Ein kostengünstiger und anpassungsfähiger Scratch-Migrationstest
Summary
Wir präsentieren eine kostengünstige Methode zum Scratch-Migrationstest, die einen neuen Ansatz zur Bestimmung der Zellmigration ohne den Einsatz geräteintensiver Methoden bietet. Während Fibroblasten in diesem Protokoll verwendet wurden, kann es angepasst und verwendet werden, um zusätzliche Zelltypen und Einflüsse auf die Zellmigration zu untersuchen.
Abstract
Die Zellmigration ist eine Schlüsselkomponente sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Ereignissen. Normale Zellmigration ist für wesentliche Funktionen wie Entwicklung und Diemontage einer Immunantwort erforderlich. Wenn ein Defekt oder eine Veränderung mit dem Zellmigrationsprozess auftritt, kann es zu schädlichen Folgen kommen (d. h. Krebsmetastasen, Wundheilung und Narbenbildung). Aufgrund der Bedeutung der Zellmigration ist es notwendig, Zugang zu einem Zellmigrationstest zu haben, der erschwinglich, anpassungsfähig und wiederholbar ist. Unter Verwendung des gemeinsamen Scratch-Migration-Assays haben wir einen neuen Ansatz zur Analyse der Zellmigration entwickelt, bei dem allgemeine Laborgeräte verwendet werden. Die beschriebene Methode verwendet visuelle Marker, die es ermöglichen, bestimmte Interessenbereiche ohne Zeitraffermikroskopie zurückzuerobern. Darüber hinaus bietet es Flexibilität im experimentellen Design, von der Änderung des Migrationsmatrixsubstrats bis hin zur Zugabe von pharmakologischen Modifikatoren. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll eine Möglichkeit, den Bereich der Zellmigration zu berücksichtigen, der bei der Untersuchung der Zellmigration nicht von mehreren Methoden berücksichtigt wird. Dieser neue Ansatz bietet einem größeren Publikum einen Scratch-Migrationstest und bietet Forschern mehr Möglichkeiten, die physiologischen und pathophysiologischen Auswirkungen der Zellmigration zu untersuchen.
Introduction
Die Zellmigration ist für viele physiologische und pathologische Ereignisse von entscheidender Bedeutung. Es wird während der Entwicklung, für die Montage einer Immunantwort, und für die richtige Wundheilung1,2,3erforderlich. Viele dieser Zellmigrationsereignisse können durch physikalische oder chemische Signale ausgelöst werden. Zum Beispiel, während einer Immunantwort, Leukozyten wandern in Richtung einer Stelle der Verletzung als Reaktion auf ein Chemoattractant2. Darüber hinaus werden Leukozyten auch Zytokine freisetzen, um die Migration von zusätzlichen Immunzellen sowie anderer Zelltypen, wie Z. B. Fibroblasten, die am Wundheilungsprozess beteiligt sind, zu induzieren und somit eine mehrzellige Reaktion zu ingangsetzen4. Die Fähigkeit der Zellen zu migrieren ist wichtig für die richtige physiologische Funktion; Wenn jedoch die Zellmigration unkontrolliert bleibt, kann sie eine unerwünschte Reaktion haben und zu pathologischen Ereignissen wie chronischen Entzündungen, Gefäßerkrankungen, Krebsmetastasen und beeinträchtigter Wundheilung2,3,4,5,6,7beitragen. Beeinträchtigte Wundheilung ist eine häufige Beleidung von Diabetikern aufgrund von Defekten bei der Zellmigration, und wenn diese Defekte nicht behoben werden, kann dies zu weiteren Komplikationen führen (z.B. Amputation8,9). Diese Studie und andere haben die Notwendigkeit gezeigt, den Prozess, durch den die Zellmigration stattfindet, entweder unter normalen physiologischen oder pathologischen Bedingungen weiter zu verstehen, und es ist entscheidend für die Förderung dieses Forschungsfeldes. Um dies zu erreichen, müssen Migrationstests verfügbar sein, die sowohl zugänglich als auch erschwinglich für diejenigen Forscher sind, die möglicherweise nicht über die Ausrüstung verfügen, die für die Durchführung dieser Assays benötigt wird.
Derzeit stehen eine Vielzahl von Migrationstests zur Verfügung, um eine Vielzahl von Themen zur Zellmigration zu untersuchen. Es wurden sowohl 2D- als auch 3D-Migrationsmodelle entwickelt, die jeweils auf bestimmte Bereiche abzielen, die sich auf die Zellmigration auswirken. 3D-Migrationsmodelle werden in der Regel mit Zellinvasionsstudien in Verbindung gebracht und bewerten die Auswirkungen der extrazellulären Matrix auf die Zellmigration10,11,12, während 2D-Migrationsassays einen größeren Anwendungsbereich haben und in erster Linie zur Untersuchung von chemotaktischen Migration, Wundheilung und funktionellen Veränderungen während der Zellmigration13,14,15,16verwendet werden. Einige dieser Assays erfordern zusätzliche Ausrüstung, wie Boyden-Kammern oder Ausschlussringe, die die Verfügbarkeit dieser Assays für bestimmte Forscher reduzieren können. Einer der kosteneffizienteren Assays ist der Scratch-Assay, der typischerweise zur Beurteilung der Wundheilung und allgemeiner Veränderungen der Zellmigration14,17verwendet wird. Während die meisten Laboratorien für die Durchführung eines Kratzer-Assays ausgestattet sind, sind die Geräte, die zur Verfolgung der Zellmigration verwendet werden, in der Regel entweder nicht verfügbar oder zu teuer für den Kauf. Dazu gehört auch die Zeitraffermikroskopie, die ein invertiertes Mikroskop und ein Live-Bildgebungssystem erfordert. Diese teuren Geräte sind nicht für jedes Labor allgemein zugänglich. Daher unterstreicht diese Beobachtung die Notwendigkeit eines neuen Protokolls, das eine Bewertung der Zellmigration mit leichter verfügbaren Geräten ermöglicht.
Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine neue und kostengünstige Möglichkeit, die Zellmigration zu bewerten. Diese Methode folgt dem gleichen Verfahren, das mit Scratch-Assays verbunden ist, unterscheidet sich jedoch in der Analyse der Untersuchung der Zellmigration, indem Geräte verwendet werden, die in einem grundlegenden wissenschaftlichen Labor verfügbar sind. Dieses Protokoll mit gängigen Geräten ermöglicht eine genauere Bestimmung der Zellmigration ohne den Einsatz von Zeitraffermikroskopie. Neben der Bestimmung der Migration berücksichtigt diese Methode auch variable Faktoren im Scratch-Bereich, die sich stark auf die Zellmigration auswirken. Insgesamt bietet dieses neue Protokoll für die Zellmigrationsanalyse mehr Laboratorien die Möglichkeit, den Bereich der Zellmigration zu erforschen und dazu beizutragen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser neue Ansatz für den Scratch-Migration-Assay bietet Forschern eine leichter zugängliche Methode, um Veränderungen in der Zellmigration zu untersuchen. Während dieser Test dem gleichen Verfahren für die Verabreichung eines Kratzers ähnlich wie andere Scratch-Assays folgt, bietet er eine neue Methode für die Bildgebung und genaue Analyse der Zellmigration10. Anstatt geräteintensive Methoden der Zeitraffermikroskopie und Live-Zell-Bildgebungskammern zu verwenden, beschreibt diese Method…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird durch den US Army Medical Research Award #81XWH-16-1-0710, die University of Mississippi School of Pharmacy und das Department of BioMolecular Sciences unterstützt.
Materials
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
References
- Gilbert, S. F. . Developmental biology. , (1997).
- Luster, A. D., Alon, R., Von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (2005).
- Yahata, Y., et al. A Novel Function of Angiotensin II in Skin Wound Healing Induction of Fibroblast and Keratinocyte Migration by Angiotensin II via Heparin-Binding Epidermal Growth Factor (EGF)-like Growth Factor-Mediated EGF Receptor Transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 281 (19), 13209-13216 (2006).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell Migration Single-Cell Migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), (2012).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn’s disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 290, 827-838 (2006).
- Chi, Z., Melendez, A. J. Role of Cell Adhesion Molecules and Immune-Cell Migration in the Initiation, Onset and Development of Atherosclerosis. Cell Adhesion & Migration. 1 (4), 171-175 (2007).
- Chen, H., Nalbantoglu, J. Ring cell migration assay identifies distinct effects of extracellular matrix proteins on cancer cell migration. BMC Research Notes. 7 (183), 1-9 (2014).
- Stewart, J. A., Massey, E. P., Fix, C., Zhu, J., Goldsmith, E. C., Carver, W. Temporal alterations in cardiac fibroblast function following induction of pressure overload. Cell and tissue research. 340 (1), 117-126 (2010).
- Darby, I. A., Laverdet, B., Bonté, F., Desmoulière, A. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. , 7 (2014).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research – Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Current Opinion in Cell Biology. (17), 524-532 (2005).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37, 208-215 (2005).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 1-16 (2019).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Walter, M. N. M., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. B. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: An in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Experimental Cell Research. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Chaudhary, A., Bag, S., Barui, A., Banerjee, P., Chatterjee, J. Honey dilution impact on in vitro wound healing: Normoxic and hypoxic condition. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 412-422 (2015).
- Lipton, A., Klinger, I., Paul, D., Holleyt, R. W. Migration of Mouse 3T3 Fibroblasts in Response to a Serum Factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (11), (1971).
- Ascione, F., Guarino, A. M., Calabrò, V., Guido, S., Caserta, S. A novel approach to quantify the wound closure dynamic. Experimental Cell Research. (352), 175-183 (2017).
- Burr, S. D., Harmon, M. B., S, J. A. The Impact of Diabetic Conditions and AGE/RAGE Signaling on Cardiac Fibroblast Migration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Chang, S. S., Guo, W. H., Kim, Y., Wang, Y. L. Guidance of Cell Migration by Substrate Dimension. Biophysical Journal. 104, 313-321 (2013).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), 2595-2604 (2012).
