C57BL/6マウスでタウロコレートナトリウム誘発重篤急性膵炎
Summary
重度の急性膵炎の動物モデルは、初期段階での病態生理学的変化の研究を可能にし、炎症事象の進化の観察を促進する。ここでは、麻酔をしたC57BL/6マウスの膵管内へのタウロコレートナトリウムの逆行注入による重症急性胆道膵炎の誘導プロトコルを提供する。
Abstract
タウロキ酸ナトリウム注入による胆道急性膵炎誘導は、臨床胆汁性膵炎の発症に対応するヒト臨床状態および炎症性イベントの再現の表現により、科学界によって広く使用されている。膵臓の損傷の重症度は、注入胆汁酸の濃度、速度、および体積を測定することによって評価することができる。この研究は、プロトコルの再生に使用される材料と方法の最新のチェックリストを提供し、この急性膵炎(AP)モデルの主な結果を示しています。これまでの出版物のほとんどは、ラットでこのモデルを再現することに限定されています。我々は、この方法をマウスに適用し、研究に関連する可能性のある追加の利点(すなわち、これらの動物のための試薬および抗体の兵器の入手可能性とマウスの遺伝子組み換え株で作業する可能性)を提供する。マウスの急性膵炎誘導に関しては、C57BL/6マウスの3分間の注入速度10μL/minで2.5%タウロコレートナトリウムを定義した体系的なプロトコルを提示し、誘導の12時間以内に重症度の最大レベルに達し、その結果を検証する結果を強調する。練習と技術により、麻酔の誘導から注入の完了までの合計推定時間は、動物1匹につき25分である。
Introduction
ヒトでは、胆石の存在は、胆汁の末端部の閉塞による膵炎の最も一般的な原因であり、膵臓分泌物の流れを中断し、膵臓で激しい炎症プロセスを引き起こし、血清および炎症性メディエーター中の消化酵素の濃度が増加する1,2。
急性膵炎(AP)の発症を説明するために、2つの異なる理論が提案されている。「共通チャネル」理論は、胆嚢に存在する石が遠位共通胆管系を妨げ、胆汁分泌が膵管に逆行して流れることを示唆している。第2の理論(「ダクト閉塞」理論)は、過剰胆石による膵管閉塞が十二指腸への膵分泌の流れの閉塞を引き起こし、管性高血圧症を引き起こすことを示唆している。急性胆道膵炎につながるメカニズムは完全には理解されていませんが、結果は激しい炎症プロセスです。消化酵素の噴火と膵臓の自己消化は、組織病理学的変化、アセンチズル液および血清中の炎症性サイトカイン(IL-1β、IL-6、TNF-α)の増加、および急性相タンパク質の増加を招く4,5,6.
重症急性膵炎は、複数の臓器の関与と高い死亡リスクのために臨床的な注意を払うに値する状態です。急性膵炎(AP)の再生のための動物モデルは、疾患の病態生理学的メカニズムを説明し、疾患の初期段階から始まる炎症性事象の進化を監視するのに役立つ重要である。これは通常、診療所2,7では不可能です。さらに、膵臓組織へのアクセスは前臨床試験で容易であり、臨床状態に関連する変化の解明を好む8イソジェニック種と共に、望ましくない変数を排除し、人間の状態で観察された結果と臨床的類似性をミラーリングする9。
ラットおよびマウス種における急性膵炎の誘導のための胆道モデルおよび非胆道モデルは、科学文献において頻繁に研究されてきた。誘導の非胆道方法には、コレシストキニン分泌酵素またはそのアナログセリフィン10の上格刺激用量の投与が含まれる。L-アルギニンのほぼ致死量の投与;またはエチオニン11を補充コリン欠損の食事の投与.これらの方法は、再現しやすく、膵炎をもたらすが、理論的にはAPを引き起こすメカニズム(すなわち、膵管内の胆汁分泌の還流)を複製しない。胆道モデルに対処する技術は、膵管への胆汁酸の逆行注入に基づいており、このプロトコルを実行するために十分な訓練を受けた研究者を必要とします。いくつかの研究は、ラット(これらの実験は外科的処置を伴うため、技術的な理由から)12,13でこの方法を使用して公開されています。しかし、マウスのアプローチは、炎症の研究でより興味深い結果を提供するかもしれない3,14,15。本研究では、C57BL/6麻酔マウスにタウロコレートナトリウムを注入して重症急性膵炎を再生するためのステップのチェックリストを示す。
抗体の実験や遺伝子やタンパク質発現の分析を必要とする研究では、これらの動物のための材料の武器が大きくなり、等原性およびノックアウト種で作業する可能性があるため、マウスの使用が好ましい。マウスC57BL/6は、もともと抗腫瘍活性および免疫学の研究のために開発されたマウスの近親交配株である。この株は、等性であることのために研究者によってますます好まされており、実験でより少ない数の動物の使用を意味し、同じグループ17,18間の結果の変動が少ないことを意味する結果のより大きな再現性を可能にする。
Peridesら (2010)14 は、タウロコール酸ナトリウム注入によるマウスにおけるAP誘導のためのプロトコルを発表した。ここでは、C57BL/6マウスのタウロコレートナトリウム濃度(2.5%)を使用して、定義された体積と注入速度を使用してこのモデルを更新します(図1)。重症度の最大レベルは、マウスの誘導の12時間以内に達する。血清中および腹腔におけるIL-6濃度の上昇は、APの進行と相関している。練習では、麻酔の誘導から注入の完了までの合計推定時間は、動物1匹につき25分である。訓練を受けた研究者がこの実験を行うことは不可欠です。溶液が一般的な胆管に適切に注入されるように、タウロコレートナトリウムの代わりにメチレンブルーを使用していくつかのパイロットトレーニングセッションを行います。
Protocol
Representative Results
Discussion
タウロコレートナトリウム注入による急性膵炎を誘導する方法は、ラット22,23,24に既に示されている。2008年、2010年、2015年に出版された3つの同様の作品は、プロトコル3,14,15の参考文献として機能しました。本研究では、C57BL/6マウスでこの方法を再現す…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者はサンパウロ大学の医療クリニックでの卒業後の卒業プログラムに感謝します。クオルデナサン・デ・アペルフェイソアメント・デ・ペソアル・デ・ニーヴェル・スーペリア校(CAPES)とサンパウロ大学医学部(FMUSP)。
Materials
| 0.4 mm needle | INTRAG MEDICAL TECH | 90183210 | 30G |
| 0.54 mm polyethylene tube | Tygon | 730010 | – |
| Styrofoam block | – | – | – |
| masking tape for mounting the mouse | Missner | 1236 | – |
| Infusion pump scheduled to 10µL / min. | Havard aparatus-Peristaltic Pump Series | MA1 55-7766 | Model 66 Small Peristaltic |
| Scissors and forceps | |||
| Antiseptic providine iodine | Pfizer | 12086OR | antisepsis |
| 70% ethanol | SIGMA | 459836 | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O |
| Razor blade | Lord | bdk9a1ghk6 | For trichotomy |
| Sodium taurocholate | Sigma-Aldrich | 86339- 1G | CAS NUMBER- 345909-26-4 |
| microvessel clip | Medicon Surgical | 56.87.35 | Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g |
| 6-0 prolene | Bioline | 5162 | Suture line |
| Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL | Cristália | ||
| Xilazine 2% | Syntec | ||
| Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline) | Farmace | 105851 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich Chemicals | M5528 | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Immunology Multiplex Assay | MERCK | MCYTOMAG-70K | Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples. |
| Amylase Assay | Labtest | 11 | |
| Desmarres retractor 13-mm width |
ROBOZ | RS-6672 |
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