropeptid syntetiseras av nervceller spridda över hela den basala diencephalon och utsöndras sedan till portalvaskulaturen som länkar hypotalamus och den främre hypofysen. Den hemlighetsfulla aktiviteten hos GnRH-neuronerna moduleras i sin tur av synaptiska indata som härrör från olika hjärnstrukturer. Dessa strukturer förmedlar information om tillståndet i organismens yttre och inre miljö, inklusive tillgången på mat, fotoperiodens längd och koncentrationen av hormoner i blodet. I den meningen formar de reproduktionsmönstret för varje art och de specifika rollerna för sådana strukturer måste bestämmas för att korrekt förstå mekanismerna som styr ägglossningen. Som ett exempel har det visat sig att fluktuationerna i estradiolnivåerna under eströtcykeln reglerar utsöndring av GnRH; GnRH-neuroner uttrycker dock inte den estradiolreceptorisoid som behövs för att upptäcka sådana förändringar. Två populationer av nervceller som uttrycker dessa receptorer ligger i rostral periventricular regionen i den tredje ventrikeln och i arcuate kärnan, respektive, och stablish synapser med GnRH-nervceller. Det finns bevis som tyder på att dessa nervceller tolkar koncentrationen av estradiol och sedan stimulerar aktiviteten hos GnRH-neuroner genom att släppa kisspeptin, en potent induktor av GnRH utsöndring³.

Experiment som involverar termiska eller kemiska lesioner, liksom mekanisk deafferentation, tillät forskare att bestämma inblandning av flera hjärnstrukturer i regleringen av ägglossning^{4,5,6,7,8,9,10,11,12} . Dessa experiment har dock nackdelen att vara invasiva och traumatiska, vilket kräver flera dagars återhämtning innan man utvärderar effekterna av behandlingen, vilket påverkar analysen av de akuta effekterna av behandlingen. Dessutom påverkar de permanent de riktade områdena och stör andra fysiologiska processer på lång sikt. På grund av dessa problem skyms resultaten av dessa experiment vanligtvis av de homeostatiska kompensatoriska mekanismerna i djurets kropp och extraherar korrekt information om den tidsmässiga regleringsdynamiken där området är inblandat är ganska svårt.

Mikroinjektion av läkemedel som tillfälligt stör neuroners aktivitet genom guide kanyler är ett lämpligt alternativ som överträffar de nackdelar som nämns ovan. Kanylerna kan placeras i vilken hjärnregion som helst genom en stereotaxisk operation, vilket gör det möjligt för forskaren att starta läkemedelsbehandlingen efter att de förvirrande effekterna av operationen försvinner. Den tidsbestämda mikroinjektionen av läkemedlen gör det möjligt för forskare att testa hypoteser om regionens bidrag till ett visst steg i processen och kan utföras på vakna återhållna eller fritt rörliga djur. En mängd olika läkemedel, inklusive lokalbedövningsmedel, agonister, antagonister, omvända agonister och biologiska toxiner som tetrodotoxin (TTX) kan mikroinjekt injiceras i den region där det är intressant vid specifika tidpunkter.

TTX är ett biologiskt toxin som syntetiseras av bakterier som lever i pufferfishens kropp samt andra ryggradsdjur och ryggradslösa djur. TTX tystar neural aktivitet genom selektiv och övergående blockad av natriumkanaler, vilket resulterar i hämning av natriumberoende åtgärdspotentialer. I närvaro av TTX upplever cellerna en förändring i depolariseringsfasen och är därför inte upphetsande utan förblir levande. Den blockerande effekten av TTX förklaras av dess molekylära sammansättning: en guanidiniumgrupp kan passera genom den extracellulära aspekten av natriumkanalen, men resten av molekylen kan inte passera på grund av dess storlek, så den sitter fast och blockerar kanalen^{13,14,15,16,17} . TTX verkningsmekanism tillät dess användning som ett verktyg för att studera nervsystemet både in vitro och in vivo. Intracerebral injektion av detta toxin har använts för att studera rollen av diskreta hjärnområden i flera processer som minnesretention¹⁸, sömn och upphetsning¹⁹,^{platsigenkänning 20}, rumslig^{navigering 21},^{drogmissbruk 22}, termoregulering²³, utveckling av schizofreni²⁴, sexuellt^{beteende 25} och reglering av ägglossning²⁶ bland annat. I detta protokoll beskriver vi effekterna på ägglossning av övergående inaktivering av hypotalamus atomkärnor av TTX microinjection i vakna och ohämmade råttor.

Protocol

Djurförsök godkändes av Etikkommittén för Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM. Denna institution verkar i strikt överensstämmelse med de mexikanska reglerna för djurhantering, officiell norm: NOM-062-ZOO-1999, som överensstämmer med internationella riktlinjer. 1. Byggande av bilaterala kanyler Extrahera den rostfria axeln från navet på två 23 G hypodermiska nålar med trycktweezers och ta sedan bort eventuellt återstående lim med hjälp av ett skalpellblad.<…

Representative Results

Det protokoll som beskrivs ovan testades genom utvärdering av effekterna av en enda TTX eller ett enda fordon (konstgjord cerebrospinalvätska; ACSF) mikroinjektion i en av två olika kärnor som är kända för att vara involverade i regleringen av ägglossning hos råttan: suprachiasmatic och arcuate kärnan. Den suprachiasmatic kärnan valdes eftersom den innehåller den centrala dygnsrytm pacemakern hos däggdjur. Det är involverat i regleringen av cykliska händelser som utsöndring av gonadotropiner. Arcuate kär…

Discussion

Denna artikel beskriver en metod för att tillfälligt inaktivera, vid varje given tidpunkt, en diskret region i hjärnan hos vakna och obegränsade råttor. En enkel metod för att spåra deras estrous cykel och bedöma ägglossning tillhandahålls också. Detta protokoll möjliggör en enkel analys av specifika hjärnregioners bidrag till de mekanismer som driver ägglossning genom att jämföra ägglossningsresultatet hos TTX-behandlade djur med de fordonsbehandlade. Med undantag för det stereotaxiska instrumentet oc…

Materials

10 μL Hamilton syringes	Hamilton	80314
21 G x 1" stainless steel hypdermic needle	BD	305165
23 G x 1" stainless steel hypdermic needle	BD	305145
30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle	BD	305106
Artificial cerebrospinal fluid	BASi	MD-2400
Bone trimer	Fine Science Tools	16152-12
Burr for micro drill	Fine Science Tools	19007-05
Clipper	Wahl
Cut-off disc	Dremel	SM5010
Cutting tweezers	Truper	17367
Cyanocrylate glue	Kola loka	K-1
Dental cement	Nic Tone
Enrofloxasin	Senosiain
Eosin	Sigma	E4009
Estereoscope	Zeiss
Extra fine Bonn scissors	Fine Science Tools	14084-08
Face mask	Lanceta HG	60036
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11050-10
Hematoxilin	Sigma	H3136
Hemostats	Fine Science Tools	13008-12
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Hydrochloric acid	Sigma	320331
Hypromelose artificial tears	Sophia Labs	8950015
Isoflurane	Pisa Agropecuaria
Meloxicam	Aranda	1183
Microinjection pump	KD Scientific	788380
Monomer	Nic Tone
Mototool	Dremel	3000
Nitrile gloves	Lanceta HG	69028
Non-Rupture Ear Bars	David Kopf Instruments	855
Poly-L lysine	Sigma	P4707
Povidone-iodine	Dermo Dine
Povidone-iodine with soap	Germisin espuma
Pressure tweezers	Truper	17371
Rat anesthesia mask	David Kopf Instruments	Model 906
Saline solution	PISA
Scalpel	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade	Fine Science Tools	10015-00
Sodium pentobarbital	Pisa Agropecuaria
Standard electrode holder	David Kopf Instruments	1770
Stainless steel wire	American Orthodontic	856-612
Stereotaxic apparatus	David Kopf Instruments	Model 900LS
Surgical Sissors	Fine Science Tools	14001-12
Teflon connectors	Basi	MD-1510
Teflon tubing	Basi	MF-5164
Tetrodotoxin	Alomone labs	T-500
Vaporizer	Kent scientific	VetFlo