Un ensayo de migración de arañazos rentable y adaptable
Summary
Presentamos un método rentable para el ensayo de migración de arañazos que proporciona un nuevo enfoque para determinar la migración celular sin el uso de métodos intensivos en equipos. Mientras que los fibroblastos se utilizaron en este protocolo, se pueden adaptar y utilizar para estudiar tipos celulares adicionales e influencias en la migración celular.
Abstract
La migración celular es un componente clave en eventos fisiológicos y patológicos. La migración celular normal es necesaria para funciones esenciales como el desarrollo y el montaje de una respuesta inmunitaria. Cuando se produce un defecto o alteración con el proceso de migración celular, puede tener resultados perjudiciales (es decir, metástasis de cáncer, cicatrización de heridas y formación de cicatrices). Debido a la importancia de la migración celular, es necesario tener acceso a un ensayo de migración celular que sea asequible, adaptable y repetible. Utilizando el ensayo común de migración de arañazos, hemos desarrollado un nuevo enfoque para analizar la migración celular que utiliza equipos de laboratorio generales. El método descrito utiliza marcadores visuales que permiten recuperar áreas específicas de interés sin el uso de microscopía de lapso de tiempo. Además, proporciona flexibilidad en el diseño experimental, que van desde la alteración del sustrato de la matriz de migración hasta la adición de modificadores farmacológicos. Además, este protocolo describe una manera de tener en cuenta el área de migración celular, que no se considera mediante varios métodos al examinar la migración de celdas. Este nuevo enfoque ofrece un ensayo de migración de arañazos a un público más amplio y proporcionará una mayor oportunidad para que los investigadores examinen el impacto fisiológico y fisiopatológico de la migración celular.
Introduction
La migración celular es crucial para muchos eventos fisiológicos y patológicos. Es necesario durante el desarrollo, para el montaje de una respuesta inmune, y para la cicatrización de heridas adecuada1,2,3. Muchos de estos eventos de migración celular pueden desencadenarse por señales físicas o químicas. Por ejemplo, durante una respuesta inmunitaria, los leucocitos migrarán hacia un sitio de lesión en respuesta a un quimioatractant2. Además, los leucocitos también liberarán citoquinas para inducir la migración de células inmunitarias adicionales, así como otros tipos de células, como los fibroblastos, que están involucrados en el proceso de cicatrización de heridas, y por lo tanto, iniciando una respuesta multicelular4. La capacidad de las células para migrar es esencial para la función fisiológica adecuada; sin embargo, cuando la migración celular no se controla, puede tener una respuesta adversa y contribuir a eventos patológicos, como inflamación crónica, enfermedad vascular, metástasis de cáncer, y deterioro de la cicatrización de heridas2,3,4,5,6,7. El deterioro de la cicatrización de heridas es una aflicción común de los diabéticos debido a defectos en la migración celular, y si estos defectos no se abordan, podría conducir a complicaciones adicionales (por ejemplo, amputación8,9). Este estudio, así como otros, han indicado la necesidad de comprender mejor el proceso por el cual se produce la migración celular, ya sea en condiciones fisiológicas o patológicas normales, y es vital para promover este campo de investigación. Para lograrlo, es necesario que haya ensayos de migración disponibles que sean accesibles y asequibles para aquellos investigadores, que pueden no poseer el equipo necesario para llevar a cabo estos ensayos.
Actualmente, hay una variedad de ensayos de migración disponibles para examinar una amplia gama de temas relacionados con la migración celular. Se han desarrollado modelos de migración 2D y 3D, cada uno dirigido a áreas específicas que afectan a la migración celular. Los modelos de migración 3D se asocian típicamente con estudios de invasión celular y evalúan el impacto de la matriz extracelular en la migración celular10,11,12, mientras que los ensayos de migración 2D tienen un mayor rango de aplicación y se utilizan principalmente para estudiar la migración quimiotáctica, la cicatrización de heridas, y los cambios funcionales durante la migración celular13,14,15,16. Varios de estos ensayos requieren equipos adicionales, como cámaras Boyden o anillos de exclusión, lo que puede reducir la disponibilidad de estos ensayos a ciertos investigadores. Uno de los ensayos más rentables es el ensayo de arañazos, que se utiliza normalmente para evaluar la cicatrización de heridas y los cambios generales en la migración celular14,17. Mientras que la mayoría de los laboratorios están equipados para llevar a cabo un ensayo de rasguño, el equipo utilizado para rastrear la migración celular tiende a no estar disponible o demasiado caro para comprar. Esto incluye la microscopía de lapso de tiempo, que requiere un microscopio invertido y un sistema de imágenes en vivo. Estas costosas piezas de equipo no son comúnmente accesibles para todos los laboratorios. Por lo tanto, esta observación pone de relieve la necesidad de un nuevo protocolo que permita evaluar la migración celular con equipos más fácilmente disponibles.
El protocolo presentado aquí proporciona una forma nueva y asequible de evaluar la migración celular. Este método sigue el mismo procedimiento asociado con los ensayos de arañazos, pero difiere en el análisis del examen de la migración celular mediante la utilización de equipos más comúnmente disponibles en un entorno de laboratorio de ciencias básicas. Este protocolo que utiliza equipos comunes permite una determinación más precisa de la migración celular sin el uso de microscopía de lapso de tiempo. Además de determinar la migración, este método también tiene en cuenta los factores variables en el área de rayado que se ha observado que afectan en gran medida a la migración de celdas. En general, este nuevo protocolo para el análisis de migración celular ofrece una oportunidad para que más laboratorios exploren y contribuyan al campo de la migración celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este nuevo enfoque para el ensayo de migración de arañazos proporciona un método más accesible para que los investigadores examinen los cambios en la migración celular. Si bien este ensayo sigue el mismo procedimiento para administrar un rasguño similar a otros ensayos de scratch, proporciona un nuevo método para la creación de imágenes y el análisis preciso de la migración celular10. En lugar de utilizar métodos intensivos en equipos de microscopía de lapso de tiempo y cámaras de im…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por el Premio de Investigación Médica del Ejército de los Estados Unidos #81XWH-16-1-0710, la Escuela de Farmacia de la Universidad de Mississippi y el Departamento de Ciencias Biomoleculares.
Materials
| Adobe All Apps | Adobe | This includes Adobe photoshop which is the imaging software used with this protocol | |
| Avant Pipette Tips 200ul Binding non-sterile | MIDSCI | AVR1 | Tips are autoclaved to sterilize |
| AxioCam Erc 5s Camera | Zeiss | 426540-9901-000 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher Scientific | BP101-25 | |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates 48 Wells | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| DMEM with L-Glutamine, 1g/L glucose and sodium pyruvate | Fisher Scientific | MT10014CM | |
| Image J | NIH | This is a free software offered by the US government and is the analysis software used with this protocol | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416785000 | |
| Premium US origin fetal bovine serum | Innovative Research | IFBS-HU | |
| Primocin | InvivoGEN | ant-pm-2 | This is the anitmicrobial used for with this procotol to culture cardiac fibroblasts |
| Zeiss Primovert Microscope | Zeiss | 491206-0002-000 | |
| Zen Blue Edition 2.3 software | Zeiss | software comes with camera purchase |
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