Unraveling rollen som diskrete områder av rottehjernen i regulering av eggløsning gjennom reversibel inaktivering av tetrodtoksin mikroinjeksjoner

Summary

Denne protokollen beskriver byggingen av et rimelig mikroinjeksjonssystem, dets stereotoksiske implantasjon i dyphjernestrukturer og prosedyren for tidsbestemte mikroinjeksjoner av tetrodotoxin hos våken og uhemmet rotter. Målet er å avsløre deltakelsen av hypothalamus strukturer i regulering av eggløsning ved å hemme deres nevrale aktivitet.

Abstract

Mange eksperimentelle tilnærminger har blitt brukt til å studere hjernens rolle i reguleringen av eggløsning. Eksempler er lesjon og døvhet av nevrongrupper, som begge er invasive metoder som permanent svekker integriteten til målområdet. Disse metodene ledsages av sikkerhetseffekter som kan påvirke analysen av akutte og tidsmessige reguleringsmekanismer. Stereotoksisk implantasjon av guidekanyler rettet mot bestemte hjerneregioner, etterfulgt av en gjenopprettingsperiode, gjør det mulig for forskere å mikroinjektere forskjellige stoffer etter at de uønskede effektene av operasjonen er forsvunnet. Tetrodotoxin har blitt brukt til å bestemme rollene til flere hjerneområder i ulike fysiologiske prosesser fordi det midlertidig hemmer de natriumavhengige virkningspotensialene, og dermed blokkerer all nevral aktivitet i målområdet. Denne protokollen kombinerer denne metoden med strategier for vurdering av østrogen syklus og eggløsning for å avsløre rollen som diskrete hjerneregioner i regulering av eggløsning på bestemte tidspunkter av et gitt stadium av østrogensyklusen. Våken og uhemmet rotter (Rattus norvegicus) ble brukt for å unngå de blokkerende effektene som bedøvelse og stresshormoner utøver på eggløsning. Denne protokollen kan enkelt tilpasses andre arter, hjernemål og farmakologiske midler for å studere ulike fysiologiske prosesser. Fremtidige forbedringer av denne metoden inkluderer utformingen av et mikroinjeksjonssystem ved hjelp av glass kapillærer med liten diameter i stedet for guidekanyler. Dette vil redusere mengden vev som er skadet under implantasjonen og redusere spredningen av de tilsatte stoffene utenfor målområdet.

Introduction

Eggløsning er prosessen der en eller flere modne oocytter frigjøres fra eggstokkene en gang hver estral / menstruasjonssyklus. Siden alle pattedyrarter er avhengige av produksjon av gameter for å avle, har forståelsen av mekanismene som regulerer eggløsning en stor innvirkning på områder som spenner fra biomedisin, husdyrindustrien og vedlikehold av truede arter. Eggløsning er regulert av hypothalamus-hypofyse-ovarieaksen, som involverer flere hypothalamus og ekstra hypothalamus områder, gonadotropene i fremre hypofyse og theca og granulosa celler som sammen med oocytter danner eggstokkene follikler inne i eggstokkene¹.

Ovariefoskler vokser, utvikler og til slutt eggløsning som svar på tonic og phasic sekresjon av follikkelstimulerende hormon og luteiniserende hormon, de to gonadotropins utskilt av gonadotropes. Mønsteret av gonadotropin sekresjon er avgjørende for riktig follikulær utvikling og eggløsning, og det er regulert av gonadotropin-frigjørende hormon (GnRH)^1,2. Dette nevropeptidet syntetiseres av nevroner spredt over hele basal diencephalon og utskilles deretter til portalvaskulaturen som forbinder hypothalamus og den fremre hypofysen. Sekretorisk aktivitet av GnRH-nevronene er igjen modulert av synaptiske innganger som oppstår fra forskjellige hjernestrukturer. Disse strukturene formidler informasjon om tilstanden til organismens ytre og indre miljø, inkludert tilgjengeligheten av mat, lengden på fotoperioden og konsentrasjonen av hormoner i blodet. I denne forstand former de reproduksjonsmønsteret til hver art, og de spesifikke rollene til slike strukturer må bestemmes for å forstå mekanismene som styrer eggløsningen riktig. Som et eksempel har det vist seg at svingningene i østradiolnivåer under østrogensyklusen regulerer sekresjonen av GnRH; GnRH-nevroner uttrykker imidlertid ikke østradiolreseptorens isoform som trengs for å oppdage slike endringer. To populasjoner av nevroner som uttrykker disse reseptorene ligger i rostral periventrikulær region i den tredje ventrikelen og i henholdsvis arcuate kjernen, og stablish synapser med GnRH-nevroner. Det er bevis som tyder på at disse nevronene tolker konsentrasjonen av østradiol og deretter stimulerer aktiviteten til GnRH-nevroner ved å frigjøre kisspeptin, en potent induktor av GnRH-sekresjon³.

Eksperimenter som involverertermiske eller kjemiske lesjoner, samt mekanisk døvhet, tillot forskere å bestemme involvering av flere hjernestrukturer i regulering av eggløsning^{4,5,6,7,8,9,10,11,12} . Disse eksperimentene har imidlertid ulempen med å være invasiv og traumatisk, noe som krever flere dager med utvinning før de evaluerer effekten av behandlingen, noe som hindrer analysen av de akutte effektene av behandlingen. I tillegg påvirker de permanent de målrettede områdene og forstyrrer andre fysiologiske prosesser på lang sikt. På grunn av disse problemene er resultatene av disse eksperimentene vanligvis skjult av de homeostatiske kompenserende mekanismene i dyrets kropp og utvinning av nøyaktig informasjon om den tidsmessige regulatoriske dynamikken der området er involvert, er ganske vanskelig.

Mikroinjeksjonen av legemidler som midlertidig forstyrrer aktiviteten til nevroner gjennom guidekanyler, er et passende alternativ som overgår ulempene nevnt ovenfor. Kanylene kan plasseres i hvilken som helst hjerneregion ved en stereotaxisk kirurgi, slik at forskeren kan starte medikamentbehandlingen etter at de forvirrende effektene av operasjonen forsvinner. Den tidsbestemte mikroinjeksjonen av stoffene gjør det mulig for forskere å teste hypoteser om regionens bidrag til et bestemt trinn i prosessen og kan utføres i våken beherskede eller fritt bevegelige dyr. En rekke stoffer, inkludert lokalbedøvelse, agonister, antagonister, inverse agonister og biologiske giftstoffer som tetrodotoxin (TTX) kan mikroinjiseres i interesseområdet på bestemte tidspunkter.

TTX er et biologisk toksin syntetisert av bakterier som lever i pufferfishens kropp, så vel som andre vertebrater og hvirvelløse dyr. TTX stiller nevral aktivitet gjennom selektiv og forbigående blokade av natriumkanaler, noe som resulterer i hemming av natriumavhengige virkningspotensialer. I nærvær av TTX opplever celler en endring i depolariseringsfasen og er dermed ikke spennende, men forblir i live. Blokkeringseffekten av TTX forklares av sin molekylære sammensetning: En guanidiniumgruppe er i stand til å passere gjennom det ekstracellulære aspektet av natriumkanalen, men resten av molekylet kan ikke passere på grunn av størrelsen, så den sitter fast og blokkerer kanalen^{13,14,15,16,17} . Virkningsmekanismen til TTX tillot bruk som et verktøy for å studere nervesystemet både in vitro og in vivo. Intracerebral injeksjon av dette toksinet har blitt brukt til å studere rollen som diskrete hjerneområder i flere prosesser som minne oppbevaring¹⁸, søvn og opphisselse¹⁹, sted anerkjennelse²⁰, romlig^{navigasjon 21}, narkotikamisbruk²², termoregulering²³, utvikling av schizofreni²⁴, seksuell atferd²⁵ og regulering av eggløsning²⁶ blant andre. I denne protokollen beskriver vi effekten på eggløsning av forbigående inaktivering av hypothalamus nuklei av TTX mikroinjeksjon hos våken og uhemmet rotter.

Protocol

Prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av fakultetets etikkkomité de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM. Denne institusjonen opererer i henhold til de meksikanske reglene for dyrehåndtering, Offisiell norm: NOM-062-ZOO-1999, som er enig med internasjonale retningslinjer. 1. Bygging av bilaterale kanyler Trekk ut skaftet i rustfritt stål fra navet på to 23 G hypodermiske nåler ved hjelp av trykk pinsett, og fjern deretter eventuelt gjenværende lim ved hjelp av et skalpellbla…

Representative Results

Protokollen beskrevet ovenfor ble testet ved å evaluere effekten av en enkelt TTX eller kjøretøy (kunstig cerebrospinalvæske; ACSF) mikroinjeksjon i en av to forskjellige kjerner kjent for å være involvert i regulering av eggløsning i rotte: suprachiasmatic og arcuate kjernen. Den suprachiasmatiske kjernen ble valgt siden den inneholder den sentrale sirkadiske pacemakeren hos pattedyr. Det er involvert i regulering av sykliske hendelser som sekresjon av gonadotropiner. Den arcuate kjernen ble valgt fordi den inneh…

Discussion

Denne artikkelen beskriver en metode for å midlertidig inaktivere, til enhver tid, en diskret region i hjernen til våken og uhemmet rotter. En enkel metode for å spore deres østrogen syklus og vurdere eggløsning er også gitt. Denne protokollen tillater en enkel analyse av bidraget fra spesifikke hjerneregioner til mekanismene som driver eggløsning ved å sammenligne det ovulatoriske utfallet av TTX-behandlede dyr med de kjøretøybehandlede. Med unntak av det stereotaktiske instrumentet og mikroinjeksjonspumpen, s…

Materials

10 μL Hamilton syringes	Hamilton	80314
21 G x 1" stainless steel hypdermic needle	BD	305165
23 G x 1" stainless steel hypdermic needle	BD	305145
30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle	BD	305106
Artificial cerebrospinal fluid	BASi	MD-2400
Bone trimer	Fine Science Tools	16152-12
Burr for micro drill	Fine Science Tools	19007-05
Clipper	Wahl
Cut-off disc	Dremel	SM5010
Cutting tweezers	Truper	17367
Cyanocrylate glue	Kola loka	K-1
Dental cement	Nic Tone
Enrofloxasin	Senosiain
Eosin	Sigma	E4009
Estereoscope	Zeiss
Extra fine Bonn scissors	Fine Science Tools	14084-08
Face mask	Lanceta HG	60036
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11050-10
Hematoxilin	Sigma	H3136
Hemostats	Fine Science Tools	13008-12
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Hydrochloric acid	Sigma	320331
Hypromelose artificial tears	Sophia Labs	8950015
Isoflurane	Pisa Agropecuaria
Meloxicam	Aranda	1183
Microinjection pump	KD Scientific	788380
Monomer	Nic Tone
Mototool	Dremel	3000
Nitrile gloves	Lanceta HG	69028
Non-Rupture Ear Bars	David Kopf Instruments	855
Poly-L lysine	Sigma	P4707
Povidone-iodine	Dermo Dine
Povidone-iodine with soap	Germisin espuma
Pressure tweezers	Truper	17371
Rat anesthesia mask	David Kopf Instruments	Model 906
Saline solution	PISA
Scalpel	Fine Science Tools	10004-13
Scalpel blade	Fine Science Tools	10015-00
Sodium pentobarbital	Pisa Agropecuaria
Standard electrode holder	David Kopf Instruments	1770
Stainless steel wire	American Orthodontic	856-612
Stereotaxic apparatus	David Kopf Instruments	Model 900LS
Surgical Sissors	Fine Science Tools	14001-12
Teflon connectors	Basi	MD-1510
Teflon tubing	Basi	MF-5164
Tetrodotoxin	Alomone labs	T-500
Vaporizer	Kent scientific	VetFlo