Taurocholate de sódio induziu pancreatite aguda grave em C57BL/6 camundongos
Summary
Modelos animais para pancreatite aguda grave permitem o estudo de alterações fisiodicosiológicas no estágio inicial, facilitando a observação da evolução dos eventos inflamatórios. Aqui fornecemos um protocolo para a indução de pancreatite biliar aguda grave por infusão retrógrada de taurocholate de sódio no ducto pancreático de camundongos C57BL/6 anestesiados.
Abstract
A indução de pancreatite aguda biliar por infusão de taurocoolato de sódio tem sido amplamente utilizada pela comunidade científica devido à representação da condição clínica humana e à reprodução de eventos inflamatórios correspondentes ao aparecimento de pancreatite biliar clínica. A gravidade dos danos pancreáticos pode ser avaliada medindo a concentração, velocidade e volume do ácido biliar infundido. Este estudo fornece uma lista atualizada dos materiais e métodos utilizados na reprodução do protocolo e mostra os principais resultados deste modelo de pancreatite aguda (AP). A maioria das publicações anteriores limitou-se a reproduzir esse modelo em ratos. Aplicamos esse método em camundongos, o que proporciona vantagens adicionais (ou seja, a disponibilidade de um arsenal de reagentes e anticorpos para esses animais, juntamente com a possibilidade de trabalhar com cepas geneticamente modificadas de camundongos) que podem ser relevantes para o estudo. Para indução aguda de pancreatite em camundongos, apresentamos um protocolo sistemático, com uma dose definida de 2,5% de taurocolato de sódio a uma velocidade de infusão de 10 μL/min por 3 min em camundongos C57BL/6 que atinge seu nível máximo de gravidade dentro de 12 h de indução e destacam resultados com resultados que validam o método. Com a prática e a técnica, o tempo total estimado, desde a indução da anestesia até a conclusão da infusão, é de 25 minutos por animal.
Introduction
Em humanos, a presença de cálculos biliares é a causa mais comum de pancreatite devido à obstrução da porção terminal do choledochal, interrompendo o fluxo de secreções pancreáticas e causando um intenso processo inflamatório no pâncreas, com aumento da concentração de enzimas digestivas no soro e mediadores inflamatórios1,2.
Duas teorias diferentes foram propostas para explicar o desenvolvimento de pancreatite aguda (AP). A teoria do “canal comum” sugere que as pedras presentes na vesícula biliar obstruem o sistema de ducto biliar comum distal, permitindo que a secreção biliar flua retrógrada para o ducto pancreático. A segunda teoria (a teoria da “obstrução do ducto”) sugere que a obstrução do ducto pancreático por excesso de cálculos biliares causa um bloqueio no fluxo de secreção pancreática para o duodeno, causando hipertensão ductal3. Embora os mecanismos que levam à pancreatite biliar aguda não sejam totalmente compreendidos, o resultado é um processo inflamatório intenso. Erupção de enzima digestiva e auto-digestão do pâncreas levam a alterações histopatológicas, aumento de citocinas inflamatórias (IL-1β, IL-6, TNF-α) em fluido ascético e soro, e aumento de proteínas de fase aguda4,5,6.
A pancreatite aguda grave é uma condição que merece atenção clínica devido ao envolvimento de múltiplos órgãos e a um alto risco de mortalidade. Modelos animais para a reprodução de pancreatite aguda (AP) são importantes, pois explicam os mecanismos fisiodicosiológicos da doença e ajudam no acompanhamento da evolução dos eventos inflamatórios, a partir dos estágios iniciais da doença. Isso geralmente não é possível nas clínicas2,7. Além disso, o acesso a tecidos pancreáticos é fácil em estudos pré-clínicos, favorecendo a elucidação de alterações ligadas às condições clínicas8, juntamente com a possibilidade de trabalhar com espécies isogênicas, eliminando variáveis indesejáveis e espelhando a semelhança clínica com os desfechos observados na condição humana9.
Modelos biliares e não biliares para a indução de pancreatite aguda em espécies de ratos e camundongos têm sido frequentemente estudados na literatura científica. Os métodos não biliares de indução incluem a administração de doses estimulantes supramaximais da colecistocina secretagogue ou sua cerulein analógica10; administração de doses quase letais de L-arginina; ou administração de uma dieta deficiente de colina suplementada com ethionine11. Embora esses métodos sejam fáceis de reproduzir e resultem em inflamação pancreática, eles não replicam os mecanismos que, em teoria, desencadeiam AP (ou seja, o refluxo da secreção bile no ducto pancreático). A técnica que aborda o modelo biliar baseia-se na infusão retrógrada de ácidos biliares no ducto pancreático e requer pesquisadores bem treinados para realizar este protocolo. Vários estudos foram publicados utilizando esse método em ratos (aparentemente por razões técnicas, uma vez que esses experimentos envolvem procedimentos cirúrgicos)12,13. No entanto, a abordagem em camundongos pode oferecer resultados mais interessantes no estudo da inflamação3,14,15. Neste estudo, mostraremos uma lista dos passos a serem seguidos para a reprodução de pancreatite aguda grave por infusão de taurocolato de sódio em camundongos anestocás C57BL/6.
Para trabalhos que envolvem a necessidade de experimentos com anticorpos e análise da expressão genética e proteica, o uso de camundongos é preferível devido ao maior arsenal de materiais para esses animais e à possibilidade de trabalhar com espécies isogênicas e eliminatórias, entre outras que podem ser utilizadas relevantes para estudos16. Camundongos C57BL/6 é uma variedade de camundongos originalmente desenvolvida para o estudo da atividade antitumoral e imunologia. Essa cepa está cada vez mais sendo preferida pelos pesquisadores por ser isogênica, permitindo uma maior reprodutibilidade de resultados, o que pode implicar o uso de um número menor de animais em um experimento e menor variabilidade dos resultados entre o mesmo grupo17,18.
Perides et al. (2010)14 publicaram um protocolo para indução de AP em camundongos por infusão de taurochoola de sódio. Aqui atualizamos este modelo utilizando uma maior concentração de taurocholate de sódio (2,5%) em camundongos C57BL/6, com volume e velocidade definidos de infusão (Figura 1). O nível máximo de gravidade é alcançado dentro de 12 h de indução em camundongos. A elevação da concentração de IL-6 tanto no soro quanto na cavidade peritoneal está correlacionada com a progressão da AP. Com a prática, o tempo total estimado desde a indução da anestesia até a conclusão da infusão, é de 25 minutos por animal. É essencial que um pesquisador treinado conduza esse experimento. Para garantir que a solução seja injetada corretamente no ducto biliar comum, realize várias sessões de treinamento piloto usando azul de metileno em vez de taurocolato de sódio.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método de indução de pancreatite aguda por infusão de taurocholate de sódio retrógrado já foi mostrado em ratos22,23,24. Três trabalhos semelhantes, publicados em 2008, 2010 e 2015, serviram de referência para o protocolo3,14,15. Neste trabalho, listamos todas as etapas críticas para a reprodução deste método em camundong…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica da Universidade de São Paulo; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP).
Materials
| 0.4 mm needle | INTRAG MEDICAL TECH | 90183210 | 30G |
| 0.54 mm polyethylene tube | Tygon | 730010 | – |
| Styrofoam block | – | – | – |
| masking tape for mounting the mouse | Missner | 1236 | – |
| Infusion pump scheduled to 10µL / min. | Havard aparatus-Peristaltic Pump Series | MA1 55-7766 | Model 66 Small Peristaltic |
| Scissors and forceps | |||
| Antiseptic providine iodine | Pfizer | 12086OR | antisepsis |
| 70% ethanol | SIGMA | 459836 | Mix 700 mL 100% ethanol with 300 mL dH2O |
| Razor blade | Lord | bdk9a1ghk6 | For trichotomy |
| Sodium taurocholate | Sigma-Aldrich | 86339- 1G | CAS NUMBER- 345909-26-4 |
| microvessel clip | Medicon Surgical | 56.87.35 | Approximator, opening 4.0 mm, closing pressure 30 - 40 g |
| 6-0 prolene | Bioline | 5162 | Suture line |
| Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL | Cristália | ||
| Xilazine 2% | Syntec | ||
| Sterile saline solution (0.9% (wt/vol) saline) | Farmace | 105851 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich Chemicals | M5528 | |
| MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel – Immunology Multiplex Assay | MERCK | MCYTOMAG-70K | Simultaneously analyze multiple cytokine and chemokine biomarkers with Bead-Based Multiplex Assays using the Luminex technology, in mouse serum, plasma and cell culture samples. |
| Amylase Assay | Labtest | 11 | |
| Desmarres retractor 13-mm width |
ROBOZ | RS-6672 |
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