Summary
Ce protocole décrit la construction d’un système de micro-injection à faible coût, son implantation stéréotaxique dans les structures cérébrales profondes et la procédure de microinjections chronométrées de tétrodotoxine chez des rats éveillés et non effrénés. L’objectif est de révéler la participation des structures hypothalamiques à la régulation de l’ovulation en inhibant leur activité neuronale.
Abstract
De nombreuses approches expérimentales ont été utilisées pour étudier le rôle du cerveau dans la régulation de l’ovulation. Les exemples incluent la lésion et la désafférentation des groupes neuronaux, qui sont deux méthodes invasives qui nuisent de manière permanente à l’intégrité de la zone cible. Ces méthodes s’accompagnent d’effets collatéraux qui peuvent affecter l’analyse des mécanismes de régulation aiguë et temporelle. L’implantation stéréotaxique de canules guides visant des régions spécifiques du cerveau, suivie d’une période de récupération, permet aux chercheurs de micro-injecter différents médicaments après la disparition des effets indésirables de la chirurgie. La tétrodotoxine a été utilisée pour déterminer les rôles de plusieurs zones du cerveau dans divers processus physiologiques, car elle inhibe transitoirement les potentiels d’action dépendants du sodium, bloquant ainsi toute activité neuronale dans la région cible. Ce protocole combine cette méthode avec des stratégies d’évaluation du cycle œstré et de l’ovulation pour révéler le rôle des régions cérébrales discrètes dans la régulation de l’ovulation à des moments particuliers d’un stade donné du cycle œstré. Des rats éveillés et non effrénés (Rattus norvegicus) ont été utilisés pour éviter les effets bloquants que les anesthésiques et les hormones de stress exercent sur l’ovulation. Ce protocole peut être facilement adapté à d’autres espèces, cibles cérébrales et agents pharmacologiques pour étudier différents processus physiologiques. Les améliorations futures de cette méthode comprennent la conception d’un système de micro-injection utilisant des capillaires en verre de petit diamètre au lieu de canules de guidage. Cela réduira la quantité de tissu endommagé pendant l’implantation et diminuera la propagation des médicaments perfusés en dehors de la zone cible.
Introduction
L’ovulation est le processus par lequel un ou plusieurs ovocytes matures sont libérés des ovaires une fois par cycle estral / menstruel. Comme toutes les espèces de mammifères dépendent de la production de gamètes pour se reproduire, la compréhension des mécanismes qui régulent l’ovulation a un impact énorme dans des domaines allant de la biomédecine à l’industrie de l’élevage et au maintien des espèces menacées. L’ovulation est régulée par l’axe hypothalamo-hypophyso-ovarien, qui implique plusieurs zones hypothalamiques et extra-hypothalamiques, les gonadotropes de l’hypophyse antérieure et les cellules thèque et granulosa qui, avec les ovocytes, forment les follicules ovariens à l’intérieur des ovaires1.
Les follicules ovariens se développent, se développent et éventuellement ovulent en réponse à la sécrétion tonique et phasique de l’hormone folliculo-stimulante et de l’hormone lutéinisante, les deux gonadotrophines sécrétées par les gonadotrophes. Le schéma de sécrétion de gonadotrophine est essentiel pour le bon développement folliculaire et l’ovulation et il est régulé par l’hormone de libération des gonadotrophines (GnRH)1,2. Ce neuropeptide est synthétisé par des neurones dispersés dans tout le dencéphale basal puis sécrétés dans le système vasculaire portail qui relie l’hypothalamus et l’hypophyse antérieure. L’activité sécrétoire des neurones de la GnRH est à son tour modulée par l’entrée synaptique provenant de diverses structures cérébrales. Ces structures transmettent des informations sur l’état de l’environnement externe et interne de l’organisme, y compris la disponibilité de la nourriture, la durée de la photopériode et la concentration d’hormones dans le sang. En ce sens, ils façonnent le schéma de reproduction de chaque espèce et les rôles spécifiques de ces structures doivent être déterminés afin de bien comprendre les mécanismes régissant l’ovulation. À titre d’exemple, il a été démontré que la fluctuation des niveaux d’œstradiol au cours du cycle œstré régule la sécrétion de GnRH; cependant, les neurones de la GnRH n’expriment pas l’isoforme du récepteur de l’œstradiol nécessaire pour détecter de tels changements. Deux populations de neurones exprimant ces récepteurs sont situées dans la région périventriculaire rostrale du troisième ventricule et dans le noyau arquié, respectivement, et forment des synapses avec des neurones GnRH. Il existe des preuves suggérant que ces neurones interprètent la concentration d’œstradiol et stimulent ensuite l’activité des neurones de la GnRH en libérant de la kisspeptine, un puissant inducteur de la sécrétion de GnRH3.
Des expériences impliquant des lésions thermiques ou chimiques, ainsi qu’une désafférentation mécanique, ont permis aux chercheurs de déterminer l’implication de plusieurs structures cérébrales dans la régulation de l’ovulation4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Ces expériences ont cependant l’inconvénient d’être invasives et traumatisantes, nécessitant plusieurs jours de récupération avant d’évaluer les effets du traitement, ce qui entrave l’analyse des effets aigus du traitement. De plus, ils affectent en permanence les zones ciblées et perturbent d’autres processus physiologiques à long terme. En raison de ces problèmes, les résultats de ces expériences sont généralement obscurcis par les mécanismes compensatoires homéostatiques dans le corps de l’animal et il est plutôt difficile d’extraire des informations précises sur la dynamique de régulation temporelle dans laquelle la zone est impliquée.
La microinjection de médicaments qui perturbent transitoirement l’activité des neurones à travers des canules guides est une alternative appropriée qui surpasse les inconvénients mentionnés ci-dessus. Les canules peuvent être placées dans n’importe quelle région du cerveau par une chirurgie stéréotaxique, permettant au chercheur de commencer le traitement médicamenteux après la disparition des effets confondants de la chirurgie. La micro-injection chronométrée des médicaments permet aux chercheurs de tester des hypothèses concernant la contribution de la région à une étape particulière du processus et peut être effectuée chez des animaux éveillés retenus ou en mouvement libre. Une variété de médicaments, y compris les anesthésiques locaux, les agonistes, les antagonistes, les agonistes inverses et les toxines biologiques telles que la tétrodotoxine (TTX) peuvent être microinjectés dans la région d’intérêt à des moments spécifiques.
TTX est une toxine biologique synthétisée par des bactéries vivant dans le corps du poisson-globe ainsi que d’autres vertébrés et invertébrés. TTX réduit au silence l’activité neuronale par le blocage sélectif et transitoire des canaux sodiques, ce qui entraîne l’inhibition des potentiels d’action dépendants du sodium. En présence de TTX, les cellules subissent une altération de la phase de dépolarisation et ne sont donc pas excitables mais restent vivantes. L’effet bloquant du TTX s’explique par sa composition moléculaire: un groupe guanidinium est capable de passer à travers l’aspect extracellulaire du canal sodique, mais le reste de la molécule ne peut pas passer en raison de sa taille, il est donc coincé et bloque le canal13,14,15,16,17 . Le mécanisme d’action du TTX a permis son utilisation comme outil pour étudier le système nerveux à la fois in vitro et in vivo. L’injection intracérébrale de cette toxine a été utilisée pour étudier le rôle des zones cérébrales discrètes dans plusieurs processus tels que la rétention de la mémoire18, le sommeil et l’excitation19, la reconnaissance de lieu20, la navigation spatiale21, l’abus dedrogues 22, la thermorégulation23, le développement de la schizophrénie24, le comportement sexuel25 et la régulation de l’ovulation26 entre autres. Dans ce protocole, nous décrivons les effets sur l’ovulation de l’inactivation transitoire des noyaux hypothalamiques par microinjection TTX chez des rats éveillés et non drainés.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique de facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM. Cette institution fonctionne en stricte conformité avec les règles mexicaines pour la manipulation des animaux, norme officielle: NOM-062-ZOO-1999, qui est conforme aux directives internationales.
1. Construction de canules bilatérales
- Extrayez l’arbre en acier inoxydable du moyeu de deux aiguilles hypodermiques de 23 G à l’aide d’une pince à pression, puis retirez toute colle restante à l’aide d’une lame de scalpel.
- Tracez une ligne à 15 mm de l’extrémité émoussée des arbres avec un marqueur permanent fin. Utilisez une pince à épiler pour enlever les extrémités biseautées.
- Tenez les segments de 15 mm avec des hémostats fins et pressez-les perpendiculairement avec un disque de coupure attaché à un outil rotatif jusqu’à l’obtention de segments de tubes de 14 mm. Cette étape est effectuée afin d’éliminer la partie occluse des arbres, en créant des extrémités ouvertes et émoussées. Enfin, insérez une aiguille de 30 G à travers les segments pour éliminer toute obstruction interne.
- Déterminer la distance entre les structures d’intérêt dans les hémisphères gauche et droit du cerveau à l’aide d’un atlas cérébral27. Utilisez de l’argile de moulage pour fixer les deux segments de 14 mm à une lame de microscope et assurez-vous que les deux sont au même niveau horizontal. Observez à travers un micromètre oculaire (10x) et ajustez les segments avec une pince à épile fine jusqu’à ce que la distance souhaitée soit obtenue.
- Mélanger la pâte à souder avec 10% d’acide chlorhydrique dans une proportion de 2:1 et ajouter une goutte du mélange 2 mm en dessous de l’extrémité émoussée des segments. Souder les deux segments avec un seul point à l’aide d’un fer à souder et d’un fil de soudure de 0,5 mm de diamètre. Assurez-vous que la soudure n’obstrue pas la lumière des segments.
- Créez un support pour fixer la canule au support stéréotaxique en coupant un segment de 10 mm de fil en acier inoxydable résilient de 0,3 mm. Utilisez de l’argile de moulage pour placer 2 mm du fil en contact avec le point de soudure précédent et le reste au-dessus de l’extrémité émoussée des canules. Souder le fil aux canules.
- Nettoyez la surface des canules avec de l’éthanol à 70% pour éliminer l’excès de pâte à souder. Rincer l’intérieur des canules avec de l’eau stérile pour éliminer les particules métalliques. Répétez ce processus jusqu’à ce qu’aucune particule ne puisse être détectée au microscope à un grossissement de 10x.
2. Construction d’obturateurs et de bouchons
- Pour construire les obturateurs, coupez deux segments de 16 mm de fil souple rond en acier inoxydable (0,35 mm de diamètre). Tenez une canule bilatérale avec des hémostats, perpendiculaire à un banc de laboratoire, et insérez l’un de ces segments dans chaque canule jusqu’à ce qu’ils atteignent le banc. Pliez le reste à un angle de 90°.
- Pour les bouchons, coupez deux segments de 2 mm de tubes en silicone (diamètre intérieur = 0,76 mm) et appliquez une goutte de colle de silicium à l’une des extrémités de chaque segment. Ne laissez pas la colle pénétrer dans le tube. Laisser sécher pendant au moins 24 heures.
3. Construction de micro-injecteurs
- Répétez l’étape 1.1, en utilisant plutôt des aiguilles hypodermiques de 30 G pour créer les arbres.
- Tracez une ligne à 18,5 mm de l’extrémité émoussée des arbres et retirez le reste des extrémités biseautées avec une pince à épiler coupante.
- Répétez l’étape 1.1 avec une seule aiguille de 23 G pour construire des adaptateurs en coupant deux segments de 6 mm de long à partir de l’extrémité émoussée.
- Éliminer les parties obstruées des segments de 6 mm en les pressant perpendiculairement contre le disque de coupure jusqu’à l’obtention de deux adaptateurs de 4 mm. Éliminez toute obstruction interne.
- Insérez l’extrémité biseautée des segments 30 G dans les adaptateurs. Regardez à travers un stéréomicroscope pour vous assurer que l’extrémité des deux, segments et adaptateurs, est au même niveau. Appliquez de la colle cyanoacrylate sur l’articulation distale à l’aide d’un coton-tige et laissez sécher pendant 15 minutes.
- Faites tremper deux connecteurs de tubes en téflon dans de l’éthanol à 70% pendant 5 minutes, puis fixez-les aux micro-injecteurs à travers les adaptateurs. Attendez que le diamètre des connecteurs rétrécisse pendant au moins 24 heures, puis stérilisez le micro-injecteur avec une méthode à basse température pour éviter d’endommager les connecteurs (la stérilisation à l’oxyde d’éthylène est recommandée).
4. Entretien des animaux et frottis vaginaux
- Utilisez des rats à capuchon femelles adultes cycliques (Rattus norvegicus, souche CIIZ-V) pesant entre 230 et 260 grammes. Hébergez les rats par groupes de quatre dans des cages en polypropylène standard dans une pièce avec une photopériode clair-foncé de 14:10. Réglez la température et l’humidité à 22 ± 2 °C et à 40 %, respectivement. Fournir de la nourriture et de l’eau ad libitum.
- Prendre des frottis vaginaux tous les jours entre 10h00 et 12h00.
- Stériliser une boucle bactériologique modifiée d’un diamètre intérieur de 1 mm à l’aide d’une lampe à alcool et la refroidir avec de l’eau stérile. Tenez le rat avec une prise sûre et introduisez 5 mm de la boucle bactériologique dans le vagin, en touchant ses parois internes. Retirez la boucle bactériologique. En cas de succès, une goutte nuageuse sera vue à la pointe. Placez cette goutte sur une lame de microscope.
- Répétez ce processus pour chaque rat en stérilisant et en refroidissant la boucle entre chaque animal.
- Une fois les gouttes sèches, colorez avec de l’hématoxyline-éosine et observez les échantillons au microscope à 10x.
- Déterminer la proportion de leucocytes, de cellules nucléées épithéliales et de cellules kératinisées sur chaque frottis et le classer selon les critères des stades du cycle œstrous rapportés à la figure 1, ce qui concorde avec la littérature précédente28,29.
5. Implantation stéréotaxique des canules
REMARQUE: Effectuer l’implantation des canules après une chirurgie stéréotaxique aseptique régulière et en respectant les normes institutionnelles.
- Avant la chirurgie
- Stériliser les instruments chirurgicaux, les canules, les vis chirurgicales, les obturateurs, la gaze et les cotons-tiges en bois 24 h avant la chirurgie à l’aide d’un autoclave à vapeur. Stérilisez les pointes des instruments métalliques entre les chirurgies consécutives en les nettoyant avec 10% de peroxyde d’hydrogène suivi d’eau, puis placez-les dans un stérilisateur à billes chaudes.
- Préparez les zones de travail et l’instrument stéréotaxique avant de retirer l’animal de la salle de bain. Préparez l’animal à la chirurgie dans une zone située aussi loin que possible de la table de chirurgie pour éviter toute contamination pendant la procédure.
- Nettoyez les zones de préparation et de chirurgie avec de l’éthanol à 70%, suivi d’une application d’une solution de chlorure à 10% pendant dix minutes. Nettoyez la base, le cadre et les manipulateurs de l’instrument stéréotaxique avec 70% d’éthanol et stérilisez les extrémités des barres auriculaires à l’aide d’un stérilisateur à billes chaudes et refroidissez-les à l’air avant la chirurgie.
- Effectuez la chirurgie en portant un manteau de laboratoire dédié, un masque facial, un bonnet de tête, des manches chirurgicales, des couvre-chaussures et des gants chirurgicaux. Demandez à l’assistant de préparer les animaux à la chirurgie et de vérifier leur état général pendant la procédure.
- Fixez la canule au support stéréotaxique. Demandez à l’assistant d’amener le premier animal à opérer dans la pièce. Sélectionner des rats dans le diestrus pour la chirurgie, car les observations de notre laboratoire indiquent que ces animaux récupèrent les cycles œstrus appropriés plus rapidement que les rats opérés à d’autres stades, probablement parce que la réponse au stress change avec le cycle œstrueux.
- Peser l’animal et induire une anesthésie avec 4% d’isoflurane dans 100% d’oxygène à l’intérieur d’une chambre d’induction pour rats connectés à un vaporisateur d’isoflurane. Pour éviter de stresser les animaux, ne préremplez pas la chambre. Confirmez un plan chirurgical d’anesthésie en vérifiant la dilatation de la pupille et la perte de douleur mesurée par les tests de pincement de la queue et de l’oreille après avoir observé la perte du réflexe de redressement.
- Anesthésier le rat par injection intrapéritonéale d’un mélange de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) si un vaporisateur d’isoflurane n’est pas disponible.
- Retirez le rat de la chambre d’induction et utilisez un cône de nez dans la table de préparation pour maintenir les effets de l’anesthésie avec 2,5% d’isoflurane dans 100% d’oxygène. Coupez les poils du cuir chevelu avec des tondeuses et enlevez les poils lâches avec un rouleau à charpie. Injecter une dose sous-cutanée préopératoire de 2 mg/kg de méloxicam et de 5 mg/kg d’enrofloxacine comme anti-inflammatoire/analgésique non stéroïdien et antibiotique, respectivement.
- Appliquez des larmes artificielles d’hypromellose sur chaque œil pour éviter la dessiccation pendant la chirurgie.
- Montez l’animal dans l’instrument stéréotaxique au-dessus d’un coussin chauffant à l’aide de barres d’oreille sans rupture et d’un masque d’anesthésie. Ajustez la pince nasale pour vous assurer que la tête de l’animal est plate. Effectuez un gommage chirurgical dans la zone rasée en alternant entre la povidone-iode avec du savon et de l’éthanol à 70% une fois, puis en utilisant deux fois de la povidone-iode et de l’éthanol à 70%. Insérez un thermomètre rectal pour enregistrer la température de l’animal pendant la procédure, puis couvrez-le d’un champ chirurgical stérile.
- Pendant la chirurgie
- Utilisez un scalpel pour faire une incision de 2 cm dans la peau et les muscles au milieu de la zone rasée. Retirez le périoste du crâne à l’aide d’un coton-tige recouvert de peroxyde d’hydrogène à 2% pour révéler bregma ou lambda, les repères qui seront utilisés pour calculer les coordonnées cibles. Séchez le crâne avec de l’air pour une meilleure visualisation du point de repère.
- Utilisez les manipulateurs de l’instrument stéréotaxique pour déplacer la canule dans une position directement au-dessus du point de repère de votre choix. Enregistrez les coordonnées antérieures-postérieures et médiales-latérales de l’instrument stéréotaxique et utilisez-les pour calculer les coordonnées de la zone cible selon l’atlas cérébral27.
- Réglez les coordonnées calculées dans l’instrument stéréotaxique et placez la pointe de la canule à la surface du crâne. Enregistrez la coordonnée dorsale-ventrale et utilisez-la pour calculer la profondeur par endroit de la zone cible.
- Retirez le bras du manipulateur en le dévissant du cadre. Utilisez une bavure dentaire attachée à un outil rotatif à une vitesse de 15 000 tr/min pour marquer à l’endroit où la craniotomie sera effectuée. Ensuite, utilisez la bavure pour faire trois trous, formant un triangle équilatéral autour de la marque. Ces trous ne doivent pas percer le crâne. Insérez les vis chirurgicales dans les trous, en vous assurant qu’elles sont bien placées.
- Faites la craniotomie assez large pour tenir compte de la distance entre les zones cibles dans chaque hémisphère. Il doit être aussi petit que possible en diamètre mais assez grand pour permettre l’abaissement de la canule sans toucher les bords du crâne, car cela modifiera la trajectoire. Effectuez la craniotomie progressivement, en appliquant la pression la plus basse possible. Le crâne du rongeur n’a que quelques millimètres d’épaisseur et il est essentiel pour préserver l’intégrité des tissus en dessous.
- Une fois que la dure-mère est visible, utilisez une aiguille stérile de 21 G dont la pointe est incurvée à un angle de 90 ° pour enlever les éclats d’os et faire une coupe antérieure-postérieure dans les méninges. Utilisez la technique Wirtshafter et collègues30 pour éviter d’endommager le sinus sagittal supérieur si la zone cible est située près de la ligne médiane.
- Placez le support avec la canule dans le cadre et utilisez le manipulateur dorsal-ventral pour atteindre la coordonnée ventrale. Vérifiez que l’aiguille ne touche pas les bordures en descendant et augmentez le diamètre de la craniotomie si nécessaire.
REMARQUE: Il est important que la pointe des canules de guidage cible une région allant de 0,5 à 2,0 mm au-dessus de la région d’intérêt. Cela est dû à la réaction inflammatoire du cerveau en réponse à l’introduction de corps étrangers et à la destruction des tissus. Ceci est particulièrement important si la région d’intérêt est petite et que la distance de travail doit être calculée empiriquement à l’avance.
- Placez le support avec la canule dans le cadre et utilisez le manipulateur dorsal-ventral pour atteindre la coordonnée ventrale. Vérifiez que l’aiguille ne touche pas les bordures en descendant et augmentez le diamètre de la craniotomie si nécessaire.
- Appliquez du ciment dentaire pour attacher la canule au crâne et laissez-la sécher. Assurez-vous que le ciment dentaire ne recouvre pas l’extrémité émoussée de la canule, car cela l’obstruerait de manière irréversible. Attendez que le ciment se solidifie complètement.
- Insérez les obturateurs pour éviter d’autres obstructions et pour assurer la perméabilité pendant l’étude. Mettez le capuchon en silicone pour éviter toute contamination.
- Après la chirurgie
- Remplacer les liquides perdus par une injection intrapéritonéale de 1,0 mL de solution saline stérile à une température physiologique. Placez l’animal dans une cage de récupération avec support thermique jusqu’à ce qu’il se rétablisse de l’anesthésie. Vérifiez périodiquement la température et la fréquence cardiaque/respiratoire de l’animal. Les effets de l’isoflurane durent quelques minutes après l’interruption du flux gazeux tandis que les effets de la kétamine / xylazine durent de 40 à 50 minutes.
- Fournir des injections postopératoires de l’antibiotique, de l’analgésique et de l’anti-inflammatoire (aux mêmes doses et voies indiquées précédemment) pendant 48 à 72 heures et inspecter de près les animaux quotidiennement pour le reste de l’expérience. Signalez tout signe de douleur, de stress ou de perte de poids aux services vétérinaires ou à un membre qualifié du laboratoire. N’effectuez aucune autre manipulation aux rats pendant cette période.
- Commencez à prendre des frottis vaginaux après le traitement postopératoire et continuez à le faire jusqu’à ce que l’animal présente trois cycles œs séreux consécutifs de quatre jours.
REMARQUE: Les cathéters jugulaires chroniques peuvent être implantés chirurgicalement, ce qui permet au chercheur de prélever des échantillons de sang en série pour analyser la sécrétion d’hormones telles que l’œstradiol, la progestérone, la testostérone, l’hormone lutéinisante, l’hormone folliculo-stimulante et la corticostérone. Nous recommandons de placer un tel cathéter une fois que l’animal se remet de la chirurgie du cerveau, car cela améliorera le taux de survie tout en évitant le colmatage du cathéter qui peut résulter d’un temps de récupération prolongé.
6. Manipulation des tétrodotoxines et préparation des solutions
ATTENTION : Le TTX est l’une des substances les plus toxiques connues. Il agit sur les muscles squelettiques et les tissus nerveux. L’intoxication par contact est peu probable, mais toute plaie ouverte est une voie potentielle d’inoculation dans le corps. Les principales préoccupations lorsque vous travaillez avec TTX sont la ponction de la peau avec des instruments tranchants qui ont été en contact avec la toxine et la génération d’aérosols qui peuvent atteindre la bouche, les yeux et les muqueuses. Selon la dose, le TTX peut être mortel s’il est inhalé, avalé ou inoculé par la peau. Il provoquera une forte irritation des yeux. La DL50 a été testée chez la souris par administration orale et intraveineuse et elle est de 334 μg/kg et 7,3 μg/kg, respectivement. Il n’y a pas d’antitoxine disponible pour le moment.
REMARQUE: La substance inactivante est une solution de NaOCl à 1,0 % avec ou sans NaOH à 0,25 N ou une solution d’eau de Javel à 10 %. L’inactivation complète se produit après 30 minutes d’exposition. Le TTX ne peut être complètement inactivé par un dérivé de chlorure à une concentration inférieure à 10 %, par autoclavage ni par stérilisation à la chaleur sèche à une température inférieure à 500 °F. Toutes les procédures impliquant TTX doivent être effectuées par deux personnes bien informées portant des paires intérieures et extérieures de gants en nitrile, une blouse de laboratoire dédiée, des lunettes de sécurité, un masque facial jetable, des chaussures fermées et des pantalons longs.
- Préparation de la solution stock
- Placez un tampon imbibé de la substance inactivante dans la hotte pour éviter toute contamination en cas de déversement. Assurez-vous que la hotte fonctionne correctement avant de commencer. Préparez un récipient avec la solution inactivante pour éliminer les embouts de pipette.
- Resuspendez la poudre lyophilisée de citrate stérile TTX selon les instructions du fabricant par un titrage extrêmement prudent et lent avec du liquide céphalorachidien artificiel stérile, en rinçant les parois du flacon dans le processus. Évitez la formation de mousse et d’aérosol. Suivez une technique aseptique pour éviter la contamination de la solution de TTX car elle sera injectée dans le cerveau d’animaux vivants. Utilisez une seringue avec une aiguille au lieu d’une micropipette si vos flacons TTX ont une membrane externe pour empêcher la formation d’aérosols.
- Aliquoter la solution d’emballage dans des micro-tubes stériles. Rendre les aliquotes aussi petites que possible, car les cycles de congélation / décongélation peuvent altérer la stabilité des molécules. Ne remplissez pas plus de la moitié des tubes, car l’eau augmente en volume lorsqu’elle est congelée, ce qui peut entraîner l’ouverture du couvercle et la contamination du tube et d’autres échantillons stockés dans le récipient.
- Décontaminer l’extérieur des tubes et les surfaces où le TTX a été utilisé avec la substance inactivante. Conservez les tubes à -20 °C dans une boîte à flacons à l’intérieur d’un récipient secondaire.
- Diluer la solution stock à une concentration de travail
- Préparez des solutions fraîchement diluées le jour où elles seront utilisées, car les solutions diluées sont moins stables. Placez un tampon imbibé de la substance inactivante dans la hotte et un micro-tube-rack sur le dessus. Préparez un récipient avec la solution inactivante pour éliminer les embouts de pipette.
- Pipeter la solution principale au fond d’un microtube stérile, puis ajouter la quantité calculée de liquide céphalorachidien artificiel pour obtenir une concentration de 10 ng/μL. Comme décrit pour la re-suspension de la poudre TTX, effectuez un titrage extrêmement soigneux et lent, en rinçant les parois du flacon et en évitant la formation de mousse et d’aérosol.
- Si des échantillons qui ont été sur le congélateur doivent être utilisés pour la micro-injection, ils doivent être autorisés à s’équilibrer à température ambiante pendant au moins une heure avant l’expérience.
7. Microinjection de TTX ou de solutions de véhicules dans des rats en mouvement libre
- Configurez la pompe à micro-injection avec le débit de perfusion et le temps total d’injection en fonction de l’expérience. Calculez ces paramètres à l’avance en tenant compte du volume occupé par la structure cible et de la quantité de solution à injecter. Pour cette expérience, injecter 200 nL de solution à raison de 50 nL par minute pendant un temps total de perfusion de 4 minutes.
- Remplissez deux seringues Hamilton de 10 μL avec de l’eau distillée stérile, insérez un morceau de tube stérile en téflon dans le connecteur de tuyau de chaque micro-injecteur, en veillant à ce que la longueur du tube ne limite pas le mouvement du rat (le tube peut être stérilisé à l’aide d’oxyde d’éthylène).
- Placez un tampon imbibé de la substance inactivante et un carré de film de paraffine de 2 cm x 2 cm au-dessus. Pipettez une quantité suffisante de TTX pour remplir l’aiguille de l’injecteur et 1 cm du tube au-dessus du film. Absorbez la goutte TTX en rétractant doucement le piston. Montez les seringues dans la pompe à micro-injection et utilisez ses commandes pour manipuler le piston jusqu’à ce qu’une goutte de TTX puisse être vue à l’extrémité de chaque micro-injecteur. Jetez les gouttes dans le tampon imbibé de substance inactivante.
- Sélectionnez les rats qui seront microinjectés. Utilisez uniquement des rats qui ont montré au moins trois cycles consécutifs après la chirurgie. Considérez leur stade du cycle et l’heure de la journée. L’heure et le stade dépendent de l’hypothèse spécifique que vous allez tester, pour cette expérience 14:00 heures de proestrus sélectionné puisque les signaux préovulatoires nerveux régissant la sécrétion phasique de GnRH se produisent en ce moment. Transportez-les dans la pièce où l’injection aura lieu à l’intérieur de leurs propres cages de logement pour éviter la détresse.
- Tenez le rat avec une poignée ferme, retirez le capuchon et les obturateurs des canules, insérez les micro-injecteurs dans les canules de guidage et ramenez l’animal dans la cage.
- Allumez la pompe et attendez que la micro-injection se termine. Observez l’animal pendant cette période afin de détecter un éventuel détachement des micro-injecteurs et d’éviter la torsion des tubes en téflon.
- Laissez les micro-injecteurs en place pendant deux minutes supplémentaires pour éviter le reflux de la solution. Retirez-les, nettoyez la surface de l’implant avec une solution antiseptique d’iodopovidone, en évitant son écoulement à l’intérieur des canules de guidage. Insérez des obturateurs stériles, mettez le capuchon et ramenez l’animal dans la salle de la colonie. Observez l’animal périodiquement pour détecter les effets secondaires possibles du médicament.
- Allumez la pompe avec les mêmes paramètres que pendant la micro-injection et vérifiez qu’un débit correct est maintenu pour vous assurer que la perméabilité du système a été conservée pendant la procédure.
- Appuyez sur le piston pour expulser le TTX/véhicule hors du micro-injecteur jusqu’à ce que la bulle d’air atteigne le bout de l’aiguille. Rappelez-vous le TTX dans son microtube. Remplissez la seringue avec de l’eau distillée et utilisez-la pour nettoyer l’intérieur des tubes. Jetez l’eau dans la substance inactivante et répétez ce processus au moins trois fois. Nettoyez l’extérieur des seringues, des tubes et des micro-injecteurs avec un chiffon imbibé de la substance inactivante.
8. Euthanasie et traitement des tissus
- Le jour de l’oestrus prédit ou confirmé par voie vaginale, injecter au rat un surdosage intrapéritonéal de pentobarbital de sodium (75 mg / kg). Vérifier la perte de conscience et injecter 200 nL d’une solution de bleu de méthylène à 0,5 % à travers les canules guides décrites aux étapes 7.1 à 7.9. Vérifiez les signes de douleur à l’aide du test de pincement des orteils ou de la queue et, si aucun n’est détecté, décapitez le rat à l’aide d’une guillotine de rongeur.
- Utilisez des ciseaux pour ouvrir la cavité abdominale et trouver les ovaires. Utilisez de fins ciseaux à iris pour disséquer chaque ovaire, en coupant à la jonction utéro-tubaire à l’aide d’une loupe. Évitez d’endommager l’oviducte car cela entraînera la perte d’ovocytes.
- Placez les ovaires sous un stéréomicroscope et utilisez une lame de rasoir pour enlever tout le tissu adipeux sans endommager l’organe. Retirez l’oviducte de chaque ovaire en coupant avec la lame de rasoir aussi loin que possible de la région de l’ampoule. Montez chaque oviducte sur un toboggan différent et couvrez-le d’une goutte d’eau. Conservez les ovaires dans un flacon contenant la solution de Bouin.
- Séchez doucement les oviductes avec une serviette en papier absorbante et recherchez l’ampoule sous le stéréomicroscope. Avec la main non dominante, maintenez l’oviducte en place en pinçant loin de l’ampoule avec une aiguille de 23 G, puis utilisez une autre aiguille de 23 G dans la main dominante pour faire une incision de 1 mm dans la région médiane de l’ampoule. Les complexes cumulus-ovocytes dépasseront de l’incision sous la forme d’une goutte de liquide visqueux(Figure 2D). Utilisez l’aiguille dans la main dominante pour tirer doucement et lentement la goutte loin de l’oviducte. Appuyez sur le reste de l’ampoule pour vous assurer qu’aucun ovocyte n’est laissé à l’intérieur. Extraire les ovocytes des oviductes aussi rapidement que possible car la dessiccation de l’oviducte piège irréversiblement les ovocytes à l’intérieur.
- Retirez l’oviducte de la lame et attendez que la goutte de liquide contenant les ovocytes sèche. Colorez l’échantillon avec de l’hématoxyline-éosine. Utilisez un support de montage pour le glissement du couvercle. Observez au microscope (10x) pour déterminer le nombre d’ovocytes excrétés par chaque ovaire.
REMARQUE: Le sacrifice par perfusion cardiaque n’est pas effectué dans ce protocole car les ovocytes seraient piégés dans les oviductes et donc des méthodes histologiques seraient nécessaires pour évaluer l’ovulation. Si l’utilisateur doit perfuser pour analyser d’autres tissus, les ovaires peuvent être enlevés en premier et les artères descendantes serrées avec des hémostats épais sous le foie pour éviter les fuites de fixateur. - Retirez la peau de la tête et immergez le crâne dans un récipient en verre avec une solution de forcline à 10%. Permettre la fixation de la tête pendant au moins dix jours avant de retirer la canule pour éviter toute distorsion du tissu. Pour retirer la canule, utilisez des ciseaux pour détacher tous les muscles de la région du crâne qui l’entoure. Coupez entre les os nasaux et frontaux avec des coupe-os, puis retirez l’os occipital. Insérez la pointe des tondeuses dans le foramen magnum et commencez à couper à travers les crêtes sagnitales jusqu’au reste de l’os nasal.
- La région isolée du sommet du crâne doit contenir les os frontaux et pariétaux. Retirez la canule implantée attachée au sommet du crâne en la tirant lentement perpendiculairement à la tête. Coupez toute partie attachée des méninges avec de fins ciseaux à iris pour éviter la déformation du cerveau.
- Faites une coupe antérieure-postérieure sur les méninges et mettez-les de côté pour retirer le cerveau de la base du crâne. Insérez une pince à épile émoussée sous les bulbes olfactifs et tirez doucement le cerveau vers le haut jusqu’à ce que les nerfs optiques soient visibles. Coupez les nerfs avec de fins ciseaux à iris et retirez le cerveau. Préserver le cerveau en solution fixatrice.
- Obtenez des sections du cerveau de 50 μm d’épaisseur à l’aide d’un vibratome, montez-les dans des lames enduites de poly-L-lysine (0,1% dans de l’eau distillée) et colorez avec la technique Nissl. Observez les lames au microscope (10x) pour déterminer la position finale des canules(Figure 2A-2C)et la propagation du colorant à l’aide d’un atlas du cerveau de rat27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le protocole décrit ci-dessus a été testé en évaluant les effets d’un seul TTX ou véhicule (liquide céphalorachidien artificiel; ACSF) microinjection dans l’un des deux noyaux différents connus pour être impliqués dans la régulation de l’ovulation chez le rat: le noyau suprachiasmatique et le noyau arquié. Le noyau suprachiasmatique a été choisi car il contient le stimulateur circadien central chez les mammifères. Il est impliqué dans la régulation des événements cycliques comme la sécrétion de gonadotrophines. Le noyau arqué a été choisi parce qu’il contient une population de neurones qui expriment les récepteurs de l’œstradiol, ce qui stimule la sécrétion de GnRH pendant la majeure partie du cycle œstre. La microinjection a été effectuée à 14h00 du stade proestrus, qui est une période connue sous le nom de « fenêtre critique » en raison de l’apparition de nombreux mécanismes centraux régulant la libération pré-ovulatoire des gonadotrophines. Après le traitement, des frottis vaginaux ont été prélevés tous les jours et les rats ont été euthanasiés à 09h00 du jour prévu de l’œsre, ce qui a coïncidé avec un frottis vaginal caractéristique de l’œsre. Comme groupe témoin supplémentaire, cinq rats intacts euthanasiés au stade de l’œstrus ont été utilisés. La fraction des animaux cyclistes après la chirurgie et la fraction des rats ovulants de chaque groupe (rats ovulants / n) ont été calculées et analysées à l’aide du test de probabilité exact de Fisher. Le nombre d’ovules excrétés par les deux ovaires a été analysé par le test de Kruskal-Wallis, suivi du test de Dunn. Des tests statistiques appropriés ont été effectués pour s’assurer que la taille de l’échantillon était adéquate.
Au total, 30 rats femelles ont été implantés avec des canules guides visant l’une des deux zones cibles. Comme le montre la figure 3,tous les animaux étaient cycliques avant la chirurgie, mais seulement sept d’entre eux n’ont pas montré d’altérations du cycle œstrous après la procédure de canulation. Vingt-trois animaux ont montré des altérations transitoires de leurs cycles, caractérisées par une augmentation du nombre de jours avec des frottis leucocytaires. De telles altérations sont probablement dues au stress induit par la chirurgie et diminuent progressivement. Au cinquième cycle, vingt-huit rats ont été considérés comme cycliques et les deux autres ont été écartés de l’expérience. Ce résultat montre qu’après un temps de récupération de quatre cycles œstéraux (16 jours), la plupart des animaux cannulés conviennent à d’autres expérimentations.
La figure 4A et la figure 4B illustrent le pourcentage d’animaux ovovants et le nombre d’ovules excrétés, respectivement, par des animaux intacts et par les groupes traités avec ACSF ou TTX dans le noyau suprachiasmatique. Tous les rats intacts ont ovulé et il en a été de même pour le groupe ACSF. Cependant, aucun des animaux microinjectés avec TTX n’a ovulé. L’injection du véhicule n’a pas modifié le nombre d’ovules excrétés. Cependant, il serait intéressant d’évaluer la viabilité et la qualité des ovocytes libérés. Des résultats similaires peuvent être observés sur la figure 4C et la figure 4D pour les rats microinjectés dans le noyau arqueux. Dans les deux cas, cette méthode a prouvé la participation d’une région cérébrale discrète dans la régulation de l’ovulation à la fenêtre critique du stade proestrus, ce qui a d’abord été déduit des études sur les lésions mais non confirmé. Les effets de la microinjection TTX semblent être transitoires plutôt que permanents puisqu’une expérience précédente a montré que des rats injectés dans le noyau suprachiasmatique en dehors de la « fenêtre critique » ovulaient au jour prévu de l’oesre26. Cependant, l’inclusion de groupes témoins dans lesquels les animaux sont sacrifiés dans les 24 heures ou jusqu’à ce qu’un frottis vaginal clair d’oesrus soit atteint est également recommandée pour résoudre ce problème.
Les résultats de la figure 5A-B représentent l’issue ovulatoire des animaux traités par ACSF ou TTX. Cependant, comme déterminé après confirmation histologique, leurs canules étaient situées à l’extérieur de la région prévue. La plupart de ces canules ont été placées dans la commissure antérieure ou la zone rétrochiasmatique, deux zones qui ne contribuent pas à la régulation de l’ovulation. Ces deux structures ainsi que le noyau suprachiasmatique et le noyau arqué sont très proches du troisième ventricule, étant donné que l’on s’attendrait à un blocage de l’ovulation chez tous les animaux si le médicament fuyait dans le ventricule. Le fait que la micro-injection de TTX à l’extérieur des cibles n’ait pas réussi à bloquer l’ovulation suggère que le volume de TTX perfusé à la vitesse sélectionnée n’a pas coulé dans le ventricule, révélant ainsi les effets spécifiques à la région de TTX. À l’appui de cette idée, l’analyse histologique des tranches de cerveau n’a montré que des neurones colorés près de l’extrémité des canules guides. Cependant, nous devons préciser qu’aucune évaluation directe de la propagation du médicament n’a été effectuée et que cette conclusion devrait donc être traitée plus avant.
Figure 1 : Frottis vaginaux représentatifs de chaque étape du cycle œstrous du rat. L’œstrus (A) est caractérisé par la présence de cellules cornifiées épithéliales sans noyau qui peuvent être trouvées soit seules de former cumuleuses à la suite de la desquamation épithéliale. Dans le metestrus (B) certaines de ces cellules cornifiées peuvent encore être présentes, mais sont surpassées en nombre par les leucocytes, qui sont également le type de cellule prédominant dans Diestrus (C). Les échantillons de Proestrus (D) sont caractérisés par leur consistance visqueuse et la prédominance des cellules nucléées épithéliales. La barre d’échelle dans chaque panneau représente 10 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.
Figure 2 : Examen histologique des échantillons après euthanasie. Sections coronales cérébrales au niveau du noyau arqué (ARC) et de la région de l’éminence médiane (EM) d’un rat intact(A),d’un rat cannulé bilatéralement(B)et d’un rat avec une canule mal placée(C). Les astérisques pointent vers la zone où se trouvaient la pointe des canules guides, dans B les extrémités où se trouvait à la marge basale du noyau ventromédian (VMH) permettant aux injecteurs saillants d’atteindre la marge supérieure de l’ARC. En C, une canule était située à l’intérieur du troisième ventricule (3V), ce qui entraînait une microinjection ventriculaire non localisée. Il s’agit d’une erreur courante lorsque la cible est située près de la ligne médiane et que les données de ces animaux doivent être jetées. Lorsqu’elle est effectuée correctement, l’extraction des ovocytes doit entraîner une seule goutte de liquide visqueux contenant tous les ovocytes de l’oviducte examiné comme indiqué dans le panneau (D). La barre d’échelle dans chaque panneau représente 500 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : Pourcentage cumulatif d’animaux cycliques avant et après l’implantation de la canule (***p≤0,0001; **p=0,0003 par rapport au cycle avant la chirurgie, test de probabilité exact de Fisher). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Pourcentage d’animaux ovulants et médiane avec intervalle interquartile (barres d’erreur) du nombre d’ovules excrétés par les animaux microinjectés dans la structure cible #1 (noyau suprachiasmatique, A-B) ou #2 (noyau arqué, C-D) avec du liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) ou de la tétrodotoxine (TTX) à 14:00 du stade proestrus. Le groupe intact a été ajouté à chaque graphique à des fins de comparaison et le nombre à l’intérieur des barres représente la fraction des femelles en ovulation (***p≤0,01 vs groupes Intact et ACSF, test de probabilité exact de Fisher et test de Kruskal-Wallis, respectivement). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Pourcentage d’animaux ovulants (A) et médiane avec intervalle interquartile (barres d’erreur) du nombre d’ovules excrétés (B) par des animaux dont les canules ont été déterminées à l’extérieur des zones cibles. Ces animaux ont été microinjectés avec du liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) ou de la tétrodotoxine (TTX) à 14h00 de proestrus. Le groupe intact a été ajouté à chaque graphique à des fins de comparaison et le nombre à l’intérieur des barres représente la fraction des femelles en ovulation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cet article décrit une méthode pour inactiver transitoirement, à un moment donné, une région discrète dans le cerveau de rats éveillés et non captés. Une méthode simple pour suivre leur cycle œstrous et évaluer l’ovulation est également fournie. Ce protocole permet une analyse simple de la contribution de régions cérébrales spécifiques aux mécanismes qui conduisent à l’ovulation en comparant le résultat ovulatoire des animaux traités par TTX avec celui des animaux traités par véhicule. À l’exception de l’instrument stéréotaxique et de la pompe à micro-injection, qui sont courants dans les laboratoires de neurosciences, cette méthode ne nécessite pas de matériaux coûteux. Les canules et micro-injecteurs commerciaux sont le choix habituel pour ce type d’expérience, mais le système facile à construire décrit ici réduit les coûts et les résultats sont indiscernables. En utilisant ce protocole et les matériaux énumérés dans le tableau qui accompagnent cet article, dix fois plus de canules peuvent être fabriquées en dépensant la même somme d’argent qu’un kit commercial pour dix animaux coûterait. La construction de dix canules bilatérales, quelle que soit la personnalisation requise pour l’étude, peut être réalisée en quelques heures. De plus, tous les composants sont réutilisables, ce qui augmente la rentabilité.
En plus du rapport bénéfice-coût, ce protocole convient à tout environnement de laboratoire car il peut être effectué par n’importe quel personnel, y compris les étudiants, ayant des connaissances sur la manipulation des rongeurs, la chirurgie stéréotaxique et la manipulation des toxines biologiques et des déchets connexes. En outre, il peut être adapté pour être utilisé dans toutes les espèces de rongeurs et autres petits mammifères, y compris les lapins, les furets, les ouistitis et même chez les espèces non mammifères telles que les oiseaux et les reptiles. Outre les caractéristiques notées ci-dessus, le principal avantage de ce protocole est qu’il peut être facilement adapté à l’étude d’autres processus sous la régulation du cerveau tels que l’activité des organes périphériques, la réponse homéostatique aux défis environnementaux et divers comportements.
Plusieurs étapes critiques doivent être effectuées avant de commencer l’expérience afin d’obtenir les résultats souhaités. Premièrement, les coordonnées de la structure ciblée doivent être calculées empiriquement, car celles rapportées dans les atlas cérébraux ne correspondront pas nécessairement aux animaux désignés pour l’étude en raison de leur souche, de leur sexe ou de leur âge. Plusieurs études ont montré que les électrodes implantées et les sondes de perfusion modifient la fonction de la zone lésée non seulement par la destruction des corps neuronaux et des fibres, mais aussi par l’activation des cellules gliales. La réaction inflammatoire qui s’initie immédiatement après l’implantation provoque généralement l’encapsulation du corps étranger par les cellules gliales. Ces cellules forment une gaine serrée qui entrave le flux des neurotransmetteurs et déplace les neurones, initiant un processus de neurodégénérescence31. Les effets délétères de la procédure d’implantation ne peuvent être évités et il faut veiller à ce que ces effets se produisent aussi loin que possible de la région du cerveau d’intérêt. Les coordonnées doivent être calculées pour placer les canules de guidage dans la zone cible uniquement si elle est suffisamment grande pour garantir que pas plus de 10% de la zone sera endommagée par la canule. Cette approche est utile, par exemple, si de grandes zones du cortex sont étudiées. Même dans ce cas, une analyse détaillée du groupe témoin doit être effectuée afin de tenir compte des effets de l’implant sur le processus d’intérêt. Pour les petites structures telles que les noyaux hypothalamiques discrets, nous conseillons aux chercheurs de calculer les coordonnées pour placer les canules guides à une distance allant de 0,5 à 2 mm de la bordure supérieure de la structure cible dans la région médiane dans les plans antérieur-postérieur et médial-latéral selon l’atlas du cerveau(Figure 2B). Pour cette approche, les injecteurs doivent être conçus pour dépasser suffisamment pour atteindre la frontière de la cible. Nous avons testé cela pour les deux noyaux décrits dans ce protocole et avons constaté que ces rats ont retrouvé leur cycle œstré et la capacité d’ovuler plus rapidement que les animaux avec des canules implantées à l’intérieur des cibles.
La solubilité des agents pharmacologiques à injecter doit être envisagée de manière à ce que la solution du véhicule soit aussi similaire que possible à celle du liquide céphalorachidien. TTX peut être acheté sous forme de poudre lyophilisée, seul ou avec du citrate. Le premier a une faible solubilité dans l’eau et un tampon acide avec un pH d’environ 5,0 est recommandé pour le reconstituer, mais cela peut introduire la possibilité d’endommager le tissu à la suite d’injections du véhicule seul. D’autre part, le citrate de TTX peut être dissous dans de l’eau ou une solution saline à 0,9%, qui sont tous deux couramment utilisés comme véhicules. Nous déconseillons l’utilisation de ces deux véhicules et suggérons d’utiliser du liquide céphalorachidien artificiel ou la solution de lactate de Ringer à la place. Une étude précédente a montré que la solution saline microinjectée dans le noyau suprachiasmatique a des effets délétères sur l’ovulation lorsqu’elle est réalisée à l’œstrus ou au diestrus26. Plusieurs articles ont rapporté que la perfusion de tissu nerveux avec des solutions qui ne correspondent pas aux caractéristiques physiques et chimiques du liquide céphalorachidien modifie l’anatomie et la physiologie des neurones et favorise les réponses inflammatoires et la mort cellulaire32,33,34,35. Compte tenu de ces résultats, l’utilisation de liquide céphalorachidien artificiel comme véhicule est fortement recommandée dans toutes les expériences impliquant la micro-injection de médicaments dans le cerveau.
Avant de commencer les expériences, les chercheurs devraient déterminer empiriquement le volume optimal de solution à injecter, car les fuites dans les structures adjacentes et la couverture insuffisante pourraient confondre l’interprétation des résultats. Cela peut être accompli en micro-injectant un colorant soluble dans l’eau dans des cubes de gélose transparente ou de gélatine. La dispersion du colorant peut ensuite être estimée et comparée à la taille attendue de la cible telle que rapportée dans l’atlas du cerveau. Néanmoins, les propriétés de la région d’intérêt du cerveau telles que sa densité cellulaire et la présence de voies fibreuses ou de bordures ventriculaires affecteront la dynamique de diffusion, et les résultats peuvent différer de ceux trouvés dans l’agar et la gélatine. En conséquence, le chercheur doit ensuite tester les paramètres obtenus in vitro dans la zone cible de quelques animaux. Plusieurs colorants ont été utilisés avec succès pour les microinjections intracérébrales chez le rat afin de délimiter la diffusion d’un volume donné de solution. Les exemples les plus courants sont le violet crésyl, le bleu thionine, le bleu de méthylène, le bleu d’Evan, le vert rapide et l’encre de Chine. Ces colorants sont dissous dans de l’eau distillée à une concentration de 0,5 % ou moins. Le bleu d’Evan a l’avantage d’être détectable dans un microscope à fluorescence (excitation à 620 nm et émission à 680 nm), permettant une analyse plus quantitative de la propagation. Les microbilles de latex peuvent également convenir à cette approche. Il est important de mentionner que des volumes supérieurs à 2,0 μL ne doivent pas être administrés dans le cerveau avec cette technique car des dommages mécaniques et des déplacements tissulaires se produiront36.
Le débit de la solution est également un facteur important à contrôler, car la micro-injection de volumes élevés à grande vitesse provoque un déplacement tissulaire et des lésions mécaniques40. En outre, un taux élevé de perfusion augmente également la propagation du médicament, entraînant l’inactivation des structures voisines. Jusqu’à trois fois plus de la surface couverte par une solution peut être causée par la modification du débit de perfusion de 100 nL / 5 minutes à 100 nL / 1 minute36. Les observations histologiques de cerveaux de rats injectés avec du bleu de méthylène indiquent qu’un débit de perfusion de 50 nL / minute ne déplace pas le tissu tout en confinant le médicament dans la zone cible (observations personnelles). Cela n’a été testé qu’avec des volumes égaux ou inférieurs à 200 nL et les chercheurs doivent donc mener des expériences pilotes si des volumes plus importants sont utilisés.
Une fois le volume de travail déterminé, il est également recommandé d’évaluer la propagation sur chaque animal. Cela peut être fait en co-injectant un colorant avec les médicaments ou en l’injectant quelques minutes avant l’euthanasie, comme décrit dans ce protocole. Le premier modèle permet au colorant de se propager avec la toxine, fournissant ainsi une évaluation plus précise de la zone touchée. Un inconvénient de cette méthode est que le colorant peut interférer avec l’activité du médicament et peut également être cytotoxique. Enfin, la clairance du tissu nerveux peut se produire si l’animal doit survivre pendant plusieurs jours après la procédure d’injection, ce qui affecterait l’estimation de la propagation. Si cette approche est utilisée, les effets du colorant sur le procédé à l’étude doivent être pris en compte en comparant le résultat du groupe véhicule+colorant avec celui des animaux intacts. Si l’injection du colorant a lieu avant l’euthanasie, il est recommandé de le faire en suivant les mêmes paramètres que pendant la microinjection (débit et volume de perfusion). Cela doit être effectué au moins 10 minutes avant l’euthanasie pour permettre la propagation de la solution. Avec cette méthode, il a été constaté que 200 nL d’une solution de TTX/bleu de méthylène recouvrent une sphère de 0,6 mm de diamètre et que la dispersion ne change pas de manière significative si la microinjection a lieu 1 heure avant le sacrifice (observation personnelle). Ceci est en accord avec l’étude de Freund et ses collègues37, ainsi que celle de Zhuravin et Bures38, qui ont tous deux constaté que 1 μL de solution de TTX se propage dans un volume de forme sphérique d’un diamètre d’environ 3 mm. En général, il a été démontré que la dispersion du médicament dépend de son poids moléculaire et du volume injecté,39 et les résultats indiqués ci-dessus correspondent à la diffusion de colorants d’un poids moléculaire similaire à celui du TTX. Si un contrôle plus précis de la dispersion est nécessaire, l’injection de TTX radiomarqué ou la mise en œuvre de l’immunohistochimie contre le TTX régulier avec des anticorps disponibles dans le commerce peut être effectuée37. Outre une meilleure délimitation de la zone couverte par le médicament, ces deux approches sont limitées par l’élimination du TTX du tissu, qui doit être prise en compte si l’animal doit survivre plusieurs jours après la microinjection, d’autre part, le travail et l’élimination des matières radioactives introduiront de nouvelles étapes et des problèmes de sécurité qui ne pourraient pas être compatibles avec tous les laboratoires et protocoles.
L’inclusion d’un groupe témoin composé d’animaux injectés dans une zone du cerveau qui n’a pas de rôle dans la régulation du processus étudié est recommandée. Ce groupe aidera le chercheur à déterminer la spécificité de la zone cible dans la régulation de ce processus et écartera la possibilité que les médicaments, injectés dans n’importe quelle structure, puissent déclencher un signal de blocage basé sur un mécanisme plus répandu tel que l’activation du stress ou de l’axe immunitaire. Étant donné que même les chirurgiens stéréotaxiques les plus expérimentés ne sont pas en mesure d’obtenir un taux de réussite de 100% lorsque de petites structures sont ciblées, ces expériences sont généralement accompagnées de canules placées en dehors de la structure souhaitée et, par conséquent, ce groupe témoin est atteint involontairement. Les résultats des animaux chez lesquels la canule a été égarée sont précieux et ne doivent pas être jetés; au lieu de cela, une analyse complète doit être effectuée en tenant compte de la zone injectée et de la dispersion de la drogue. Les résultats qui montrent un effet différent (ou aucun) chez les animaux injectés dans des régions proches des cibles sont particulièrement intéressants.
Ce protocole a des limites inhérentes au placement chronique des canules. Il n’est pas possible d’éviter la destruction permanente des fibres de passage et des corps neuronaux dans la trajectoire de la canule. L’utilisation de capillaires en verre d’un diamètre de pointe de quelques micromètres est la méthode de choix pour délivrer des médicaments dans le cerveau avec un minimum de dommages aux tissus41. Cette méthodologie, cependant, a été principalement utilisée dans des expériences dans lesquelles l’animal est anesthésié et / ou la tête est attachée à l’appareil stéréotaxique ou à d’autres dispositifs de support. Cela est principalement dû à la fragilité du capillaire lui-même, ce qui rend difficile de l’attacher à un animal éveillé et sans retenue. Un système utilisant des capillaires en verre reliés à des pompes osmotiques, au lieu de canules guides, a montré une amélioration considérable de la quantité de tissu cérébral endommagé et de la réponse gliale à la blessure42. Dans ce système, cependant, la perfusion des médicaments est chronique plutôt que chronométrée et n’est donc pas utile dans les expériences dans lesquelles le temps d’injection doit être contrôlé avec précision. Un système de micro-injection basé sur un capillaire en verre inséré dans la zone cible à travers une canule guide précédemment implantée a été décrit par Akinori et ses collègues43. Ce système permet l’injection d’un animal éveillé au moment souhaité, mais il n’est pas très robuste et l’animal doit être restreint pendant la procédure, ce qui peut entraîner l’activation de la réponse au stress. Dans ce protocole, les effets des dommages au tissu nerveux sur la trajectoire de la canule guide peuvent être contrôlés en comparant les groupes intacts et les groupes de véhicules. Ici, il a été montré un résultat ovulatoire similaire pour les deux groupes, et il a été conclu que le tissu affecté, ainsi que l’injection du véhicule n’interféraient pas avec l’ovulation. Les chercheurs doivent mener des études pilotes pour déterminer si les structures situées dorsalement à leur zone cible, qui serait détruite par la canule, sont impliquées dans la régulation du processus étudié. Néanmoins, une orientation future prometteuse pour ce travail consiste à concevoir un système de livraison qui capitalise sur les forces des canules de guidage et des capillaires en verre.
Une autre considération importante pour les chercheurs est le moment de l’action de TTX. Zhuravin et Bures38 ont montré que TTX prend quelques minutes pour atteindre un blocage maximal de la transmission neuronale, qui dure environ une heure et demie, diminuant progressivement sur plusieurs heures. Cela fait du TTX le médicament de choix lorsqu’une inactivation de longue durée est nécessaire. Si l’expérience nécessite une inactivation plus rapide, des anesthésiques locaux tels que la lidocaïne peuvent être utilisés car il ne faut que quelques secondes pour atteindre un blocage maximal. Les effets de ce médicament durent moins de 20 minutes, offrant une résolution temporelle plus fine que TTX. Les caractéristiques énoncées ci-dessus font de TTX un bon outil pour les expériences exploratoires qui étudient la présence de signaux neuronaux générés dans des fenêtres temporelles moins bien définies. La lidocaïne, d’autre part, est utile pour délimiter cette fenêtre44. Un inconvénient des deux médicaments est qu’ils bloquent la transmission des potentiels d’action dans les fibres de passage, introduisant des artefacts dans l’interprétation des données puisque le signal pourrait potentiellement provenir d’une structure différente qui envoie des projections axonales à la zone injectée. Dans ce cas, une analyse minutieuse des injections déterminées à l’extérieur de la zone cible est très importante. Par exemple, dans cet article, il a été montré que la perfusion de TTX dans la zone juste avant le noyau suprachiasmatique et dans la région entre celui-ci et le noyau arqué ne bloquait pas l’ovulation. De tels résultats ont révélé que les fibres et les cellules de ces régions ne sont pas impliquées dans la régulation de l’ovulation, ce qui était inattendu en raison de la présence d’un réseau réciproque de fibres reliant le noyau suprachiasmatique au noyau arquié et aux régions antérieures contenant des neurones De la GnRH.
Une alternative qui ne bloque pas la transmission le long des fibres de passage dans la zone injectée est l’utilisation de cations divalents tels que le cobalt et le magnésium, qui inhibent tous deux la libération de neurotransmetteurs par les terminaux présynaptiques. Le problème avec cette approche, cependant, est le temps très court de l’action inactivante et la toxicité élevée44. D’autres options pour éviter le blocage des fibres sont les approches optogénétiques et chimiogénétiques, qui sont toutes deux des stratégies pour la manipulation de l’activité de populations neuronales spécifiques. La sélectivité est obtenue en transfectant les neurones avec des vecteurs viraux conçus pour insérer des séquences qui codifient soit pour les opsines liées aux canaux ioniques, soit pour les récepteurs modifiés exprimés sous des promoteurs spécifiques. La micro-injection du vecteur est réalisée chez des animaux anesthésisés à l’aide de capillaires en verre, provoquant peu de perturbations des tissus environnants. L’implantation de fibres optiques ou l’injection systémique de drogues synthétiques permet une manipulation très précise de la population cible45. Ces techniques se sont avérées utiles dans une étude, soit seules, soit en conjonction avec des techniques telles que la microinjection TTX présentée dans ce protocole46. Néanmoins, plusieurs aspects de ces méthodes doivent être pris en compte pour concevoir des expériences réussies, notamment la validation de la spécificité de l’expression, le contrôle du nombre de cellules transfectées, l’évaluation de la toxicité et l’évaluation des effets secondaires de la lumière et de la stimulation chimique.
Les éléments critiques de ce protocole comprenaient la détermination appropriée du stade du cycle œstrous pour chaque animal. Pour mener à bien cette procédure, il est essentiel d’obtenir des échantillons de qualité de l’épithélium vaginal et d’interpréter correctement les résultats (nous vous conseillons de suivre la figure 1). De plus, les chercheurs doivent remplir soigneusement le système d’injection pour éviter l’incorporation de bulles d’air qui pourraient entraîner l’injection de volumes inexacts de médicaments. Il est également important de surveiller les animaux pendant la microinjection pour les empêcher de mordre le tube ou d’interférer avec le système. Enfin, les chercheurs aveugles aux conditions expérimentales devraient analyser le résultat de l’ovulation, la position finale de la canule et la dispersion de la solution dans la zone cible pour s’assurer que l’interprétation des résultats est impartiale.
Ici, une méthode fiable, rentable et simple pour analyser la contribution de zones discrètes du cerveau dans la régulation de l’ovulation a été décrite. Cette procédure est effectuée chez des rats éveillés et non contrôlés, dépassant les effets délétères du blocage de la neurotransmission et les effets inhibiteurs que les hormones de stress telles que le cortisol et la corticostérone exercent sur la sécrétion de GnRH. Cette méthode est entièrement personnalisable et peut être utilisée pour délivrer n’importe quel médicament dans n’importe quelle structure du cerveau. En outre, il peut être facilement adapté aux espèces communes de rongeurs et de non-rongeurs utilisées en laboratoire. Enfin, ce protocole peut être utilisé en conjonction avec des méthodes de quantification de substances telles que les hormones et les métabolites dans le sang, l’évaluation de l’expression génique dans les cellules et les tissus, l’enregistrement de l’activité neuronale et également la performance des animaux éveillés dans des tests comportementaux pour déterminer le rôle de zones cérébrales spécifiques dans divers processus comportementaux et physiologiques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer par rapport à cet article.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Raymond Sanchez de l’Université de Washington pour son aide précieuse dans l’édition de manuscrits et à M.Sc. Georgina Cortés et M.Sc. Cintia Javier pour leur soutien technique dans la normalisation de cette technique. Nous sommes également reconnaissants aux membres des services vétérinaires de Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández et MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán pour l’excellent entretien et les soins des animaux de laboratoire. Les expériences décrites dans ce protocole ont été soutenues par le numéro de subvention DGAPA-PAPIIT : IN216015 et par le numéro de subvention CONACyT : 236908 à Roberto Domínguez. Carlos-Camilo Silva est doctorant au Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) et est soutenu par le Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Numéro de subvention: 294555).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
References
- Herbison, A. E. Control of puberty onset and fertility by gonadotropin-releasing hormone neurons. Nature Reviews Endocrinology. 12 (8), 452-466 (2016).
- Fink, G. Neuroendocrine Regulation of Pituitary Function. Neuroendocrinology in Physiology and Medicine. Conn, M., Freeman, E. , Springer Science Business Media. New York. 107-133 (2000).
- Herbison, A. E. The Gonadotropin-Releasing Hormone Pulse Generator. Endocrinology. 159 (11), 3723-3736 (2018).
- Morello, H., Taleisnik, S. Changes of the release of luteinizing hormone (LH) on the day of proestrus after lesions or stimulation of the raphe nuclei in rats. Brain Research. 360 (1-2), 311-317 (1985).
- Slusher, M. A., Critchlow, V. Effect of Midbrain Lesions on Ovulation and Adrenal Response to Stress in Female Rats. Experimental Biology and Medicine. 101 (3), 497-499 (1959).
- Sawyer, C. H., Haun, C. K., Hilliard, J., Radford, H. M., Kanematsu, S. Further Evidence for the Identity of Hypothalamic Areas Controlling Ovulation and Lactation in the Rabbit. Endocrinology. 73 (3), 338-344 (1963).
- Schiavi, R., Jutisz, M., Sakiz, E., Guillemin, R. Stimulation of Ovulation by Purified LH-Releasing Factor (LRF) in Animals Rendered Anovulatory by Hypothalamic Lesion. Experimental Biology and Medicine. 114 (2), 426-429 (1963).
- Bagga, N., Chhina, G. S., Mohan Kumar, V., Singh, B. Cholinergic activation of medial preoptic area by amygdala for ovulation in rat. Physiology & Behavior. 32 (1), 45-48 (1984).
- Barraclough, C. A., Yrarrazaval, S., Hatton, R. A Possible Hypothalamic Site of Action of Progesterone in the Facilitation of Ovulation in the Rat. Endocrinology. 75 (6), 838-845 (1964).
- Critchlow, V. Blockade of ovulation in the rat by mesencephalic lesions 1, 2. Endocrinology. 63 (5), 596-610 (1958).
- Terasawa, E., Wiegand, S. J. Effects of Hypothalamic Deafferentation on Ovulation and Estrous Cyclicity in the Female Guinea Pig. Neuroendocrinology. 26 (4), 229-248 (1978).
- Halász, B., Köves, K., Molnár, J.
- Narahashi, T.
- Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. Tetrodotoxin blockage of sodium conductance increase in lobster giant axons. The Journal of General Physiology. 47 (5), 965-974 (1964).
- Narahashi, T., Deguchi, T., Urakawa, N., Ohkubo, Y. Stabilization and rectification of muscle fiber membrane by tetrodotoxin. American Journal of Physiology-Legacy Content. 198 (5), 934-938 (1960).
- Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiological Reviews. 54 (4), 813-889 (1974).
- Ritchie, J. M., Rogart, R. B. The binding of saxitoxin and tetrodotoxin to excitable tissue. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 79 (1), 1-50 (1977).
- Bermudez-Rattoni, F., Introini-Collison, I. B., McGaugh, J. L. Reversible inactivation of the insular cortex by tetrodotoxin produces retrograde and anterograde amnesia for inhibitory avoidance and spatial learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5379-5382 (1991).
- Tang, X., Yang, L., Liu, X., Sanford, L. D. Influence of Tetrodotoxin Inactivation of the Central Nucleus of the Amygdala on Sleep and Arousal. Sleep. 28 (8), 923-930 (2005).
- Klement, D., Pašt’alková, E., Fenton, A. A. Tetrodotoxin infusions into the dorsal hippocampus block non-locomotor place recognition. Hippocampus. 15 (4), 460-471 (2005).
- Conejo, N. M., Cimadevilla, J. M., González-Pardo, H., Méndez-Couz, M., Arias, J. L. Hippocampal Inactivation with TTX Impairs Long-Term Spatial Memory Retrieval and Modifies Brain Metabolic Activity. PLoS ONE. 8 (5), 64749 (2013).
- Grimm, J., Ronald, E. Dissociation of Primary and Secondary Reward-Relevant Limbic Nuclei in an Animal Model of Relapse. Neuropsychopharmacology. 22 (5), 473-479 (2000).
- Hasegawa, H., et al. Inhibition of the preoptic area and anterior hypothalamus by tetrodotoxin alters thermoregulatory functions in exercising rats. Journal of Applied Physiology. 98 (4), 1458-1462 (2005).
- Meyer, F., Louilot, A. Early Prefrontal Functional Blockade in Rats Results in Schizophrenia-Related Anomalies in Behavior and Dopamine. Neuropsychopharmacology. 37 (10), 2233-2243 (2012).
- Rothfeld, J. M., Harlan, R. E., Shivers, B. D. Reversible disruption of lordosis via midbrain infusions of procaine and tetrodotoxin. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 25 (4), 857-863 (1986).
- Silva, C., Cortés, G. D., Javier, C. Y., Flores, A., Domínguez, R. A neural circadian signal essential for ovulation is generated in the suprachiasmatic nucleus during each stage of the estrous cycle. Experimental Physiology. , (2019).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (7th Ed). , Academic Press. California. (2014).
- Cora, M. C., Kooistra, L., Travlos, G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse. Toxicologic Pathology. 43 (6), 776-793 (2015).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS ONE. 7 (4), 35538 (2012).
- Wirtshafter, D., Asin, K., Kent, E. W. Simple technique for midline stereotaxic surgery in the rat. Physiology & Behavior. 23 (1), 409-410 (1979).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
- Kazim, S. F., Enam, S. A., Shamim, M. S. Possible detrimental effects of neurosurgical irrigation fluids on neural tissue: An evidence based analysis of various irrigants used in contemporary neurosurgical practice. International Journal of Surgery. 8 (8), 586-590 (2010).
- Miyajima, M., et al. Role of cerebrospinal fluid as perfusate in neuroendoscopic surgery: A basic investigation. Acta Neurochirurgica. 113, 103-107 (2012).
- Mori, K., et al. Potential risk of artificial cerebrospinal fluid solution without magnesium ion for cerebral irrigation and perfusion in neurosurgical practice. Neurologia Medico-Chirurgica. 53 (9), 596-600 (2013).
- Oka, K., Yamamoto, M., Nonaka, T., Tomonaga, M. The significance of artificial cerebrospinal fluid as perfusate and endoneurosurgery. Neurosurgery. 38 (4), (1996).
- James, T. A., Starr, M. S. Effects of the rate and volume of injection on the pharmacological response elicited by intraingral microapplication of drugs in the rat. Journal of Pharmacological Methods. 1 (3), 197-202 (1978).
- Freund, N., Manns, M., Rose, J. A method for the evaluation of intracranial tetrodotoxin injections. Journal of Neuroscience Methods. 186 (1), 25-28 (2010).
- Zhuravin, I. A., Bures, J. Extent of the tetrodotoxin induced blockade examined by pupillary paralysis elicited by intracerebral injection of the drug. Experimental Brain Research. 83 (3), 687-690 (1991).
- Myers, R. Injection of solutions into cerebral tissue: relation between volume and diffusion. Physiology and Behavior. 1 (2), 171-174 (1966).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal of Visualized Experiments. (46), e2082 (2010).
- McCluskey, L., Campbell, S., Anthony, D., Allan, S. M. Inflammatory responses in the rat brain in response to different methods of intra-cerebral administration. J Neuroimmunol. 194 (1-2), 27-33 (2008).
- Cunningham, M. G., O'Connor, R. P., Wong, S. E. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of VisualizedExperiments. (13), e716 (2008).
- Akinori, A., Masamichi, S., Hiroshi, T. A new device for microinjection of drugs into the lower brain stem of conscious rats: Studies on site of action of morphine. Journal of Pharmacological Methods. 2 (4), 371-378 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K.
- de Sousa, A. F., et al. Optogenetic reactivation of memory ensembles in the retrosplenial cortex induces systems consolidation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences. 116 (17), 8576-8581 (2019).
- Beppu, K., et al. Optogenetic countering of glial acidosis suppresses glial glutamate release and ischemic brain damage. Neuron. 81 (2), 314-320 (2014).
