Summary
Questo protocollo descrive la costruzione di un sistema di microiniezione a basso costo, il suo impianto stereotassico in strutture cerebrali profonde e la procedura per microiniezioni tempori di tetrodotossina in ratti svegli e sfrenati. L'obiettivo è quello di rivelare la partecipazione delle strutture ipotalamiche nella regolazione dell'ovulazione inibendo la loro attività neurale.
Abstract
Molti approcci sperimentali sono stati utilizzati per studiare il ruolo del cervello nella regolazione dell'ovulazione. Gli esempi includono la lesione e la deafferentazione dei gruppi neuronali, che sono entrambi metodi invasivi che compromettono in modo permanente l'integrità dell'area target. Questi metodi sono accompagnati da effetti collaterali che possono influenzare l'analisi dei meccanismi di regolazione acuta e temporale. L'impianto stereotassico di cannule guida mirate a specifiche regioni del cervello, seguito da un periodo di recupero, consente ai ricercatori di microiniettare diversi farmaci dopo la scomparsa degli effetti indesiderati dell'intervento chirurgico. La tetrodotossina è stata utilizzata per determinare i ruoli di diverse aree cerebrali in diversi processi fisiologici perché inibisce transitoriamente i potenziali d'azione dipendenti dal sodio, bloccando così tutta l'attività neurale nella regione bersaglio. Questo protocollo combina questo metodo con strategie per la valutazione del ciclo estrale e dell'ovulazione per rivelare il ruolo delle regioni cerebrali discrete nella regolazione dell'ovulazione in particolari momenti di un dato stadio del ciclo estrale. Ratti svegli e sfrenati (Rattus norvegicus) sono stati utilizzati per evitare gli effetti bloccanti che gli anestetici e gli ormoni dello stress esercitano sull'ovulazione. Questo protocollo può essere facilmente adattato ad altre specie, bersagli cerebrali e agenti farmacologici per studiare diversi processi fisiologici. I miglioramenti futuri a questo metodo includono la progettazione di un sistema di microiniezione che utilizza capillari di vetro di piccolo diametro invece di cannule guida. Ciò ridurrà la quantità di tessuto danneggiato durante l'impianto e diminuirà la diffusione dei farmaci infusi al di fuori dell'area target.
Introduction
L'ovulazione è il processo attraverso il quale uno o più ovociti maturi vengono rilasciati dalle ovaie una volta ogni ciclo estrale / mestruale. Poiché tutte le specie di mammiferi dipendono dalla produzione di gameti per riprodursi, la comprensione dei meccanismi che regolano l'ovulazione ha un enorme impatto in aree che vanno dalla biomedicina, all'industria del bestiame e al mantenimento delle specie in via di estinzione. L'ovulazione è regolata dall'asse ipotalamo-ipofisi-ovaio, che coinvolge diverse aree ipotalamiche ed extra-ipotalamiche, i gonadotropi nell'ipofisi anteriore e le cellule theca e granulosa che, insieme agli ovociti, formano i follicoli ovarici all'interno delle ovaie1.
I follicoli ovarici crescono, si sviluppano e infine ovulano in risposta alla secrezione tonica e fasica dell'ormone follicolo-stimolante e dell'ormone luteinizzante, le due gonadotropine secrete dai gonadotropi. Il modello di secrezione di gonadotropina è fondamentale per il corretto sviluppo follicolare e l'ovulazione ed è regolato dall'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH)1,2. Questo neuropeptide viene sintetizzato da neuroni sparsi in tutto il diencefalo basale e poi secreto alla vascolarizzazione portale che collega l'ipotalamo e l'ipofisi anteriore. L'attività secretoria dei neuroni GnRH è a sua volta modulata dall'input sinaptico derivante da diverse strutture cerebrali. Queste strutture trasmettono informazioni sullo stato dell'ambiente esterno e interno dell'organismo, compresa la disponibilità di cibo, la lunghezza del fotoperiodo e la concentrazione di ormoni nel sangue. In questo senso, modellano il modello riproduttivo di ciascuna specie e i ruoli specifici di tali strutture devono essere determinati al fine di comprendere correttamente i meccanismi che regolano l'ovulazione. Ad esempio, è stato dimostrato che la fluttuazione dei livelli di estradiolo durante il ciclo estrale regola la secrezione di GnRH; tuttavia, i neuroni GnRH non esprimono l'isoforma del recettore dell'estradiolo necessaria per rilevare tali cambiamenti. Due popolazioni di neuroni che esprimono questi recettori si trovano nella regione periventricolare rostrale del terzo ventricolo e nel nucleo arcuato, rispettivamente, e nelle sinapsi stabulanti con neuroni GnRH. Ci sono prove che suggeriscono che questi neuroni interpretano la concentrazione di estradiolo e quindi stimolano l'attività dei neuroni GnRH rilasciando kisspeptina, un potente induttore della secrezione di GnRH3.
Esperimenti che coinvolgono lesioni termiche o chimiche, così come la deafferentazione meccanica, hanno permesso ai ricercatori di determinare il coinvolgimento di diverse strutture cerebrali nella regolazione dell'ovulazione4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Questi esperimenti, tuttavia, hanno lo svantaggio di essere invasivi e traumatici, richiedendo diversi giorni di recupero prima di valutare gli effetti del trattamento, ostacolando l'analisi degli effetti acuti del trattamento. Inoltre, influenzano in modo permanente le aree mirate e interrompono altri processi fisiologici a lungo termine. A causa di questi problemi, i risultati di questi esperimenti sono solitamente oscurati dai meccanismi compensativi omeostatici nel corpo dell'animale ed estrarre informazioni accurate sulle dinamiche regolatorie temporali in cui l'area è coinvolta è piuttosto difficile.
La microiniezione di farmaci che interrompono transitoriamente l'attività dei neuroni attraverso cannule guida è un'alternativa adatta che supera gli svantaggi sopra menzionati. Le cannule possono essere posizionate in qualsiasi regione del cervello da un intervento chirurgico stereotassico, consentendo al ricercatore di iniziare il trattamento farmacologico dopo che gli effetti confondenti dell'intervento chirurgico scompaiono. La microiniezione temportica dei farmaci consente ai ricercatori di testare ipotesi riguardanti il contributo della regione a una particolare fase del processo e può essere eseguita in animali svegli trattenuti o in movimento libero. Una varietà di farmaci tra cui anestetici locali, agonisti, antagonisti, agonisti inversi e tossine biologiche come la tetrodotossina (TTX) possono essere microiniettati nella regione di interesse in momenti specifici.
TTX è una tossina biologica sintetizzata da batteri che vivono nel corpo del pesce palla e di altri vertebrati e invertebrati. TTX silenzia l'attività neurale attraverso il blocco selettivo e transitorio dei canali del sodio, che si traduce nell'inibizione dei potenziali d'azione dipendenti dal sodio. In presenza di TTX, le cellule sperimentano un'alterazione nella fase di depolarizzazione e quindi non sono eccitabili ma rimangono vive. L'effetto bloccante del TTX è spiegato dalla sua composizione molecolare: un gruppo guanidinio è in grado di passare attraverso l'aspetto extracellulare del canale del sodio, ma il resto della molecola non può passare a causa delle sue dimensioni, quindi è bloccato e blocca il canale13,14,15,16,17 . Il meccanismo d'azione del TTX ne ha permesso l'utilizzo come strumento per studiare il sistema nervoso sia in vitro che in vivo. L'iniezione intracerebrale di questa tossina è stata utilizzata per studiare il ruolo delle aree cerebrali discrete in diversi processi come la ritenzione della memoria18, sonno ed eccitazione19, il riconoscimento del luogo20, la navigazione spaziale21, l'abuso di droghe22, la termoregolazione23, lo sviluppo della schizofrenia24, il comportamento sessuale25 e la regolazione dell'ovulazione26 tra gli altri. In questo protocollo descriviamo gli effetti sull'ovulazione dell'inattivazione transitoria dei nuclei ipotalamici mediante microiniezione TTX in ratti svegli e sfrenati.
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Protocol
Le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal Comitato Etico della Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM. Questa istituzione opera in stretta conformità con le regole messicane per la manipolazione degli animali, Norma ufficiale: NOM-062-ZOO-1999, che concorda con le linee guida internazionali.
1. Costruzione di cannule bilaterali
- Estrarre l'albero in acciaio inossidabile dal mozzo di due aghi ipodermici da 23 G utilizzando una pinzetta a pressione e quindi rimuovere la colla rimanente utilizzando una lama di bisturi.
- Disegna una linea a 15 mm di distanza dall'estremità smussata degli alberi con un sottile marcatore permanente. Utilizzare una pinzetta da taglio per rimuovere le estremità smussate.
- Tenere i segmenti da 15 mm con ettostati fini e premerli perpendicolarmente con un disco di taglio attaccato a un utensile rotatorio fino a ottenere segmenti di tubi da 14 mm. Questo passaggio viene eseguito al fine di eliminare la parte occlusa degli alberi, creando estremità aperte e smussate. Infine, inserire un ago da 30 G attraverso i segmenti per eliminare qualsiasi ostruzione interna.
- Determinare la distanza tra le strutture di interesse negli emisferi sinistro e destro del cervello con l'aiuto di un atlante cerebrale27. Utilizzare l'argilla per modellare per fissare i due segmenti da 14 mm a un vetrino per microscopio e assicurarsi che entrambi siano allo stesso livello orizzontale. Osservare attraverso un micrometro oculare (10x) e regolare i segmenti con una pinzetta fine fino ad ottenere la distanza desiderata.
- Mescolare la pasta saldante con il 10% di acido cloridrico in proporzione 2:1 e aggiungere una goccia della miscela 2 mm sotto l'estremità smussata dei segmenti. Saldare entrambi i segmenti con un unico punto utilizzando un saldatore e un filo di saldatura da 0,5 mm di diametro. Assicurarsi che la saldatura non ostruisca il lume dei segmenti.
- Creare un supporto per fissare la cannula al supporto stereotassico tagliando un segmento di 10 mm di filo di acciaio inossidabile resiliente da 0,3 mm. Utilizzare l'argilla per modellare per posizionare 2 mm del filo a contatto con il punto di saldatura precedente e il resto posato sopra l'estremità smussata delle cannule. Saldare il filo alle cannule.
- Pulire la superficie delle cannule con etanolo al 70% per rimuovere l'eccesso di pasta saldante. Lavare l'interno delle cannule con acqua sterile per rimuovere le particelle metalliche. Ripetere questo processo fino a quando non è possibile rilevare particelle al microscopio con un ingrandimento di 10x.
2. Costruzione di otturatori e tappi
- Per costruire gli otturatori tagliare due segmenti da 16 mm di filo morbido rotondo in acciaio inossidabile (0,35 mm di diametro). Tenere una cannula bilaterale con emostati, perpendicolare a un banco da laboratorio, e inserire uno di questi segmenti in ciascuna cannula fino a raggiungere il banco. Piegare il resto con un angolo di 90°.
- Per i tappi tagliare due segmenti da 2 mm di tubo di silicone (diametro interno = 0,76 mm) e applicare una goccia di colla siliconica su una delle estremità di ciascun segmento. Non lasciare che la colla entri nel tubo. Lasciare asciugare per almeno 24 ore.
3. Costruzione di microiniettori
- Ripetere il passaggio 1.1, utilizzando invece aghi ipodermici da 30 G per creare gli alberi.
- Disegna una linea a 18,5 mm di distanza dall'estremità smussata degli alberi e rimuovi il residuo delle estremità smussate con una pinzetta da taglio.
- Ripetere il passaggio 1.1 con un singolo ago da 23 G per costruire adattatori tagliando due segmenti lunghi 6 mm a partire dall'estremità smussata.
- Eliminare le porzioni occluse dei segmenti da 6 mm premendoli perpendicolarmente contro il disco di taglio fino ad ottenere due adattatori da 4 mm. Eliminare qualsiasi ostruzione interna.
- Inserire l'estremità smussata dei segmenti 30 G negli adattatori. Guarda attraverso uno stereomicroscopio per assicurarti che la fine di entrambi, segmenti e adattatori, siano allo stesso livello. Applicare la colla cianoacrilata sull'articolazione distale usando un batuffolo di cotone e lasciare asciugare per 15 minuti.
- Immergere due connettori per tubi in teflon al 70% di etanolo per 5 minuti e quindi collegarli ai microiniettori attraverso gli adattatori. Attendere che il diametro dei connettori si restringa per almeno 24 ore e quindi sterilizzare il microiniettore con un metodo a bassa temperatura per evitare danni ai connettori (si consiglia la sterilizzazione con ossido di etilene).
4. Manutenzione animale e strisci vaginali
- Utilizzare ratti adulti adulti con cappuccio ciclici(Rattus norvegicus,ceppo CIIZ-V) di peso compreso tra 230 e 260 grammi. Ospita i ratti in gruppi di quattro in gabbie standard di polipropilene in una stanza con un fotoperiodo chiaro-scuro 14:10. Impostare la temperatura e l'umidità rispettivamente a 22 ± 2 °C e al 40%. Fornire cibo e acqua ad libitum.
- Prendi strisci vaginali ogni giorno tra le 10:00 e le 12:00 h.
- Sterilizzare un anello batteriologico modificato con un diametro interno di 1 mm utilizzando una lampada ad alcool e raffreddarlo con acqua sterile. Tenere il ratto con una presa sicura e introdurre 5 mm del cappio batteriologico nella vagina, toccando le sue pareti interne. Rimuovere il cappio batteriologico. In caso di successo, si vedrà una goccia nuvolosa sulla punta. Posiziona questa goccia su un vetrino per microscopio.
- Ripeti questo processo per ogni ratto sterilizzando e raffreddando il ciclo tra ogni animale.
- Dopo che le gocce si sono asciugate, macchiate con ematossilina-eosina e osservate i campioni al microscopio a 10x.
- Determinare la proporzione di leucociti, cellule nucleate epiteliali e cellule cheratinizzate su ogni striscio e classificarla secondo i criteri delle fasi del ciclo estrale riportati nella Figura 1,che concorda con la precedente letteratura28,29.
5. Impianto stereotassico delle cannule
NOTA: Eseguire l'impianto delle cannule a seguito di un regolare intervento chirurgico stereotassico asettico e nel rispetto delle norme istituzionali.
- Prima dell'intervento chirurgico
- Sterilizzare strumenti chirurgici, cannule, viti chirurgiche, otturatori, garze e tamponi di cotone in legno 24 ore prima dell'intervento chirurgico utilizzando un'autoclave a vapore. Sterilizzare le punte degli strumenti metallici tra interventi chirurgici consecutivi pulendoli con perossido di idrogeno al 10% seguito da acqua e quindi metterli in uno sterilizzatore a perle calde.
- Preparare le aree di lavoro e lo strumento stereotassico prima di rimuovere l'animale dalla stanza di casa. Preparare l'animale per l'intervento chirurgico in un'area che si trova il più lontano possibile dal tavolo operatorio per evitare la contaminazione durante la procedura.
- Pulire le aree di preparazione e chirurgia con etanolo al 70% seguito da un'applicazione di una soluzione di cloruro al 10% per dieci minuti. Pulire la base, il telaio e i manipolatori dello strumento stereotassico con il 70% di etanolo e sterilizzare le punte delle barre auricolari utilizzando uno sterilizzatore a caldo e raffreddarle ad aria prima dell'intervento chirurgico.
- Esegui l'intervento indossando un cappotto da laboratorio dedicato, maschera facciale, cofano per la testa, maniche chirurgiche, copriscarpe e guanti chirurgici. Chiedi all'assistente di preparare gli animali per l'intervento chirurgico e controllare il loro stato generale durante la procedura.
- Attaccare la cannula al supporto stereotassico. Chiedi all'assistente di portare il primo animale da operare nella stanza. Selezionare i ratti in diestro per la chirurgia, poiché le osservazioni del nostro laboratorio indicano che questi animali recuperano cicli estrali adeguati più velocemente rispetto ai ratti operati in altre fasi, probabilmente perché la risposta allo stress cambia insieme al ciclo estrale.
- Pesare l'animale e indurre l'anestesia con il 4% di isoflurano in ossigeno al 100% all'interno di una camera di induzione per ratti collegata a un vaporizzatore isoflurano. Per evitare di stressare gli animali, non preriempire la camera. Confermare un piano chirurgico di anestesia controllando la dilatazione della pupilla e la perdita di dolore misurata dai test di pizzico della coda e dell'orecchio dopo aver osservato la perdita del riflesso di raddrizzamento.
- Anestetizzare il ratto mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) se non è disponibile un vaporizzatore isoflurano.
- Rimuovere il ratto dalla camera di induzione e utilizzare un cono nasale nel tavolo di preparazione per mantenere gli effetti dell'anestesia con il 2,5% di isoflurano in ossigeno al 100%. Tagliare i capelli del cuoio capelluto con tagliacapelli e rimuovere i capelli sciolti con un rullo di pelucchi. Iniettare una dose sottocutanea preoperatoria di 2 mg/kg di Meloxicam e 5 mg/kg di Enrofloxacina rispettivamente come antinfiammatorio/analgesico e antibiotico non steroideo.
- Applicare lacrime artificiali ipromellose su ciascun occhio per evitare l'essiccazione durante l'intervento chirurgico.
- Montare l'animale nello strumento stereotassico sopra un cuscinetto riscaldante usando le orecchie senza rottura e una maschera di anestesia. Regola il morsetto del naso per assicurarti che la testa dell'animale sia piatta. Eseguire uno scrub chirurgico nella zona rasata alternando povidone-iodio con sapone e 70% di etanolo una volta e poi utilizzando povidone-iodio e 70% di etanolo due volte. Inserire un termometro rettale per registrare la temperatura dell'animale durante la procedura e quindi coprirlo con un campo chirurgico sterile.
- Durante l'intervento chirurgico
- Usa un bisturi per fare un'incisione di 2 cm nella pelle e nel muscolo nel mezzo dell'area rasata. Rimuovere il periosteo dal cranio utilizzando un batuffolo di cotone rivestito con perossido di idrogeno al 2% per rivelare bregma o lambda, i punti di riferimento che verranno utilizzati per calcolare le coordinate target. Asciugare il cranio con aria per una migliore visualizzazione del punto di riferimento.
- Utilizzare i manipolatori dello strumento stereotassico per spostare la cannula in una posizione direttamente sopra il punto di riferimento scelto. Registrare le coordinate anteriore-posteriore e mediale-laterale dallo strumento stereotassico e utilizzarle per calcolare le coordinate dell'area target secondo l'atlante cerebrale27.
- Impostare le coordinate calcolate nello strumento stereotassico e posizionare la punta della cannula sulla superficie del cranio. Registrare la coordinata dorsale-ventrale e utilizzarla per calcolare la profondità nell'area di destinazione.
- Rimuovere il braccio del manipolatore svitandolo dal telaio. Utilizzare una bava dentale attaccata a uno strumento rotatorio ad una velocità di 15.000 giri / min per lasciare un segno nel luogo in cui verrà eseguita la craniotomia. Quindi utilizzare la bava per fare tre fori, formando un triangolo equilatero attorno al segno. Questi fori non devono perforare il cranio. Inserire le viti chirurgiche nei fori, assicurandosi che siano posizionate saldamente.
- Rendere la craniotomia abbastanza ampia da adattarsi alla distanza tra le aree bersaglio in ciascun emisfero. Dovrebbe essere il più piccolo possibile di diametro ma abbastanza grande da consentire l'abbassamento della cannula senza toccare i bordi del cranio, poiché ciò modificherà la traiettoria. Eseguire la craniotomia gradualmente, applicando la pressione più bassa possibile. Il cranio del roditore ha uno spessore di pochi millimetri ed è fondamentale per preservare l'integrità dei tessuti sottostanti.
- Una volta che la dura madre è visibile, utilizzare un ago sterile da 21 G con la punta curva ad un angolo di 90° per rimuovere le schegge di osso e fare un taglio anteriore-posteriore nelle meningi. Utilizzare la tecnica Wirtshafter e colleghi30 per evitare danni al seno sagittale superiore se l'area target si trova vicino alla linea mediana.
- Posizionare il supporto con la cannula nel telaio e utilizzare il manipolatore dorsale-ventrale per raggiungere la coordinata ventrale. Controllare che l'ago non tocchi i bordi durante la discesa e aumentare il diametro della craniotomia se necessario.
NOTA: è importante che la punta delle cannule guida si concleda una regione che va da 0,5 a 2,0 mm sopra la regione di interesse. Ciò è dovuto alla reazione infiammatoria del cervello in risposta all'introduzione di corpi estranei e alla distruzione del tessuto. Ciò è particolarmente critico se la regione di interesse è piccola e la distanza di lavoro deve essere calcolata empiricamente in anticipo.
- Posizionare il supporto con la cannula nel telaio e utilizzare il manipolatore dorsale-ventrale per raggiungere la coordinata ventrale. Controllare che l'ago non tocchi i bordi durante la discesa e aumentare il diametro della craniotomia se necessario.
- Applicare il cemento dentale per attaccare la cannula al cranio e lasciarla asciugare. Assicurarsi che il cemento dentale non copra l'estremità smussata della cannula poiché ciò la ostruirà irreversibilmente. Attendere che il cemento si solidifichi completamente.
- Inserire gli otturatori per evitare ulteriori ostruzioni e per garantire la pervietà durante lo studio. Indossare il cappuccio in silicone per evitare contaminazioni.
- Dopo l'intervento chirurgico
- Sostituire i liquidi persi con un'iniezione intraperitoneale di 1,0 ml di soluzione salina sterile a una temperatura fisiologica. Metti l'animale in una gabbia di recupero con supporto termico fino a quando non si riprende dall'anestesia. Controllare periodicamente la temperatura e la frequenza focolare/respiratoria dell'animale. Gli effetti dell'isoflurano durano per alcuni minuti dopo l'interruzione del flusso di gas mentre gli effetti di ketamina / xilazina durano per 40-50 minuti.
- Fornire iniezioni post-operatorie dei farmaci antibiotici, analgesici e antinfiammatori (alle stesse dosi e vie indicate in precedenza) per 48-72 ore e ispezionare attentamente gli animali su base giornaliera per il resto dell'esperimento. Segnala qualsiasi segno di dolore, stress o perdita di peso ai servizi veterinari o a un membro qualificato del laboratorio. Non eseguire altre manipolazioni ai ratti durante questo periodo.
- Inizia a prendere strisci vaginali dopo il trattamento post-operatorio e continua a farlo fino a quando l'animale mostra tre cicli estrali consecutivi di quattro giorni.
NOTA: I cateteri giugulari cronici possono essere impiantati chirurgicamente, consentendo al ricercatore di prelevare campioni di sangue seriali per analizzare la secrezione di ormoni come estradiolo, progesterone, testosterone, ormone luteinizzante, ormone follicolo-stimolante e corticosterone. Si consiglia di posizionare un catetere di questo tipo una volta che l'animale si riprende dall'intervento chirurgico al cervello, poiché ciò migliorerà il tasso di sopravvivenza evitando anche l'intasamento del catetere che potrebbe derivare da un tempo di recupero prolungato.
6. Manipolazione della tetrodotossina e preparazione delle soluzioni
ATTENZIONE: TTX è una delle sostanze più tossiche conosciute. Agisce sui muscoli scheletrici e sul tessuto nervoso. L'intossicazione per contatto è improbabile, ma qualsiasi ferita aperta è un potenziale percorso per l'inoculazione nel corpo. Le principali preoccupazioni quando si lavora con TTX sono la puntura della pelle con strumenti affilati che sono stati a contatto con la tossina e la generazione di aerosol che possono raggiungere la bocca, gli occhi e le mucose. A seconda della dose, TTX può essere letale se inalato, ingerito o inoculato dalla pelle. Causerà una forte irritazione degli occhi. La LD50 è stata testata nei topi per via orale e endovenosa ed è rispettivamente di 334 μg/kg e 7,3 μg/kg. Non c'è antitossina disponibile in questo momento.
NOTA: La sostanza inattivante è un NaOCl all'1,0% con o senza 0,25 N NaOH o una soluzione di candeggina al 10%. L'inattivazione completa si verifica dopo un'esposizione di 30 minuti. Il TTX non può essere completamente inattivato da alcun derivato del cloruro ad una concentrazione inferiore al 10%, dall'autoclave né dalla sterilizzazione a calore secco a una temperatura inferiore a 500 °F. Tutte le procedure che coinvolgono TTX devono essere eseguite da due persone esperte che indossano paia interne ed esterne di guanti in nitrile, cappotto da laboratorio dedicato, occhiali di sicurezza, maschera facciale monouso, scarpe chiuse e pantaloni a figura intera.
- Preparazione della soluzione stock
- Posizionare un tampone imbevuto della sostanza inattivante nella cappa aspirante per evitare la contaminazione in caso di fuoriuscita. Assicurarsi che la cappa aspirante funzioni correttamente prima di iniziare. Preparare un recipiente con la soluzione inattivante per smaltire le punte delle pipette.
- Spese sterilizzate TTX citrato liofilizzato in polvere secondo le istruzioni del produttore mediante una titolazione estremamente attenta e lenta con liquido cerebrospinale artificiale sterile, risciacquando le pareti del flaconcino nel processo. Evitare la formazione di schiuma e aerosol. Seguire una tecnica asettica per evitare la contaminazione della soluzione TTX poiché verrà iniettata nel cervello di animali vivi. Utilizzare una siringa con un ago invece di una micropipetta se i flaconcini TTX hanno una membrana esterna per prevenire la formazione di aerosol.
- Aliquotare la soluzione stock in micro tubi sterili. Rendere le aliquote il più piccole possibile poiché i cicli di congelamento / scongelamento possono alterare la stabilità delle molecole. Non riempire più della metà dei tubi perché l'acqua aumenta di volume quando congelata, il che può portare all'apertura del coperchio e alla contaminazione del tubo e di altri campioni conservati nel contenitore.
- Decontaminare l'esterno dei tubi e le superfici in cui TTX è stato utilizzato con la sostanza inattivante. Conservare i tubi a -20 °C in una scatola di flaconcino all'interno di un contenitore secondario.
- Diluizione della soluzione stock a una concentrazione di lavoro
- Preparare soluzioni appena diluite il giorno in cui verranno utilizzate poiché le soluzioni diluite sono meno stabili. Posizionare un tampone imbevuto della sostanza inattivante nella cappa aspirante e un micro tube-rack sopra di esso. Preparare un recipiente con la soluzione inattivante per smaltire le punte delle pipette.
- Pipettare la soluzione stock sul fondo di un microtubo sterile e quindi aggiungere la quantità calcolata di liquido cerebrospinale artificiale per ottenere una concentrazione di 10 ng/μL. Come descritto per la ri-sospensione della polvere TTX, eseguire una titolazione estremamente attenta e lenta, risciacquando le pareti del flaconcino ed evitando la formazione di schiuma e aerosol.
- Se i campioni che sono stati sul congelatore saranno utilizzati per la microiniezione, devono essere lasciati equilibrare a temperatura ambiente per almeno un'ora prima dell'esperimento.
7. Microiniezione di soluzioni TTX o veicoli in ratti che si muovono liberamente
- Configurare la pompa di microiniezione con la velocità di infusione e il tempo totale di iniezione in base all'esperimento. Calcolare questi parametri in anticipo considerando il volume occupato dalla struttura target e la quantità di soluzione da iniettare. Per questo esperimento iniettare 200 nL di soluzione ad una velocità di 50 nL al minuto per un tempo totale di infusione di 4 minuti.
- Riempire due siringhe Hamilton da 10 μL con acqua distillata sterile, inserire un pezzo di tubo di Teflon sterile nel connettore del tubo di ciascun microiniettore, assicurandosi che la lunghezza del tubo non vincoli il movimento del ratto (il tubo può essere sterilizzato usando ossido di etilene).
- Posizionare un tampone imbevuto della sostanza inattivante e un quadrato di 2 cm x 2 cm di pellicola di paraffina sopra di esso. Pipettare una quantità sufficiente di TTX per riempire l'ago dell'iniettore e 1 cm del tubo sopra il film. Assorbire la goccia TTX ritraendo delicatamente lo stantuffo. Montare le siringhe nella pompa di microiniezione e utilizzare i suoi controlli per manipolare lo stantuffo fino a quando una goccia di TTX può essere vista sulla punta di ciascun microiniettore. Scartare le gocce nel pad imbevuto di sostanza inattivante.
- Seleziona i ratti che verranno microiniettati. Utilizzare solo ratti che hanno mostrato almeno tre cicli consecutivi dopo l'intervento chirurgico. Considera la loro fase del ciclo e l'ora del giorno. Sia il tempo che lo stadio dipendono dall'ipotesi specifica che testerai, per questo esperimento 14:00 ore di proestro selezionate poiché i segnali nervosi preovulatori che governano la secrezione fasica di GnRH si verificano in questo momento. Trasportali nella stanza in cui avverrà l'iniezione all'interno delle loro gabbie abitative per evitare angoscia.
- Tenere il ratto con una presa salda, rimuovere il cappuccio e gli otturatori dalle cannule, inserire i microiniettori nelle cannule guida e riportare l'animale nella gabbia.
- Accendere la pompa e attendere fino al termine della microiniezione. Osservare l'animale durante questo periodo al fine di rilevare un possibile distacco dei microiniettori ed evitare la torsione dei tubi in Teflon.
- Lasciare i microiniettori in posizione per altri due minuti per evitare il reflusso della soluzione. Rimuoverli, pulire la superficie dell'impianto con soluzione antisettica di iodopovidone, evitando il suo flusso all'interno delle cannule guida. Inserire otturatori sterili, indossare il cappuccio e riportare l'animale nella stanza della colonia. Osservare periodicamente l'animale per rilevare eventuali effetti collaterali del farmaco.
- Accendere la pompa con gli stessi parametri della microiniezione e verificare la disponibilità di un flusso corretto per garantire che la pervietà del sistema sia stata mantenuta durante la procedura.
- Premere lo stantuffo per espellere il TTX/veicolo dal microiniettore fino a quando la bolla d'aria raggiunge la punta dell'ago. Ricorda il TTX nel suo microtubo. Riempire la siringa con acqua distillata e usarla per pulire l'interno dei tubi. Scartare l'acqua nella sostanza inattivante e ripetere questo processo almeno tre volte. Pulire l'esterno di siringhe, tubi e microiniettori con un panno imbevuto della sostanza inattivante.
8. Eutanasia e lavorazione dei tessuti
- Il giorno dell'estro previsto o confermato vaginalmente, iniettare al ratto un sovradosaggio intraperitoneale di pentobarbital di sodio (75 mg/kg). Verificare la perdita di coscienza e iniettare 200 nL di una soluzione di blu di metilene allo 0,5% attraverso le cannule guida come descritto nei passaggi da 7.1 a 7.9. Controllare i segni di dolore utilizzando il test del pizzico della dita o della coda e, se non ne viene rilevato nessuno, decapitare il ratto usando una ghigliottina per roditori.
- Utilizzare le forbici per aprire la cavità addominale e trovare le ovaie. Utilizzare forbici dell'iride fine per sezionare ogni ovaia, tagliando alla giunzione utero-tuba con l'aiuto di una lente d'ingrandimento. Evitare di danneggiare l'ovidotto perché ciò comporterà la perdita di ovociti.
- Metti le ovaie sotto uno stereomicroscopio e usa una lama di rasoio per rimuovere tutto il tessuto adiposo senza danneggiare l'organo. Rimuovere l'ovidotto da ciascuna ovaia tagliando con la lama di rasoio il più lontano possibile dalla regione dell'ampolla. Montare ogni ovidotto su una diapositiva diversa e coprire con una goccia d'acqua. Conservare le ovaie in un flaconcino contenente la soluzione di Bouin.
- Asciugare delicatamente gli ovidotti con un tovagliolo di carta assorbente e cercare l'ampolla sotto lo stereomicroscopio. Con la mano non dominante, tenere l'ovidotto in posizione pizzicando lontano dall'ampolla con un ago da 23 G, quindi utilizzare un altro ago da 23 G nella mano dominante per praticare un'incisione di 1 mm nella regione centrale dell'ampolla. I complessi cumulo-ovocita sporgeranno dall'incisione come una goccia di liquido viscoso (Figura 2D). Utilizzare l'ago nella mano dominante per tirare delicatamente e lentamente la goccia lontano dall'ovidotto. Premere il residuo dell'ampolla per assicurarsi che nessun ovocita rimanga all'interno. Estrarre gli ovociti dagli ovidotti il più velocemente possibile poiché l'essiccazione dell'ovidotto intrappola irreversibilmente gli ovociti all'interno.
- Rimuovere l'ovidotto dal vetrino e attendere che la goccia di liquido contenente gli ovociti si asciughi. Macchiare il campione con ematossilina-eosina. Utilizzare il mezzo di montaggio per coprire lo slittamento. Osservare al microscopio (10x) per determinare il numero di ovociti versati da ciascuna ovaia.
NOTA: Il sacrificio per perfusione cardiaca non viene eseguito in questo protocollo poiché gli ovociti sarebbero intrappolati negli ovidotti e quindi sarebbero necessari metodi istologici per valutare l'ovulazione. Se l'utente deve perfondere per analizzare altri tessuti, le ovaie possono essere rimosse prima e le arterie discendenti bloccate con eremostati spessi sotto il fegato per evitare perdite di fissativo. - Rimuovere la pelle della testa e immergere il cranio in un contenitore di vetro con una soluzione di formalina al 10%. Lasciare fissare la testa per almeno dieci giorni prima di rimuovere la cannula per evitare la distorsione del tessuto. Per rimuovere la cannula, utilizzare le forbici per staccare tutti i muscoli nella regione del cranio che la circonda. Tagliare tra le ossa nasali e frontali con trimmer ossei e quindi rimuovere l'osso occipitale. Inserire la punta dei trimmer nel forame magnum e iniziare a tagliare le creste sagittali raggiungendo il residuo dell'osso nasale.
- La regione isolata della parte superiore del cranio deve contenere le ossa frontali e parietali. Rimuovere la cannula impiantata attaccata alla parte superiore del cranio tirandola lentamente verso l'alto perpendicolarmente alla testa. Tagliare qualsiasi porzione attaccata delle meningi con forbici dell'iride fini per evitare la deformazione del cervello.
- Fai un taglio anteriore-posteriore sulle meningi e mettile da parte per rimuovere il cervello dalla base del cranio. Inserire una pinzetta smussata sotto i bulbi olfattivi e tirare delicatamente su il cervello fino a quando i nervi ottici sono visibili. Taglia i nervi con le forbici dell'iride fine e tira fuori il cervello. Preservare il cervello in soluzione fissativa.
- Ottenere sezioni spesse 50 μm del cervello utilizzando un vibratoma, montarle in vetrini rivestiti di poli-L-lisina (0,1% in acqua distillata) e macchiarle con la tecnica Nissl. Osservare i vetrini al microscopio (10x) per determinare la posizione finale delle cannule (Figura 2A-2C) e la diffusione del colorante con l'aiuto di un atlante cerebrale di ratto27.
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Representative Results
Il protocollo sopra descritto è stato testato valutando gli effetti di un singolo TTX o veicolo (liquido cerebrospinale artificiale; ACSF) microiniezione in uno dei due diversi nuclei noti per essere coinvolti nella regolazione dell'ovulazione nel ratto: il nucleo soprachiasmatico e il nucleo arcuato. Il nucleo soprachiasmatico è stato scelto poiché contiene il pacemaker circadiano centrale nei mammiferi. È coinvolto nella regolazione di eventi ciclici come la secrezione di gonadotropine. Il nucleo arcuato è stato scelto perché contiene una popolazione di neuroni che esprimono i recettori dell'estradiolo, che stimola la secrezione di GnRH durante la maggior parte del ciclo estrale. La microiniezione è stata eseguita alle ore 14:00 dello stadio del proestro, che è un periodo noto come "finestra critica" a causa del verificarsi di molti dei meccanismi centrali che regolano il rilascio pre-ovulatorio di gonadotropine. Dopo il trattamento, gli strisci vaginali sono stati presi ogni giorno e i ratti sono stati sottoposti a eutanasia alle ore 09:00 del giorno previsto di estro, che ha coinciso con uno striscio vaginale caratteristico dell'estro. Come gruppo di controllo aggiuntivo, sono stati utilizzati cinque ratti intatti eutanasizzati nella fase di estro. La frazione di animali in bicicletta dopo l'intervento chirurgico e la frazione di ratti ovulanti di ciascun gruppo (ratti ovulanti / n) è stata calcolata e analizzata utilizzando il test di probabilità esatto di Fisher. Il numero di ovuli versati da entrambe le ovaie è stato analizzato dal test di Kruskal-Wallis, seguito dal test di Dunn. Sono stati eseguiti test statistici appropriati per garantire che la dimensione del campione fosse adeguata.
Un totale di 30 femmine di ratto sono state impiantate con cannule guida mirando a una delle due aree target. Come mostrato nella Figura 3,tutti gli animali erano ciclici prima dell'intervento chirurgico, ma solo sette di loro non mostravano alterazioni del ciclo estrale dopo la procedura di cannolazione. Ventitré animali hanno mostrato alterazioni transitorie dei loro cicli, caratterizzate da un aumento del numero di giorni con strisci leucocitici. Tali alterazioni sono probabilmente dovute allo stress indotto dall'intervento chirurgico e gradualmente diminuite. Al quinto ciclo ventotto ratti sono stati considerati ciclici e i restanti due sono stati scartati dall'esperimento. Questo risultato mostra che, dopo un tempo di recupero di quattro cicli estrali (16 giorni), la maggior parte degli animali cannulati sono adatti per ulteriori sperimentazioni.
La Figura 4A e la Figura 4B illustrano la percentuale di animali ovulanti e il numero di ovuli versati, rispettivamente, da animali intatti e dai gruppi trattati con ACSF o TTX nel nucleo soprachiasmatico. Tutti i ratti intatti ovulati e lo stesso valeva per il gruppo ACSF. Tuttavia, nessuno degli animali microiniettati con TTX ovulato. L'iniezione del veicolo non ha modificato il numero di ovuli versati. Tuttavia, sarebbe interessante valutare la vitalità e la qualità degli ovociti rilasciati. Risultati simili possono essere osservati nella Figura 4C e nella Figura 4D per i ratti microiniettati nel nucleo arcuato. In entrambi i casi, questo metodo ha dimostrato la partecipazione di una regione cerebrale discreta nella regolazione dell'ovulazione nella finestra critica dello stadio del proestro, che è stata inizialmente dedotta da studi sulle lesioni ma non confermata. Gli effetti della microiniezione TTX sembrano essere transitori piuttosto che permanenti poiché un precedente esperimento ha dimostrato che i ratti iniettati nel nucleo soprachiasmatico al di fuori della "finestra critica" ovulavano al giorno previsto dell'estro26. Tuttavia, l'inclusione di gruppi di controllo in cui gli animali vengono sacrificati con 24 ore o fino a quando non viene raggiunto un chiaro striscio vaginale di estro è anche raccomandato per affrontare questo problema.
I risultati nella Figura 5A-B rappresentano l'esito ovulatorio degli animali trattati con ACSF o TTX. Tuttavia, come determinato dopo la conferma istologica, le loro cannule si trovavano al di fuori della regione prevista. La maggior parte di queste cannule sono state collocate nella commessura anteriore o nell'area retrochiasmatica, due aree che non contribuiscono alla regolazione dell'ovulazione. Entrambe queste strutture insieme al soprachiasmatico e al nucleo arcuato sono molto vicine al terzo ventricolo, considerando questo, ci si aspetterebbe un blocco dell'ovulazione in tutti gli animali se il farmaco fuoriuscisse nel ventricolo. Il fatto che la microiniezione TTX al di fuori dei bersagli non sia riuscita a bloccare l'ovulazione suggerisce che il volume di TTX infuso alla velocità selezionata non è fuoriuscito nel ventricolo, rivelando così gli effetti specifici della regione del TTX. A sostegno di questa idea, l'analisi istologica delle fette di cervello ha mostrato solo neuroni macchiati vicino alla punta delle cannule guida. Tuttavia, dobbiamo chiarire che non è stata eseguita alcuna valutazione diretta della diffusione del farmaco e quindi questa conclusione dovrebbe essere ulteriormente affrontata.
Figura 1: Strisci vaginali rappresentativi di ogni fase del ciclo estrale del ratto. L'estro (A) è caratterizzato per la presenza di cellule cornificate epiteliali senza un nucleo che può essere trovato da solo o formando cumulo a seguito della desquamazione epiteliale. Nel metestro (B) alcune di queste cellule cornificate possono ancora essere presenti, ma sono in inferiorità numerica rispetto ai leucociti, che sono anche il tipo di cellula predominante in Diestro (C). I campioni di proestro (D) sono caratterizzati dalla consistenza viscosa e dalla predominanza di cellule nucleate epiteliali. La barra della scala in ogni pannello rappresenta 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esame istologico dei campioni dopo eutanasia. Sezioni coronali cerebrali nella regione del nucleo arcuato (ARC) e dell'eminenza mediana (EM) di un ratto intatto (A), un ratto bilateralmente cannulato (B) e un ratto con una cannula fuori posto (C). Gli asterischi puntano all'area in cui si trovava la punta delle cannule guida, in B le punte dove al margine basale del nucleo ventromediale (VMH) permettono agli iniettori sporgenti di raggiungere il margine superiore dell'ARC. In C una cannula si trovava all'interno del terzo ventricolo (3V), con conseguente microiniezione ventricolare non localizzata. Questo è un errore comune quando il bersaglio si trova vicino alla linea mediana e i dati di questi animali devono essere scartati. Se eseguita correttamente, l'estrazione degli ovociti dovrebbe provocare una singola goccia di liquido viscoso contenente tutti gli ovociti dell'ovidotto esaminato come si vede nel pannello (D). La barra della scala in ogni pannello rappresenta 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Percentuale cumulativa di animali in bicicletta prima e dopo l'impianto della cannula (***p≤0,0001; **p=0,0003 rispetto al ciclo prima dell'intervento chirurgico, test di probabilità esatto di Fisher). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Percentuale di animali ovulanti e mediana con intervallo interquartile (barre di errore) del numero di ovuli versati da animali microiniettati nella struttura bersaglio #1 (nucleo soprachiasmatico, A-B) o #2 (nucleo arcuato, C-D) con liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) o tetrodotossina (TTX) alle 14:00 dello stadio del proestro. Il gruppo intatto è stato aggiunto a ciascun grafico a scopo di confronto e il numero all'interno delle barre rappresenta la frazione di femmine ovulanti (***p≤0,01 vs. gruppi Intatti e ACSF, rispettivamente test di probabilità esatta di Fisher e test di Kruskal-Wallis). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Percentuale di animali ovulanti (A) e mediana con intervallo interquartile (barre di errore) del numero di ovuli versati (B) da animali le cui cannule sono state determinate al di fuori delle aree bersaglio. Questi animali sono stati microiniettati con liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) o tetrodotossina (TTX) alle 14:00 di proestro. Il gruppo intatto è stato aggiunto a ciascun grafico a scopo di confronto e il numero all'interno delle barre rappresenta la frazione di femmine ovulanti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo articolo descrive un metodo per inattivare transitoriamente, in qualsiasi momento, una regione discreta nel cervello di ratti svegli e sfrenati. Viene inoltre fornito un metodo semplice per monitorare il loro ciclo estrale e valutare l'ovulazione. Questo protocollo consente un'analisi diretta del contributo di specifiche regioni del cervello ai meccanismi che guidano l'ovulazione confrontando l'esito ovulatorio degli animali trattati con TTX con quello di quelli trattati con veicoli. Ad eccezione dello strumento stereotassico e della pompa di microiniezione, che sono comuni nei laboratori di neuroscienze, questo metodo non richiede materiali costosi. Cannule e microiniettori commerciali sono la scelta abituale per questo tipo di esperimento, ma il sistema facile da costruire qui descritto abbassa i costi e i risultati sono indistinguibili. Utilizzando questo protocollo e i materiali elencati nella tabella che accompagna questo articolo, è possibile produrre dieci volte più cannule spendendo la stessa quantità di denaro che costerebbe un kit commerciale per dieci animali. La costruzione di dieci cannule bilaterali, indipendentemente dalla personalizzazione richiesta per lo studio, può essere eseguita in poche ore. Inoltre, tutti i componenti sono riutilizzabili, il che aumenta l'efficacia dei costi.
Insieme al rapporto costi-benefici, questo protocollo è adatto a qualsiasi ambiente di laboratorio poiché può essere eseguito da qualsiasi personale, compresi gli studenti, con conoscenze di manipolazione dei roditori, chirurgia stereotassica e manipolazione delle tossine biologiche e dei relativi rifiuti. Inoltre, può essere adattato per essere utilizzato in qualsiasi specie di roditore e altri piccoli mammiferi tra cui conigli, furetti, uistitì e persino in specie non mammifere come uccelli e rettili. Oltre alle caratteristiche sopra indicate, il vantaggio principale di questo protocollo è che può essere facilmente adattato per lo studio di altri processi sotto la regolazione del cervello come l'attività degli organi periferici, la risposta omeostatica alle sfide ambientali e vari comportamenti.
Ci sono diversi passaggi critici che devono essere eseguiti prima di iniziare l'esperimento per ottenere i risultati desiderati. In primo luogo, le coordinate della struttura mirata devono essere calcolate empiricamente poiché quelle riportate negli atlanti cerebrali non corrisponderanno necessariamente agli animali designati per lo studio a causa del loro ceppo, sesso o età. Diversi studi hanno dimostrato che gli elettrodi impiantati e le sonde per infusione alterano la funzione della zona lesa non solo con la distruzione dei corpi neurali e delle fibre, ma anche con l'attivazione delle cellule gliali. La reazione infiammatoria che inizia immediatamente dopo l'impianto provoca tipicamente l'incapsulamento del corpo estraneo da parte delle cellule gliali. Queste cellule formano una guaine stretta che impedisce il flusso dei neurotrasmettitori e sposta i neuroni, avviando un processo di neurodegenerazione31. Gli effetti deleteri della procedura di impianto non possono essere evitati e si deve prestare attenzione per garantire che tali effetti si verifichino il più lontano possibile dalla regione del cervello di interesse. Le coordinate devono essere calcolate per posizionare le cannule guida nell'area di destinazione solo se è abbastanza grande da garantire che non più del 10% dell'area venga danneggiata dalla cannula. Questo approccio è utile, ad esempio, se verranno studiate ampie aree della corteccia. Anche in questo caso, è necessario eseguire un'analisi dettagliata del gruppo di controllo per tenere conto degli effetti dell'impianto sul processo di interesse. Per piccole strutture come i nuclei ipotalamici discreti, consigliamo ai ricercatori di calcolare le coordinate per posizionare le cannule guida a una distanza che va da 0,5 a 2 mm dal bordo superiore della struttura bersaglio nella regione centrale nei piani anteriore-posteriore e mediale-laterale secondo l'atlante cerebrale (Figura 2B). Per questo approccio gli iniettori devono essere progettati in modo da sporgere abbastanza da raggiungere il bordo del bersaglio. Abbiamo testato questo per i due nuclei descritti in questo protocollo e abbiamo scoperto che questi ratti hanno recuperato il loro ciclo estrale e la capacità di ovulare più velocemente degli animali con cannule impiantate all'interno dei bersagli.
La solubilità degli agenti farmacologici da iniettare deve essere considerata in modo che la soluzione del veicolo sia il più simile possibile a quella del liquido cerebrospinale. TTX può essere acquistato come polvere liofilizzata, da sola o con citrato. Il primo ha una bassa solubilità in acqua e si consiglia un tampone acido con un pH intorno a 5,0 per ricostituirlo, ma questo può introdurre la possibilità di danneggiare il tessuto a seguito di iniezioni del solo veicolo. D'altra parte, il TTX-citrato può essere sciolto in acqua o soluzione salina allo 0,9%, che sono entrambi comunemente usati come veicoli. Raccomandiamo di non utilizzare entrambi questi veicoli e suggeriamo invece di utilizzare liquido cerebrospinale artificiale o soluzione di lattato di Ringer. Uno studio precedente ha dimostrato che la soluzione salina microiniettata nel nucleo soprachiasmatico ha effetti deleteri sull'ovulazione se eseguita a estro o diestro26. Diversi articoli hanno riportato che la perfusione del tessuto nervoso con soluzioni che non corrispondono alle caratteristiche fisiche e chimiche del liquido cerebrospinale altera l'anatomia e la fisiologia dei neuroni e promuove risposte infiammatorie e morte cellulare32,33,34,35. Considerando questi risultati, l'uso di liquido cerebrospinale artificiale come veicolo è fortemente raccomandato in tutti gli esperimenti che coinvolgono la microiniezione di farmaci nel cervello.
Prima di iniziare gli esperimenti, i ricercatori dovrebbero determinare empiricamente il volume ottimale di soluzione da iniettare, poiché sia la fuoriuscita in strutture adiacenti che una copertura insufficiente potrebbero confondere l'interpretazione dei risultati. Questo può essere ottenuto microiniettando un colorante solubile in acqua in cubetti di agar o gelatina trasparenti. La dispersione del colorante può quindi essere stimata e confrontata con la dimensione prevista del bersaglio come riportato nell'atlante cerebrale. Tuttavia, le proprietà della regione cerebrale di interesse come la sua densità cellulare e la presenza di tratti di fibre o bordi ventricolari influenzeranno le dinamiche di diffusione e i risultati potrebbero differire da quelli trovati in agar e gelatina. Di conseguenza, il ricercatore deve quindi testare i parametri ottenuti in vitro nell'area target di alcuni animali. Diversi coloranti sono stati utilizzati con successo per microiniezioni intracerebrali nei ratti al fine di delineare la diffusione di un dato volume di soluzione. Gli esempi più comuni sono il viola cresile, il blu di tionina, il blu di metilene, il blu di Evan, il verde veloce e l'inchiostro dell'India. Questi coloranti vengono sciolti in acqua distillata ad una concentrazione dello 0,5% o inferiore. Il blu di Evan ha il vantaggio di essere rilevabile in un microscopio a fluorescenza (eccitazione a 620 nm ed emissione a 680 nm), consentendo un'analisi più quantitativa della diffusione. Anche le microsfere in lattice possono essere adatte a questo approccio. È importante ricordare che volumi superiori a 2,0 μL non devono essere somministrati nel cervello con questa tecnica poiché si verificheranno danni meccanici e spostamento dei tessuti36.
Anche la portata della soluzione è un fattore importante da controllare, poiché la microiniezione di volumi elevati ad alta velocità causa lo spostamento dei tessuti e lesioni meccaniche40. Inoltre, un alto tasso di infusione aumenta anche la diffusione del farmaco, con conseguente inattivazione delle strutture vicine. Fino a un triplo aumento dell'area coperta da una soluzione può essere causato dalla modifica della velocità di infusione da 100 nL/5 minuti a 100 nL/1 minuto36. Le osservazioni istologiche del cervello di ratto iniettato con blu di metilene indicano che una velocità di infusione di 50 nL / minuto non sposta il tessuto mentre confina il farmaco nell'area target (osservazioni personali). Questo è stato testato solo con volumi uguali o inferiori a 200 nL e quindi i ricercatori devono eseguire esperimenti pilota se verranno utilizzati volumi più grandi.
Una volta determinato il volume di lavoro, si raccomanda anche di valutare la diffusione su ciascun animale. Questo può essere fatto co-iniettando un colorante con i farmaci o iniettandolo pochi minuti prima dell'eutanasia, come descritto in questo protocollo. Il primo modello consente al colorante di diffondersi insieme alla tossina, fornendo così una valutazione più accurata dell'area interessata. Uno svantaggio di questo metodo è che il colorante può interferire con l'attività del farmaco e può anche essere citotossico. Infine, la clearance dal tessuto nervoso può verificarsi se l'animale ha bisogno di sopravvivere per diversi giorni dopo la procedura di iniezione, il che influenzerebbe la stima della diffusione. Se si utilizzerà questo approccio, gli effetti del colorante sul processo in studio devono essere affrontati confrontando il risultato del gruppo veicolo+colorante con quello degli animali intatti. Se l'iniezione del colorante avverrà prima dell'eutanasia, si raccomanda di farlo seguendo gli stessi parametri della microiniezione (velocità di infusione e volume). Questo deve essere eseguito almeno 10 minuti prima dell'eutanasia per consentire la diffusione della soluzione. Con questo metodo, si è scoperto che 200 nL di una soluzione di blu TTX/metilene coprono una sfera di 0,6 mm di diametro e la dispersione non cambia significativamente se la microiniezione avviene 1 ora prima del sacrificio (osservazione personale). Questo concorda con lo studio di Freund e colleghi37, così come quello di Zhuravin e Bures38, che entrambi hanno scoperto che 1 μL di soluzione TTX si diffonde in un volume di forma sferica con un diametro di circa 3 mm. In generale, è stato dimostrato che la dispersione del farmaco dipende dal suo peso molecolare e dal volume iniettato,39 e i risultati sopra indicati corrispondono alla diffusione di coloranti con un peso molecolare simile a quello del TTX. Se è necessario un controllo più accurato della dispersione, l'iniezione di TTX radiomarcato o l'implementazione di immunoistochimica contro TTX regolare con anticorpi disponibili in commercio può essere eseguita37. Oltre a una migliore delineazione dell'area coperta dal farmaco, questi due approcci sono limitati dalla clearance del TTX dal tessuto, che deve essere considerato se l'animale dovesse sopravvivere diversi giorni dopo la microiniezione, d'altra parte, lavorare e smaltire materiale radioattivo introdurrà nuovi passaggi e problemi di sicurezza che potrebbero non essere compatibili con tutti i laboratori e protocolli.
Si raccomanda l'inclusione di un gruppo di controllo costituito da animali iniettati in un'area del cervello che non ha un ruolo nella regolazione del processo studiato. Questo gruppo aiuterà il ricercatore a determinare la specificità dell'area target nella regolazione di quel processo e scarterà la possibilità che i farmaci, iniettati in qualsiasi struttura, possano innescare un segnale di blocco basato su un meccanismo più diffuso come l'attivazione dello stress o dell'asse immunitario. Poiché anche i chirurghi stereotasstici più sperimentati non sono in grado di ottenere un tasso di successo del 100% quando vengono prese di mira piccole strutture, questi esperimenti sono solitamente accompagnati da cannule poste al di fuori della struttura desiderata e quindi questo gruppo di controllo viene involontariamente raggiunto. I risultati degli animali in cui la cannula è stata smarrita sono preziosi e non devono essere scartati; invece, deve essere effettuata un'analisi completa considerando l'area iniettata e la dispersione del farmaco. Di particolare interesse sono i risultati che mostrano un effetto diverso (o nessuno) negli animali iniettati in regioni vicine agli obiettivi.
Questo protocollo ha limitazioni inerenti al posizionamento cronico di cannule. Non è possibile evitare la distruzione permanente delle fibre di passaggio e dei corpi neuronali nella traiettoria della cannula. L'uso di capillari di vetro con un diametro della punta di pochi micrometri è il metodo di scelta per consegnare farmaci nel cervello con danni minimi al tessuto41. Questa metodologia, tuttavia, è stata utilizzata principalmente in esperimenti in cui l'animale viene anestetizzato e/o la testa è attaccata all'apparato stereotassico o ad altri dispositivi di supporto. Ciò è dovuto principalmente alla fragilità del capillare stesso, che rende difficile attaccarlo a un animale sveglio e sfrenato. Un sistema che utilizza capillari di vetro collegati a pompe osmotiche, al posto delle cannule guida, ha mostrato un notevole miglioramento nella quantità di tessuto cerebrale danneggiato e nella risposta gliale alla lesione42. In questo sistema, tuttavia, l'infusione dei farmaci è cronica piuttosto che temporizzata e quindi non utile in esperimenti in cui il tempo di iniezione deve essere controllato con precisione. Un sistema di microiniezione basato su un capillare di vetro inserito nell'area target attraverso una cannula guida precedentemente impiantata è stato descritto da Akinori e colleghi43. Questo sistema consente l'iniezione di un animale sveglio al momento desiderato, ma non è molto robusto e l'animale deve essere limitato durante la procedura, il che può portare all'attivazione della risposta allo stress. In questo protocollo, gli effetti del danno al tessuto nervoso nella traiettoria della cannula guida possono essere controllati confrontando i gruppi intatti e veicolari. Qui è stato mostrato un esito ovulatorio simile per entrambi i gruppi, e si è concluso che il tessuto interessato, così come l'iniezione del veicolo non interferiva con l'ovulazione. I ricercatori devono eseguire studi pilota per determinare se le strutture situate dorsale alla loro area target, che verrebbe distrutta dalla cannula, sono coinvolte nella regolazione del processo studiato. Tuttavia, una direzione futura promettente per questo lavoro è quella di progettare un sistema di consegna che capitalizzi i punti di forza sia delle cannule guida che dei capillari di vetro.
Un'altra considerazione importante per i ricercatori è il tempo di azione di TTX. Zhuravin e Bures38 hanno dimostrato che il TTX impiega alcuni minuti per raggiungere un blocco massimo della trasmissione neurale, che dura circa un'ora e mezza, diminuendo gradualmente nell'arco di diverse ore. Questo rende TTX il farmaco di scelta quando è richiesta un'inattivazione di lunga durata. Se l'esperimento richiede un'inattivazione più rapida, è possibile utilizzare anestetici locali come la lidocaina poiché ci vogliono solo pochi secondi per raggiungere un blocco massimo. Gli effetti di questo farmaco durano meno di 20 minuti, fornendo una risoluzione temporale più fine rispetto a TTX. Le caratteristiche sopra esposte rendono TTX un buon strumento per esperimenti esplorativi che studiano la presenza di segnali neurali che vengono generati in finestre temporali meno ben definite. La lidocaina, d'altra parte, è utile per delineare questa finestra44. Uno svantaggio di entrambi i farmaci è che bloccano la trasmissione dei potenziali d'azione nelle fibre di passaggio, introducendo artefatti nell'interpretazione dei dati poiché il segnale potrebbe potenzialmente provenire da una struttura diversa che invia proiezioni assonali all'area iniettata. In questo caso, un'attenta analisi delle iniezioni determinate come al di fuori dell'area target è molto importante. Ad esempio, in questo articolo è stato dimostrato che l'infusione di TTX nell'area appena anteriore al nucleo soprachiasmatico e nella regione tra esso e il nucleo arcuato non ha bloccato l'ovulazione. Tali risultati hanno rivelato che le fibre e le cellule in quelle regioni non sono coinvolte nella regolazione dell'ovulazione, il che è stato inaspettato a causa della presenza di una rete reciproca di fibre che collega il nucleo soprachiasmatico sia con il nucleo arcuato che con le regioni anteriori contenenti neuroni GnRH.
Un'alternativa che non blocca la trasmissione lungo le fibre di passaggio nell'area iniettata è l'uso di cationi bivalenti come cobalto e magnesio, che inibiscono entrambi il rilascio di neurotrasmettitori da parte dei terminali presinaptici. Il problema con questo approccio, tuttavia, è il brevissimo tempo di azione inattivante e l'elevata tossicità44. Altre opzioni per evitare il blocco delle fibre sono gli approcci optogenetici e chemiogenetici, entrambi strategie per la manipolazione dell'attività di specifiche popolazioni neuronali. La selettività si ottiene trasfettando i neuroni con vettori virali progettati per inserire sequenze che codificano per opsina legate a canali ionici o recettori modificati espressi sotto promotori specifici. La microiniezione del vettore viene eseguita in animali anestetizzati utilizzando capillari di vetro, causando poca interruzione del tessuto circostante. L'impianto di fibre ottiche o l'iniezione sistemica di droghe sintetiche consente una manipolazione molto precisa della popolazione target45. Queste tecniche si sono rivelate utili in uno studio, da sole o in combinazione con tecniche come la microiniezione TTX presentata in questo protocollo46. Tuttavia, diversi aspetti di questi metodi devono essere considerati per progettare esperimenti di successo, tra cui la convalida della specificità dell'espressione, il controllo del numero di cellule trasfettate, la valutazione della tossicità e la valutazione degli effetti collaterali della luce e della stimolazione chimica.
I componenti critici di questo protocollo includevano una corretta determinazione dello stadio del ciclo estrale per ciascun animale. Per eseguire con successo questa procedura, ottenere campioni di qualità dell'epitelio vaginale e interpretare correttamente i risultati sono fondamentali (si consiglia di seguire la Figura 1). Inoltre, i ricercatori devono riempire attentamente il sistema di iniezione per prevenire l'incorporazione di bolle d'aria che potrebbero comportare l'iniezione di volumi imprecisi di farmaci. È anche importante monitorare gli animali durante la microiniezione per evitare che mordano il tubo o interferiscano in altro modo con il sistema. Infine, i ricercatori ciechi alle condizioni sperimentali dovrebbero analizzare l'esito dell'ovulazione, la posizione finale della cannula e la dispersione della soluzione nell'area target per garantire che l'interpretazione dei risultati sia imparziale.
Qui è stato descritto un metodo affidabile, economico e diretto per analizzare il contributo di aree discrete del cervello nella regolazione dell'ovulazione. Questa procedura viene eseguita in ratti svegli e sfrenati, superando gli effetti deleteri del blocco della neurotrasmissione e anche gli effetti inibitori che gli ormoni dello stress come il cortisolo e il corticosterone esercitano sulla secrezione di GnRH. Questo metodo è completamente personalizzabile e può essere utilizzato per fornire qualsiasi farmaco in qualsiasi struttura del cervello. Inoltre, può essere facilmente adattato per roditori comuni e specie non di roditori utilizzate in laboratorio. Infine, questo protocollo può essere utilizzato in combinazione con metodi per la quantificazione di sostanze come ormoni e metaboliti nel sangue, valutazione dell'espressione genica in cellule e tessuti, registrazione dell'attività neuronale e anche le prestazioni di animali svegli in test comportamentali per determinare il ruolo di specifiche aree cerebrali in diversi processi comportamentali e fisiologici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare in relazione a questo articolo.
Acknowledgments
Siamo grati a Raymond Sanchez dell'Università di Washington per il suo prezioso aiuto nella redazione di manoscritti e a M.Sc. Georgina Cortés e M.Sc. Cintia Javier per il loro supporto tecnico nella standardizzazione di questa tecnica. Siamo anche grati ai membri dei servizi veterinari della Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández e MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán per l'eccellente manutenzione e cura degli animali da esperimento. Gli esperimenti descritti in questo protocollo sono stati supportati dal numero di sovvenzione DGAPA-PAPIIT: IN216015 e dal numero di sovvenzione CONACyT: 236908 a Roberto Domínguez. Carlos-Camilo Silva è uno studente di dottorato del Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) ed è sostenuto dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Numero di sovvenzione: 294555).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Hamilton syringes | Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305165 | |
| 23 G x 1" stainless steel hypdermic needle | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2" stainless steel hypdermic needle | BD | 305106 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | BASi | MD-2400 | |
| Bone trimer | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Burr for micro drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Cut-off disc | Dremel | SM5010 | |
| Cutting tweezers | Truper | 17367 | |
| Cyanocrylate glue | Kola loka | K-1 | |
| Dental cement | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Extra fine Bonn scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Face mask | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Hematoxilin | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose artificial tears | Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Microinjection pump | KD Scientific | 788380 | |
| Monomer | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Nitrile gloves | Lanceta HG | 69028 | |
| Non-Rupture Ear Bars | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iodine | Dermo Dine | ||
| Povidone-iodine with soap | Germisin espuma | ||
| Pressure tweezers | Truper | 17371 | |
| Rat anesthesia mask | David Kopf Instruments | Model 906 | |
| Saline solution | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel blade | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sodium pentobarbital | Pisa Agropecuaria | ||
| Standard electrode holder | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Stainless steel wire | American Orthodontic | 856-612 | |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments | Model 900LS | |
| Surgical Sissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Teflon connectors | Basi | MD-1510 | |
| Teflon tubing | Basi | MF-5164 | |
| Tetrodotoxin | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporizer | Kent scientific | VetFlo |
References
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