테트로독신 미세 주입에 의해 뒤집을 수 있는 불활성화를 통해 배란의 규칙에 있는 쥐 두뇌의 이산 영역의 역할을 해명
Summary
이 프로토콜은 저비용 미세 주입 시스템의 건설, 깊은 뇌 구조로의 입체 이식 및 깨어 있고 억제되지 않은 쥐에서 테트로독신의 시간 제한 된 미세 주입 절차를 설명합니다. 목표는 그들의 신경 활동을 억제 하 여 배란의 규칙에 시상 하 체 구조의 참여를 공개 하는 것입니다.
Abstract
많은 실험적인 접근은 배란의 규칙에 있는 두뇌의 역할을 공부하기 위해 이용되었습니다. 예를 들면 영구적으로 표적 영역의 무결성을 손상시키는 침략적인 방법인 신경 단의 병변 그리고 청각 장애를 포함합니다. 이러한 방법은 급성 및 측두성 규제 메커니즘의 분석에 영향을 줄 수 있는 부수적인 효과를 수반합니다. 특정 뇌 영역을 겨냥한 가이드 카누라의 입체 이식은 회복 기간이 뒤따르며, 연구자들은 수술의 원치 않는 효과가 사라진 후 다른 약물을 마이크로주입할 수 있게 합니다. Tetrodotoxin은 과도하게 나트륨 의존적인 행동 잠재력을 억제하기 때문에 다양한 생리 적 과정에 있는 몇몇 두뇌 영역의 역할을 결정하기 위하여 이용되었습니다, 따라서 표적 지구에 있는 모든 신경 활동을 차단하. 이 프로토콜은 에스트라스트 주기및 배란의 평가를 위한 전략과 이 방법을 결합하여 에스트라스트라스 사이클의 특정 단계에서 배란의 특정 시간에 배란의 조절에 있는 이산 뇌 영역의 역할을 드러냅니다. 깨어 있고 억제되지 않은 쥐(Rattus norvegicus)는마취제와 스트레스 호르몬이 배란에 미치는 차단 효과를 피하기 위해 사용되었습니다. 이 프로토콜은 다른 종, 뇌 표적 및 약리학 제에 쉽게 적응하여 다른 생리 적 과정을 연구 할 수 있습니다. 이 방법의 향후 개선사항은 가이드 캐뉼라 대신 작은 직경의 유리 모세 혈관을 사용하여 미세 주입 시스템의 설계를 포함한다. 이것은 이식 도중 손상된 조직의 양을 감소시키고 표적 지역 외부에 주입된 약의 퍼짐을 감소시다.
Introduction
배란은 하나 이상의 성숙한 난모세포가 모든 estral/생리 주기마다 난소에서 방출되는 과정입니다. 모든 포유류 종은 번식하는 gametes의 생산에 의존하기 때문에 배란을 조절하는 메커니즘에 대한 이해는 생물 의학, 가축 산업 및 멸종 위기에 처한 종의 유지 에 이르기까지 지역에 큰 영향을 미칩니다. 배란은 시상 하 부-뇌 하 수 체-난소 축에 의해 조절, 여러 시상 하 부 및 여분의 시상 소 방 영역을 포함 하는, 전방 뇌 하 수 체및 과립 세포에 염소 로프, 난소 와 함께, 난소 여포를 형성1.
난소 여포성장, 개발 및 결국 모낭 자극 호르몬과 황 체 호르몬의 강장제 및 단계적 분비에 대 한 응답으로 배란, 염소 트로핀에 의해 분 비. 생식선 분비의 패턴은 적절한 여포 발달 및 배란에 중추적인 이며 생식샘도트로핀 방출 호르몬 (GnRH)1,2에의해 조절된다. 이 신경 펩티드는 기저 부신론 전체에 흩어져 뉴런에 의해 합성 된 다음 시상 하부와 전방 뇌하수체를 연결하는 포털 혈관으로 분비됩니다. GnRH-뉴런의 분비 활동은 다양한 뇌 구조에서 발생하는 시냅스 입력에 의해 차례로 변조됩니다. 이러한 구조는 식품의 가용성, 광기간의 길이 및 혈액 내 호르몬의 농도를 포함하는 유기체의 외부 및 내부 환경상태에 대한 정보를 전달한다. 이러한 의미에서, 그(것)들은 각 종의 생식 패턴을 형성하고 그 같은 구조물의 특정 역할은 배란을 지배하는 기계장치를 제대로 이해하기 위하여 결정되어야 합니다. 예를 들어, 에스트라스트사이클 동안 에스트라디올 수준의 변동이 GnRH의 분비를 조절하는 것으로 나타났습니다. 그러나, GnRH-뉴런은 이러한 변화를 검출하는 데 필요한 에스트라디올 수용체 동소형을 발현하지 않는다. 이 수용체를 표현하는 뉴런의 2개의 인구는 제 3 심실의 장영 동맥 영역과 아크추아테 핵에 각각, 그리고 GnRH-뉴런을 가진 stablish 시냅스에 있습니다. 이러한 뉴런이 estradiol의 농도를 해석한 다음 GnRH 분비3의 강력한 인덕터인 키스펩틴을 방출하여 GnRH-뉴런의 활동을 자극한다는 증거가있다.
인체 공학 적 또는 화학 병변뿐만 아니라 기계적 청각 장애인을 포함하는 실험은연구자가 배란4,5,6,7,8,9,10,11,12의 조절에 여러 뇌 구조의 참여를 결정할수있었습니다. . 그러나 이러한 실험은 치료의 효과를 평가하기 전에 며칠간의 회복을 요구하여 치료의 급성 효과 분석을 방해하는 침습적이고 외상적인 단점이 있습니다. 추가적으로, 그(것)들은 영구적으로 표적으로 한 지역에 영향을 미치고 장기적으로 그밖 생리적인 프로세스를 중단합니다. 이러한 문제로 인해, 이러한 실험의 결과는 일반적으로 동물의 신체의 정근성 보상 메커니즘에 의해 가려지고 해당 영역이 관련된 시간적 조절 역학에 대한 정확한 정보를 추출하는 것은 다소 어렵습니다.
가이드 캐뉼라를 통해 뉴런의 활동을 일시적으로 방해하는 약물의 미세 분사는 위에서 언급한 단점을 능가하는 적합한 대안입니다. 캐뉼라는 스테레오탁스 수술로 뇌 부위에 배치될 수 있으며, 수술의 혼란스러운 효과가 사라진 후 연구자가 약물 치료를 시작할 수 있게 합니다. 약물의 시간 제한 된 미세 주입 은 연구원이 과정의 특정 단계에 지역의 기여에 관한 가설을 테스트 할 수 있으며 깨어 억제 또는 자유로운 이동 동물에서 수행 할 수 있습니다. 국소 마취제, 작용제, 길항제, 역 작용제 및 테트로도톡신(TTX)과 같은 생물학적 독소를 포함한 다양한 약물은 특정 시간에 관심 영역으로 마이크로 주입될 수 있다.
TTX는 복어의 몸에 사는 박테리아뿐만 아니라 다른 척추동물및 무척추동물에 의해 합성된 생물학적 독소입니다. TTX는 나트륨 채널의 선택적이고 일시적인 봉쇄를 통해 신경 활동을 침묵시키고, 이로 인해 나트륨 의존적 작용 잠재력이 억제됩니다. TTX의 존재에서, 세포는 탈극화 단계에서 변경을 경험하고 따라서 흥분하지 않고 살아 남아 있다. TTX의 차단 효과는 분자 조성에 의해 설명된다 : guanidinium 그룹은 나트륨 채널의 세포 외 측면을 통과 할 수 있지만, 분자의 나머지 는 크기로 인해 통과 할 수 없습니다, 그래서 붙어 채널13,14,15,16,17 . TTX의 작용 메커니즘은 체외와 생체 내 신경계를 연구하는 도구로 사용할 수 있었습니다. 이 독소의 인트레이스테렐 주사는 메모리 보존18,수면 및 각성19,장소 인식20,공간 탐색21,약물 남용22,온도 조절23,정신 분열증24의개발, 성적 행동25 및 배란26의 조절과 같은 여러 과정에서 이산 뇌 영역의 역할을 연구하는 데 사용되었습니다. 다른 사람의 사이에서. 이 프로토콜에서 우리는 깨어 있고 억제되지 않은 쥐에 TTX 미세 주입에 의한 시상 하 핵의 일시적인 불활성화의 배란에 미치는 영향을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서는 깨어 있고 억제되지 않은 쥐의 뇌의 이산 영역인 일시적인 비활성화 방법을 설명합니다. 그들의 estrous 주기를 추적하고 배란을 평가하는 간단한 방법도 제공됩니다. 이 프로토콜은 TTX 처리된 동물의 배란 결과를 차량 처리된 동물의 배란 결과를 비교하여 배란을 유도하는 메커니즘에 특정 뇌 영역의 기여도를 간단하게 분석할 수 있게 합니다. 신경과학 실험실에서 흔히 볼 수 있는 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고 편집에 그의 귀중한 도움에 대한 워싱턴 대학의 레이몬드 산체스에 감사하고 M.Sc. 조지나 코르테스와 M.Sc. Cintia Javier이 기술의 표준화에 대한 기술 적 지원에 대한. 우리는 또한 Facultad 드 Estudios 슈페리어 사라고사에서 수의사 서비스의 구성원에게 감사드립니다: MVZ. 아드리아나 알타미라노, MVZ. 로마 에르난데스와 MVZ. 돌로레스-엘리자베스 구즈만은 실험동물의 우수한 유지 보수와 관리를 위해 서식합니다. 이 프로토콜에 설명된 실험은 DGAPA-PAPIIT 교부금 번호인 IN216015및 CONACyT 교부금 번호: 로베르토 도밍게스에 236908 지원되었습니다. 카를로스 카밀로 실바는 Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, 유니버시다드 나시오날 오토노마 데 멕시코 (UNAM)의 박사 과정 학생이며 콘세조 나시오날 드 시엔시아 y Tecnología (그랜트 번호 : 294555)의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
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