Desentrañando el papel de las áreas discretas del cerebro de la rata en la regulación de la ovulación a través de la inactivación reversible por microinyecciones de tetrodotoxina
Summary
Este protocolo describe la construcción de un sistema de microinyección de bajo costo, su implantación estereotáxica en estructuras cerebrales profundas y el procedimiento para microinyecciones cronometradas de tetrodotoxina en ratas despiertas y sin restricciones. El objetivo es revelar la participación de las estructuras hipotalámicas en la regulación de la ovulación mediante la inhibición de su actividad neuronal.
Abstract
Se han utilizado muchos enfoques experimentales para estudiar el papel del cerebro en la regulación de la ovulación. Los ejemplos incluyen la lesión y la desaferenciación de grupos neuronales, que son métodos invasivos que perjudican permanentemente la integridad del área objetivo. Estos métodos van acompañados de efectos colaterales que pueden afectar al análisis de los mecanismos reguladores agudos y temporales. La implantación estereotáxica de cánulas guía dirigidas a regiones cerebrales específicas, seguidas de un período de recuperación, permite a los investigadores microinyectar diferentes fármacos tras la desaparición de los efectos no deseados de la cirugía. La tetrodotoxina se ha utilizado para determinar el papel de varias áreas del cerebro en diversos procesos fisiológicos porque inhibe transitoriamente los potenciales de acción dependientes del sodio, bloqueando así toda la actividad neuronal en la región objetivo. Este protocolo combina este método con estrategias para la evaluación del ciclo estral y la ovulación para revelar el papel de las regiones cerebrales discretas en la regulación de la ovulación en momentos particulares de cualquier etapa dada del ciclo estral. Se utilizaron ratas despiertas y desenfrenadas(Rattus norvegicus)para evitar los efectos de bloqueo que los anestésicos y las hormonas del estrés ejercen sobre la ovulación. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a otras especies, dianas cerebrales y agentes farmacológicos para estudiar diferentes procesos fisiológicos. Las mejoras futuras a este método incluyen el diseño de un sistema de microinyección utilizando capilares de vidrio de pequeño diámetro en lugar de cánulas guía. Esto reducirá la cantidad de tejido dañado durante la implantación y disminuirá la propagación de los medicamentos infundidos fuera del área objetivo.
Introduction
La ovulación es el proceso por el cual uno o más ovocitos maduros se liberan de los ovarios una vez cada ciclo estral/menstrual. Como todas las especies de mamíferos dependen de la producción de gametos para reproducirse, la comprensión de los mecanismos que regulan la ovulación tiene un gran impacto en áreas que van desde la biomedicina, la industria ganadera y el mantenimiento de especies en peligro de extinción. La ovulación está regulada por el eje hipotalámico-hipofisario-ovárico, que involucra varias áreas hipotalámicas y extra-hipotalámicas, los gonadotropos en la hipófisis anterior y las células de la teca y la granulosa que, junto con los ovocitos, forman los folículos ováricos dentro de los ovarios1.
Los folículos ováricos crecen, se desarrollan y eventualmente ovulan en respuesta a la secreción tónica y fásica de la hormona estimulante del folículo y la hormona luteinizante, las dos gonadotropinas secretadas por los gonadotropos. El patrón de secreción de gonadotropina es fundamental para el desarrollo folicular adecuado y la ovulación y está regulado por la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH)1,2. Este neuropéptido es sintetizado por neuronas dispersas por todo el diencéfalo basal y luego secretadas a la vasculatura portal que une el hipotálamo y la hipófisis anterior. La actividad secretora de las neuronas GnRH es a su vez modulada por la entrada sináptica que surge de diversas estructuras cerebrales. Estas estructuras transmiten información sobre el estado del entorno externo e interno del organismo, incluida la disponibilidad de alimentos, la duración del fotoperíodo y la concentración de hormonas en la sangre. En este sentido, dan forma al patrón reproductivo de cada especie y se deben determinar los roles específicos de tales estructuras para comprender adecuadamente los mecanismos que gobiernan la ovulación. A título de ejemplo, se ha demostrado que la fluctuación en los niveles de estradiol durante el ciclo estral regula la secreción de GnRH; sin embargo, las neuronas GnRH no expresan la isoforma del receptor de estradiol necesaria para detectar tales cambios. Dos poblaciones de neuronas que expresan estos receptores se localizan en la región periventricular rostral del tercer ventrículo y en el núcleo arqueado, respectivamente, y establecen sinapsis con las neuronas GnRH. Existe evidencia que sugiere que estas neuronas interpretan la concentración de estradiol y luego estimulan la actividad de las neuronas GnRH liberando kisspeptina, un potente inductor de la secreción de GnRH3.
Los experimentos que involucran lesiones térmicas o químicas, así como la deaferenciación mecánica, permitieron a los investigadores determinar la participación de varias estructuras cerebrales en la regulación de la ovulación4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Estos experimentos, sin embargo, tienen la desventaja de ser invasivos y traumáticos, requiriendo varios días de recuperación antes de evaluar los efectos del tratamiento, impidiendo el análisis de los efectos agudos del tratamiento. Además, afectan permanentemente las áreas objetivo e interrumpen otros procesos fisiológicos a largo plazo. Debido a estos problemas, los resultados de estos experimentos suelen estar oscurecidos por los mecanismos compensatorios homeostáticos en el cuerpo del animal y extraer información precisa sobre la dinámica reguladora temporal en la que está involucrada el área es bastante difícil.
La microinyección de fármacos que interrumpen transitoriamente la actividad de las neuronas a través de cánulas guía es una alternativa adecuada que supera las desventajas mencionadas anteriormente. Las cánulas se pueden colocar en cualquier región del cerebro mediante una cirugía estereotáxica, lo que permite al investigador comenzar el tratamiento farmacológico después de que desaparezcan los efectos de confusión de la cirugía. La microinyección cronometrada de los medicamentos permite a los investigadores probar hipótesis sobre la contribución de la región a un paso particular del proceso y se puede realizar en animales despiertos restringidos o en movimiento libre. Una variedad de medicamentos que incluyen anestésicos locales, agonistas, antagonistas, agonistas inversos y toxinas biológicas como la tetrodotoxina (TTX) pueden microinyectarse en la región de interés en momentos específicos.
TTX es una toxina biológica sintetizada por bacterias que viven en el cuerpo del pez globo, así como otros vertebrados e invertebrados. TTX silencia la actividad neuronal a través del bloqueo selectivo y transitorio de los canales de sodio, lo que resulta en la inhibición de los potenciales de acción dependientes del sodio. En presencia de TTX, las células experimentan una alteración en la fase de despolarización y, por lo tanto, no son excitables, sino que permanecen vivas. El efecto de bloqueo de TTX se explica por su composición molecular: un grupo guanidinio es capaz de pasar a través del aspecto extracelular del canal de sodio, pero el resto de la molécula no puede pasar debido a su tamaño, por lo que se atasca y bloquea el canal13,14,15,16,17 . El mecanismo de acción del TTX permitió su uso como herramienta para estudiar el sistema nervioso tanto in vitro como in vivo. La inyección intracerebral de esta toxina se ha utilizado para estudiar el papel de las áreas discretas del cerebro en varios procesos como la retención de la memoria18,el sueño y la excitación19,el reconocimiento delugares 20,la navegación espacial21,el abuso de drogas22,la termorregulación23,el desarrollo de la esquizofrenia24,el comportamiento sexual25 y la regulación de la ovulación26 entre otros. En este protocolo describimos los efectos sobre la ovulación de la inactivación transitoria de núcleos hipotalámicos por microinyección TTX en ratas despiertas y desenfrenadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo describe un método para inactivar transitoriamente, en un momento dado, una región discreta en el cerebro de ratas despiertas y sin restricciones. También se proporciona un método simple para rastrear su ciclo estral y evaluar la ovulación. Este protocolo permite un análisis directo de la contribución de regiones cerebrales específicas a los mecanismos que impulsan la ovulación al comparar el resultado ovulatorio de los animales tratados con TTX con el de los tratados con vehículos. Con la excepc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Raymond Sánchez de la Universidad de Washington por su valiosa ayuda en la edición de manuscritos y a M.Sc. Georgina Cortés y M.Sc. Cintia Javier por su apoyo técnico en la estandarización de esta técnica. También agradecemos a los miembros de los servicios veterinarios de la Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ. Adriana Altamirano, MVZ. Román Hernández y MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán por el excelente mantenimiento y cuidado de animales de experimentación. Los experimentos descritos en este protocolo fueron apoyados por el número de subvención DGAPA-PAPIIT: IN216015 y por el número de subvención CONACyT: 236908 a Roberto Domínguez. Carlos-Camilo Silva es estudiante de doctorado del Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) y cuenta con el apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (número de beca: 294555).
Materials
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
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