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Bioengineering

Sintesi di Nanoparticolo di ossido di Manganese per decomposizione termica di Manganese(II) Acetylacetonate

Published: June 18, 2020 doi: 10.3791/61572
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University

Summary

Questo protocollo descrive una facile sintesi di nanoparticelle di ossido di manganese (MnO) mediante decomposizione termica dell'acelalaccio (II) di manganese in presenza di oleylamina ed etere dibenzil. Le nanoparticelle di MnO sono state utilizzate in diverse applicazioni, tra cui la risonanza magnetica, il biosensing, la catalisi, le batterie e il trattamento delle acque reflue.

Abstract

Per le applicazioni biomediche, le nanoparticelle di ossido di metallo come l'ossido di ferro e l'ossido di manganese (MnO), sono state utilizzate come biosensori e agenti di contrasto nella risonanza magnetica (MRe). Mentre le nanoparticelle di ossido di ferro forniscono un contrasto negativo costante sulla risonanza magnetica rispetto ai tipici intervalli di tempo sperimentali, MnO genera un contrasto positivo commizzabile sulla risonanza magnetica attraverso la dissoluzione da MnO a Mn2 a pH basso all'interno degli endosomi cellulari per "attivare" il contrasto della risonanza magnetica. Questo protocollo descrive una sintesi di nanoparticelle di MnO formata dalla decomposizione termica dell'acelalaccio (II) di manganese nell'etere di oleylamina e dibenzil. Anche se l'esecuzione della sintesi delle nanoparticelle di MnO è semplice, la configurazione sperimentale iniziale può essere difficile da riprodurre se non vengono fornite istruzioni dettagliate. Così, il vetro e l'assemblaggio del tubo viene prima accuratamente descritto per consentire ad altri investigatori di riprodurre facilmente l'installazione. Il metodo di sintesi incorpora un controllore di temperatura per ottenere una manipolazione automatizzata e precisa del profilo di temperatura desiderato, che avrà un impatto sulle dimensioni e sulla chimica delle nanoparticelle risultanti. Il protocollo di decomposizione termica può essere facilmente adattato per generare altre nanoparticelle di ossido di metallo (ad esempio ossido di ferro) e per includere solventi organici e stabilizzatori alternativi (ad esempio, acido oleico). Inoltre, il rapporto tra solvente organico e stabilizzatore può essere modificato per influenzare ulteriormente le proprietà delle nanoparticelle, come illustrato nel presente documento. Le nanoparticelle MnO sintetizzate sono caratterizzate rispettivamente per morfologia, dimensioni, composizione di massa e composizione della superficie attraverso la microscopia elettronica a trasmissione, la diffrazione a raggi X e la spettroscopia infrarossa a trasformazione di Fourier. Le nanoparticelle MnO sintetizzate con questo metodo saranno idrofobiche e devono essere ulteriormente manipolate attraverso lo scambio di ligando, l'incapsulamento polimerico o il tappo lipidico per incorporare gruppi idrofili per l'interazione con fluidi e tessuti biologici.

Introduction

Le nanoparticelle di ossido di metallo possiedono proprietà magnetiche, elettriche e catalitiche, che sono state applicate nel bioimaging1,2,3, tecnologie dei sensori4,5, catalisi6,7,8, stoccaggio di energia9e purificazione dell'acqua10. All'interno del campo biomedico, le nanoparticelle di ossido di ferro e l'ossido di manganese (MnO) hanno dimostrato utilità come agenti di contrasto nella risonanza magnetica (ION)1,2. Le nanoparticelle di ossido di ferro producono un solido contrasto negativo sulla risonanza magnetica T2e sono abbastanza potenti da visualizzare singole cellule etichettate in vivo11,12,13; tuttavia, il segnale MRe negativo non può essere modulato e rimane "ON" per tutta la durata degli esperimenti tipici. A causa del ferro endogeno presente nel fegato, nel midollo osseo, nel sangue e nella milza, il contrasto negativo generato dalle nanoparticelle di ossido di ferro può essere difficile da interpretare. Le nanoparticelle di MnO, d'altra parte, sono reattive a un calo del pH. Il segnale RMI per le nanoparticelle MnO può passare da "OFF" a "ON" una volta che le nanoparticelle sono internalizzate all'interno degli endosomi di pH basso e dei lisosomi della cellula bersaglio come una cellula cancerostruzzale14,15,16,17,18,19. Il contrasto positivo sulla risonanza magnetica T1 prodotta dalla dissoluzione di MnO a Mn2 a basso pH è inconfondibile e può migliorare la specificità di rilevamento del cancro illuminandosi solo nel sito di destinazione all'interno di un tumore maligno. Il controllo sulle dimensioni, la morfologia e la composizione delle nanoparticelle è fondamentale per ottenere il massimo segnale di risonanza magnetica dalle nanoparticelle di MnO. In questo caso, descriviamo come sintetizzare e caratterizzare le nanoparticelle di MnO utilizzando il metodo di decomposizione termica e prendiamo nota di diverse strategie per ottimizzare le proprietà delle nanoparticelle modificando le variabili nel processo di sintesi. Questo protocollo può essere facilmente modificato per produrre altre nanoparticelle magnetiche come le nanoparticelle di ossido di ferro.

Le nanoparticelle di MnO sono state prodotte da una varietà di tecniche tra cui la decomposizionetermica 20,21,22,23,24,25, idro/solvotertica26,27,28,29, esfoli30,31,32,33,34, riduzione permanganates35,36,37,38e adsorption-ossidazione39,40,41,42. La decomposizione termica è la tecnica più comunemente utilizzata che prevede lo scioglimento dei precursori del manganese, dei solventi organici e della stabilizzazione degli agenti ad alte temperature (180 – 360 gradi centigradi) sotto la presenza di un'atmosfera gassosa inerte per formare nanoparticelle MnO43. Di tutte queste tecniche, la decomposizione termica è il metodo superiore per generare una varietà di nanocristalli MnO di fase pura (MnO, Mn3O4 e Mn2O3) con una distribuzione di dimensioni ridotte. La sua versatilità è evidenziata attraverso la capacità di controllare strettamente le dimensioni delle nanoparticelle, la morfologia e la composizione alterando il tempo di reazione44,45,46, temperatura44,47,48,49, tipi / rapporti di reazionatori20,45,47,,48,50 e gas inerte47,48,50 utilizzati. I principali limiti di questo metodo sono la necessità di alte temperature, l'atmosfera priva di ossigeno, e il rivestimento idrofobico delle nanoparticelle sintetizzate, che richiede ulteriori modifiche con polimeri, lipidi o altri ligando per aumentare la solubilità per le applicazioni biologiche14,51,52,53.

Oltre alla decomposizione termica, il metodo idro/solvotermico è l'unica altra tecnica in grado di produrre una varietà di fasi MnO tra cui MnO, Mn3O4e MnO2; tutte le altre strategie formano solo prodotti MnO2. Durante la sintesi idro-solvotertica, precursori come Mn(II) stearate54,55 e Mn(II) acetato27 sono riscaldati tra 120-200 gradi centigradi per diverse ore per ottenere nanoparticelle con una distribuzione di dimensioni ridotte; tuttavia, sono necessari vasi di reazione specializzati e le reazioni vengono eseguite ad alta pressione. Al contrario, la strategia di esfoliazione prevede il trattamento di un materiale a strati o sfusa per promuovere la dissociazione in strati singoli 2D. Il suo vantaggio principale è la produzione di MnO2 nanofoglio, ma il processo di sintesi richiede da tempo diversi giorni e la dimensione risultante dei fogli è difficile da controllare. In alternativa, i permanganati come KMnO4 possono reagire con agenti di riduzione come l'acido oleico56,57, l'ossidodi grafene 58 o il poli (idrocloruro di alleminato)59 per creare nanoparticelle MnO2. L'uso di KMnO4 facilita la formazione di nanoparticelle a temperatura ambiente per pochi minuti o ore in condizioni diaqueous 43. Sfortunatamente, la rapida sintesi e la crescita delle nanoparticelle rende difficile controllare finemente le dimensioni delle nanoparticelle risultanti. MnO2 nanoparticelle possono anche essere sintetizzate utilizzando l'adsorbimento-ossidazione per cui gli ioni Mn2 sono adsorbati e ossidati a MnO2 dall'ossigeno in condizioni di base. Questo metodo produrrà piccole nanoparticelle MnO2 con una distribuzione di dimensioni ridotte a temperatura ambiente per diverse ore in supporti aque; tuttavia l'esigenza di assorbimento delle condizioni di ioni e alcali Mn2 e alcali limita la sua applicazionediffusa 43.

Dei metodi di sintesi delle nanoparticelle MnO discussi, la decomposizione termica è la più versatile per generare diversi nanocristalli di fase pura monodispersa con controllo sulle dimensioni, la forma e la composizione delle nanoparticelle senza richiedere vasi di sintesi specializzati. In questo manoscritto, descriviamo come sintetizzare le nanoparticelle di MnO mediantedecomposizione termica a 280 gradi centigradi utilizzando l'acetiltione di manganese (II) e l'etere dibenzyl (DE) come solvente sotto un'atmosfera di azoto. L'impostazione di vetro e tubi per la sintesi delle nanoparticelle è spiegata in dettaglio. Uno dei vantaggi della tecnica è l'inclusione di un controller di temperatura, una sonda termocoppia e un mantello riscaldante per consentire un controllo preciso sulla velocità di riscaldamento, la temperatura di picco e i tempi di reazione ad ogni temperatura per ottimizzare le dimensioni e la composizione delle nanoparticelle. Qui, mostriamo come le dimensioni delle nanoparticelle possono anche essere manipolate modificando il rapporto tra OA e DE. Inoltre, dimostriamo come preparare campioni di nanoparticelle e misurare le dimensioni delle nanoparticelle, la composizione di massa e la composizione della superficie utilizzando rispettivamente la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), la diffrazione a raggi X (XRD) e la spettroscopia a infrarossi (FTIR) di trasformazione di Fourier. Ulteriori indicazioni sono incluse su come analizzare le immagini e gli spettri raccolti da ogni strumento. Per generare nanoparticelle MnO di forma uniforme, devono essere presenti uno stabilizzatore e un adeguato flusso di azoto; I risultati XRD e TEM sono mostrati per i prodotti indesiderati formati in assenza di OA e sotto basso flusso di azoto. Nella sezione Discussione, evidenziamo i passaggi cruciali del protocollo, le metriche per determinare la sintesi delle nanoparticelle di successo, l'ulteriore variazione del protocollo di decomposizione per modificare le proprietà delle nanoparticelle (dimensioni, morfologia e composizione), la risoluzione dei problemi e le limitazioni del metodo e le applicazioni delle nanoparticelle di MnO come agenti di contrasto per l'imaging biomedico.

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Protocol

1. Assemblaggio di vetro e tubing – da eseguire solo la prima volta

NOTA: La figura 1 mostra l'impostazione sperimentale per la sintesi delle nanoparticelle MnO con connessioni di tubazioni numerate. Figura S1 mostra la stessa configurazione con i principali componenti vetreria etichettati. Se c'è una discrepanza tra il tubo resistente chimico e la dimensione di connessione del vetro, coprire la connessione di vetro prima con un breve pezzo di tubi più piccoli prima di aggiungere il tubo chimico resistente per rendere le connessioni aderenti.

  1. Fissare il serbatoio di azoto senza aria alla parete vicino a un cappuccio di fumi chimico utilizzando i vincoli delle cinghie approvati. Aggiungere il regolatore di azoto appropriato al serbatoio.
    CAUTION: Le bombole di gas devono essere adeguatamente fissate in quanto possono essere molto pericolose se rovesciate.
  2. Riempire la colonna di essiccazione del gas con desiccante. Collegare tubi resistenti alla sostanza chimica dal regolatore di azoto privo d'aria all'ingresso inferiore della colonna di essiccazione del gas (#1 figura 1).
  3. Fissare il collettore di vetro contenente almeno 2 stopcocks di uscita nella parte superiore del cofano del fume utilizzando due morsetti artiglio metallico. Collegare i tubi resistenti alla sostanza chimica dall'uscita della colonna di essiccazione del gas (#2 figura 1) all'ingresso del collettore (#3 figura 1).
  4. Posizionare e fissare 3 bollitori di olio minerale nel cofano di fume utilizzando morsetti artiglio metallico secondo la figura 1. Mettere due bollicre a sinistra e un bubbler a destra.
  5. Riempire il bollitore più a sinistra (di #9 figura 1) con la più piccola quantità di olio di silicone (1 pollice di olio dal fondo del bubbler). Riempire il bollitore centrale (di #7,8 nella figura 1) con una quantità media di olio di silicone (1,5 pollici di olio dal fondo del bollitore). Riempire il bubbler più a destra (di #11 nella Figura 1) con la più grande quantità di olio di silicone (2 pollici di olio dal fondo del bollitore).
    NOTA: La quantità relativa di olio di silicone tra i bolle minerali è molto importante per ottenere un flusso appropriato del gas di azoto privo di aria attraverso il sistema. Non aggiungere troppo olio (oltre 2,5 pollici), in quanto l'olio bolle durante la reazione e può uscire dalle bollicine se riempito troppo.
  6. Collegare l'uscita sul punto di arresto destro del collettore (#4 nella Figura 1) all'estremità filettata di un adattatore a gomito in vetro (#5 nella Figura 1)utilizzando tubi resistenti alla chimica.
  7. Collegare l'estremità filettata di un altro adattatore a gomito in vetro (#6 nella Figura 1) all'ingresso del bubbler centrale (#7 in Figura 1)utilizzando tubi resistenti alla chimica. Collegare l'uscita del bubbler centrale (#8 figura 1) all'ingresso del bubbler più a sinistra (#9 figura 1)utilizzando tubi resistenti alla chimica.
  8. Collegare la presa all'estremità sinistra del collettore (#10 figura 1) all'ingresso del bubbler più a destra (#11 figura 1).
  9. Lasciare l'impostazione preliminare nel cofano del fume se lo spazio è disponibile. Fissare i due adattatori a gomito in vetro con tubi attaccati (#5,6 nella Figura 1) al reticolo metallico nel cofano fume quando l'esperimento non è in esecuzione.

2. Configurazione di attrezzature e vetro – da eseguire durante ogni esperimento

CAUTION: Tutte le fasi che coinvolgono solventi richiedono l'uso di un cappuccio di fumi chimico e di un adeguato equipaggiamento di protezione personale (PPE), compresi occhiali di sicurezza, camice da laboratorio e guanti. L'impostazione di fabbricazione delle nanoparticelle deve essere assemblata nel cofano del fumi.

  1. Posizionare la piastra di mescolare nel cappuccio del fume e mettere il mantello di riscaldamento sopra la piastra di mescolare.
    NOTA: Il mantello riscaldante deve essere in grado di resistere a temperature superiori a 300 gradi centigradi.
  2. Mettere il flacone inferiore rotondo da 4 collo da 500 mL sul mantello di riscaldamento e fissare il collo centrale con un morsetto ad artiglio metallico. Aggiungere una barra di mescolare magnetica al pallone inferiore rotondo. Posizionare l'imbuto di vetro nel collo centrale del pallone inferiore rotondo.
  3. Controllare il collettore: assicurarsi che l'interruzione di sicurezza (#10 nella Figura 1) e l'input stopcock (#4 in Figura 1) siano aperti.
    CAUTION: Il fermata di sicurezza deve essere sempre aperto per assicurare che nel sistema non si costruisa alcuna pressione. Se il stopcock è chiuso, può verificarsi un'esplosione.
  4. Pesare 1,51 g di manganese (II) acetylacetonate (Mn(II) ACAC) e posizionare all'interno del flacone inferiore rotondo utilizzando l'imbuto di vetro.
  5. Aggiungere 20 mL di oleylamina e 40 mL di etere dibenzyl al flacone di fondo rotondo utilizzando una pipetta di vetro e l'imbuto di vetro. Rimuovere l'imbuto e pulirlo con esano.
    CAUTION: L'esperimento può essere scalato (ad esempio, 2 volte), ma si consiglia di essere conservativo quando si utilizzano quantità maggiori di reanti. Grandi quantità di reazionanti potrebbero causare la reazione a diventare meno stabile, e quindi pericoloso.
  6. Fissare il condensatore al collo sinistro del pallone inferiore rotondo e fissare il condensatore con un morsetto artiglio metallico. Aggiungere l'adattatore a gomito in vetro (#6 nella Figura 1) sopra il condensatore.
    NOTA: L'adattatore deve essere collegato con tubi resistenti alla sostanza chimica al bubbler dell'olio minerale centrale (#7 in Figura 1).
  7. Collegare i tubi compatibili con l'acqua dal beccuccio di uscita dell'acqua nel cofano di fumi (#12 nella Figura 1) all'ingresso del condensatore (#13 nella Figura 1). Utilizzare anche tubi compatibili con l'acqua per collegare la presa del condensatore (#14 nella Figura 1) allo scarico nel cofano di fumi (#15 in Figura 1). Fissare il tubo alle connessioni del condensatore (#13,14 in Figura 1) con morsetti tubo metallico ingranaggio verme interbloccati.
  8. Aggiungere la trappola rotovap al collo destro del pallone di fondo rotondo. Posizionare l'adattatore a gomito in #5 nella Figura 1sopra la trappola rotovap.
    NOTA: l'adattatore deve essere collegato con tubi resistenti alla sostanza chimica alla presa di collettore di stopcock destra (#4 in Figura 1).
  9. Fissare il tappo di gomma al collo centrale del pallone inferiore rotondo e piegarlo sopra in modo che i lati copino il collo del pallone. Aggiungere le clip articolari coniche di plastica (4 clip verdi nella Figura 1) per fissare le seguenti connessioni al collo di vetro: adattatore a gomito e trappola rotovap, trappola rotovap e fiaschetta inferiore rotonda, fiaschetta inferiore rotonda e condensatore, e condensatore e adattatore a gomito.
  10. Posizionare la sonda di temperatura nel collo più piccolo nel flacone inferiore rotondo, stringendo e fissando la sonda con il tappo del collo e l'o-ring. Sigillare la connessione con pellicola di plastica paraffina.
    NOTA: Assicurarsi che la sonda di temperatura sia immersa all'interno della miscela di fluidi, ma non tocchi il fondo del vetro. Se la sonda è in contatto con la superficie del vetro, la temperatura misurata sarà imprecisa rispetto alla temperatura del fluido reale, che farà sì che il controllore della temperatura fornisca una quantità errata di calore alla reazione.
  11. Collegare la sonda di temperatura all'ingresso del controller di temperatura. Collegare il mantello riscaldante all'uscita del controller di temperatura.
  12. Accendere la piastra di mescolare e iniziare a mescolare vigorosamente.
  13. Aprire il serbatoio di azoto senza aria e iniziare lentamente a fluire azoto nel sistema (questo rimuoverà l'aria). Regolare il flusso di azoto utilizzando il regolatore fino a formare un flusso lento costante di bolle nel bubbler dell'olio minerale centrale (#7 in Figura 1).
  14. Accendere l'acqua fredda nel cofano fume (#12 figura 1) al condensatore e verificare che non ci siano perdite d'acqua dal tubo.
  15. Mettere giù la fascia del cappuccio dei fumi prima che inizi la reazione.

3. Sintesi delle nanoparticelle

  1. Accendere il controller di temperatura (alimentazione e alimentazione di riscaldamento) per avviare la reazione. Osservare e registrare il colore della miscela di reazione in ogni fase. La reazione inizierà come un colore marrone scuro nelle fasi da 1 a 3 e diventerà verde durante la fase 4.
    NOTA: Ogni controller di temperatura funzionerà in modo diverso. Assicurarsi di utilizzare il manuale e il programma corretti.
  2. Fase 1: Osservare il display del controllore di temperatura per confermare l'aumento della temperatura dalla temperatura ambiente a 60 gradi centigradi oltre i 30 minuti.
  3. Fase 2: Assicurarsi che il controllore della temperatura si stabilizzi a 60 gradi centigradi per 1 min mentre si prepara per un tasso di riscaldamento più veloce nella fase 3.
  4. Fase 3: Controllare il display del controllore di temperatura come la temperatura sale a 280 gradi centigradi a 10 gradi centigradi al minuto oltre 22 min. Assicurarsi che il flusso d'acqua attraverso il condensatore sia sufficiente, poiché la miscela inizierà a evaporare durante questa fase.
  5. Fase 4: Verificare che il controllore della temperatura visualizzi una temperatura di reazione costante di 280 gradi centigradi per 30 min. Osservare il cambiamento del colore di reazione in un tono verde, che indica la formazione MnO. Una volta che la reazione raggiunge i 280 gradi centigradi, spegnere il serbatoio di azoto e chiudere il punto di arresto destro per l'ingresso della reazione sul collettore (#4 in Figura 1).
    CAUTION: Mantenere aperto il servizio di #10 (in Figura 1).
  6. Fase 5: Controllare il display del controller di temperatura per assicurarsi che il riscaldamento si fermi automaticamente. Tenere la sonda di temperatura all'interno (non aprire il pallone inferiore rotondo) e attendere che la temperatura raggiunga la temperatura ambiente per procedere con la raccolta delle nanoparticelle.
    CAUTION: Il pallone sarà estremamente caldo. I guanti resistenti al calore devono essere indossati per rimuovere il mantello di riscaldamento se si desidera una velocità di raffreddamento più veloce.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

4. Raccolta nanoparticelle

  1. Spegnere il controller di temperatura, la piastra di mescolare e l'acqua fredda. Rimuovere il tubo compatibile con l'acqua dal condensatore, il rubinetto dell'acqua nel cappuccio dei fumi e lo scarico. Rimuovere tutte le clip articolari coniche in plastica dalle connessioni vetreria.
  2. Rimuovere gli adattatori a gomito in vetro dalla trap rotovap (#5 nella Figura 1) e dal condensatore (#6 in Figura 1). Fissare gli adattatori a gomito al reticolo metallico nel cofano da utilizzare per un esperimento futuro.
  3. Staccare il condensatore e la trappola rotovap dal fiaschetta inferiore rotondo e risciacquare l'interno del condensatore e la trappola rotovap con esano.
  4. Rimuovere il tappo di gomma e la sonda di temperatura e pulire con il 70% di etanolo.
  5. Versare la soluzione di nanoparticelle MnO dal pallone di fondo rotondo in un becher pulito da 500 mL. Utilizzare l'esano (5 mL) per risciacquare il fiaschetto inferiore rotondo e aggiungere l'esano con nanoparticelle MnO residue nel becher da 500 mL.
    NOTA: Hexane risuonerà le nanoparticelle MnO, mentre 200 etanolo a prova agiranno come agente precipitante.
  6. Si noti il volume attuale della miscela di nanoparticelle MnO. Aggiungere 200 etanolo a prova alla miscela di nanoparticelle di MnO utilizzando un rapporto di volume di 2:1 (ad esempio, aggiungere 150 mL di etanolo se la miscela di nanoparticelle è di 75 mL).
  7. Versare equamente la miscela di nanoparticelle in quattro tubi di centrifuga, circa 3/4 pieni. Vite sui tappi appropriati. Verificare che i livelli di fluido siano bilanciati.
    NOTA: Qualsiasi miscela di nanoparticelle extra verrà aggiunta ai tubi nel prossimo ciclo di centrifugazione.
  8. Nanoparticelle centrifughe per 10 min a 17.400 x g a 10 gradi centigradi.
    NOTA: tempi di centrifugazione più lunghi e/o velocità di centrifugazione più elevate possono essere utilizzati per aumentare la raccolta di frazioni di nanoparticelle più piccole, ma l'aggregazione di nanoparticelle può essere aumentata.
  9. Scartare il supernatant in un bicchiere di rifiuti, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Se necessario, utilizzare una pipetta di trasferimento per raccogliere il supernatant.
    NOTA: È normale che i primi giri di centrifugazione producano un supernante di colore marrone. Il supernatanto dovrebbe essere marrone e chiaro, ma non nuvoloso. Qualsiasi nuvolosità indica che le nanoparticelle sono ancora presenti nel supernatanto. Se il supernatanto è nuvoloso, centrifugare nuovamente i tubi prima di scartare il supernatant; la centrifugazione ridurrà nuovamente la perdita delle nanoparticelle sintetizzate, ma può causare più agglomerazione.
  10. Aggiungere 5 mL di esano e qualsiasi soluzione di nanoparticelle extra lasciata ad ogni tubo di centrifuga contenente i pellet delle nanoparticelle MnO. Risundere le nanoparticelle utilizzando un sonicatore da bagno e/o vortice. Continuare fino a quando la soluzione diventa torbid e il pellet scompare, il che indica la ricorsione di nanoparticelle di successo.
  11. Aggiungere altri 200 etanolo a prova ai tubi di centrifuga fino a 3/4 pieno.
  12. Ripetere i passaggi 4.8-4.10. Quindi, combinare le nanoparticelle rispese da quattro tubi di centrifuga a due tubi centrifuga. Ripetere quindi il passaggio 4.11.
  13. Ripetere i passaggi 4.8-4.10 ancora una volta, che farà un totale di tre lavaggi con esano e 200 etanolo di prova. Non aggiungere 200 etanolo a prova ai tubi di centrifuga.
  14. Combinare e trasferire le nanoparticelle MnO rispese in esano in una fiala di scintillazione di vetro preacido di 20 mL. Lasciare il coperchio della fiala spento per consentire all'esano di evaporare durante la notte nel cappuccio dei fumi.
  15. Il giorno successivo, trasferire la fiala di scintillio di vetro scoperto contenente le nanoparticelle in un forno a vuoto. Tenere il coperchio per la fiala in un luogo sicuro al di fuori del forno. Asciugare le nanoparticelle a 100 gradi centigradi per 24 ore.
  16. Una volta che le nanoparticelle sono essiccate, utilizzare una spatola per rompere la polvere all'interno della fiala. Pesare la fiala contenente nanoparticelle di MnO essiccate e sottrarre il peso noto della fiala scintillatura del vetro per determinare la resa delle nanoparticelle.
    CAUTION: Le nanoparticelle secche possono facilmente diventare trasportate dall'aria e devono essere maneggiate dal personale utilizzando un respiratore di particelle come N95 o P100.
  17. Conservare le nanoparticelle a temperatura ambiente all'interno della fiala scintilla di vetro con il coperchio. Avvolgere il coperchio con pellicola di plastica paraffina.

5. Dimensioni delle nanoparticelle e morfologia superficiale (TEM)

  1. Polverizzare le nanoparticelle di MnO in una polvere sottile usando un mortaio e un pestello.
  2. Aggiungere 5 mg di nanoparticelle MnO a un tubo di centrifugazione conica da 15 mL. Aggiungere 10 mL di 200 etanolo a prova.
    NOTA: 200 etanolo a prova evapora rapidamente per ottenere una diffusione più omogenea delle nanoparticelle sulla griglia TEM. Un altro solvente potrebbe avere una migliore sospensione delle nanoparticelle, ma richiederebbe più tempo per evaporare, e a causa della tensione superficiale, le nanoparticelle si accumulano ai bordi delle griglie TEM.
  3. Bagno sonicare la miscela di nanoparticelle per 5 min o fino a quando la completa resuspensione delle nanoparticelle.
  4. Immediatamente dopo la resuspensione, aggiungere tre gocce di 5 L della miscela di nanoparticelle su una pellicola di supporto a griglia di rame a 300 maglie di tipo B. Lasciare asciugare l'aria.
    1. Utilizzare una pinzetta inversa per una preparazione più semplice del campione. Posizionare la griglia sulle pinzette con il lato più scuro verso l'alto prima di aggiungere le gocce contenenti nanoparticelle.
      NOTA: Le griglie sono fragili, quindi fare attenzione a non piegare e danneggiare le griglie per una migliore imaging. Una volta asciutte, le griglie devono essere conservate all'interno di scatole di stoccaggio della rete TEM disponibili in modo commerciale per la protezione.
  5. Valutare la forma e le dimensioni delle nanoparticelle utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Applicare parametri tipici per TEM, tra cui una resistenza del fascio di 200 kV, una dimensione spot di 1 e un ingrandimento di 300x.
  6. Raccogliere immagini su aree della griglia in cui sono distribuite in modo uniforme un numero sufficiente di nanoparticelle (10 - 30 nanoparticelle). Evitare le aree contenenti aggregazioni di nanoparticelle, poiché il dimensionamento accurato non può essere effettuato se le nanoparticelle non sono visibilmente separate.
    1. Aree di immagine da diversi quadrati della griglia per garantire una distribuzione uniforme. Per una distribuzione ottimale delle dimensioni, prendere tra 25 - 30 immagini da ogni campione per ottenere una dimensione del campione sufficiente.

6. Analisi quantitativa del diametro delle nanoparticelle

  1. Per analizzare le immagini TEM con ImageJ, aprire prima una delle immagini facendo clic su File . Aprire. Selezionare l'immagine desiderata e fare clic su Apri.
  2. Per calibrare la misurazione della distanza in ImageJ da pixel a nanometri, fate prima clic sullo strumento linea retta. Tenere premuto il tasto Maiusc e tracciare la lunghezza della barra della scala. Quindi, fare clic su Analizza . Imposta scala.
  3. Nella finestra a comparsa Imposta scala, digitare la misura della barra della scala reale nella casella Distanza nota (ad esempio, digitare 50 se la barra della scala è 50 nm). Modificare l'unità di lunghezza in base alle unità corrispondenti (ad esempio, digitare nm per i nanometri). Selezionare la casella Globale per mantenere la scala coerente in tutte le immagini e fare clic su OK.
  4. Dopo aver impostare la scala, utilizzare lo strumento linea retta per tracciare il diametro di una nanoparticella. Quindi fare clic su Analizza . Misurare o fare clic sui tasti Ctrl e M.
  5. Cercare una finestra popup dei risultati da visualizzare con informazioni diverse sulla misurazione. Verificare che la colonna Lunghezza sia presente, in quanto fornirà il diametro delle nanoparticelle con le unità specificate durante il punto 6.3.
  6. Ripetere il passaggio 6.4 fino a quando tutte le nanoparticelle dell'immagine non vengono ridimensionate. Per passare all'immagine successiva, fare clic su File . Aprire i tastiAvanti o Ctrl .
  7. Dopo che tutte le nanoparticelle sono state dimensionate in tutte le immagini, vai alla finestra Risultati e fai clic su File . Salva con nome. Rinominare il file dei risultati e fare clic su Salva. Visualizzare e analizzare tutti i diametri delle nanoparticelle in un foglio di calcolo dopo l'importazione del file dei risultati.

7. Composizione di massa nanoparticelle (XRD)

  1. Se non fatto durante il punto 5.1, polverizzare le nanoparticelle MnO in una polvere sottile utilizzando un mortaio e pestello. Posizionare la polvere di nanoparticelle fine nel supporto del campione utilizzando una spatola. Seguire la procedura di caricamento di esempio specificata per la macchina diffrazione a raggi X (XRD) da utilizzare.
  2. Determinare la composizione in blocco delle nanoparticelle di MnO utilizzando XRD. Raccogliere gli spettri XRD su un intervallo di 2θ da 10 a 110 per visualizzare i picchi di MnO (da 30 a 90 gradi) e Mn3O4 (da 15 a 90 gradi).
    NOTA: Altri parametri di impostazione consigliati per XRD sono una dimensione del passo di 0,05 s, una maschera di trave di 10 mm e un tempo di 64,77 s.
  3. Salvare il file generato. XRD e aprirlo nel programma di analisi XRD.

8. Analisi degli spettri XRD

  1. Nel programma di analisi XRD, identificare tutti i picchi principali nello spettro XRD misurato del campione facendo clic sul pulsante IdeAll nel software.
  2. Per salvare i dati, selezionare File sulla barra degli strumenti, seguito da Salva con nome... per salvare i dati come file ASC che può essere aperto con un foglio di calcolo.
  3. Utilizzate il programma per trovare la corrispondenza del database XRD dei composti noti per trovare la migliore corrispondenza di composizione con il campione. Per restringere la ricerca, specificare i composti previsti (ad esempio, manganese e ossigeno).
    1. Per trovare una corrispondenza con lo spettro, selezionare Analisi Cerca e corrispondenza. Nella finestra pop-up, selezionare Chimica e fare clic sugli elementi chimici desiderati per limitare la ricerca del programma in base al campione.
    2. Una volta scelti tutti gli elementi, selezionare Cerca. Attendi che appaia un elenco di composizioni chimiche corrispondenti allo spettro XRD.
      NOTA: Il programma fornirà la probabilità che gli spettri XRD noti corrispondano alla composizione del campione. Se si scelte due o più composizioni, il programma darebbe la percentuale di composizione di ciascuna di esse (ad esempio, MnO contro Mn3O4).
  4. Se lo si desidera, rimuovere lo sfondo dallo spettro XRD facendo clic sul pulsante Adatta sfondo ( Equation 1 ). Quindi, fare clic su Sfondo nella finestra popup, seguito da Sottrai. Verificare che lo spettro venga visualizzato a partire da 0 sull'asse y.
    1. Salvare nuovamente i dati senza lo sfondo, come illustrato nel passaggio 8.2.
  5. Quando tracciate lo spettro XRD, mostrate i picchi caratteristici di ogni composto abbinato (ad esempio, MnO e Mn3O4).
    1. Per ottenere l'elenco dei picchi caratteristici per i composti corrispondenti dal database, fare prima clic con il pulsante destro del mouse sullo spettro di corrispondenza del modello, quindi selezionare Mostra modello. Attendere che venga visualizzata una finestra popup con tutte le informazioni di picco corrispondenti al modello selezionato.
    2. Selezionare, copiare e incollare le informazioni desiderate da tale composto e tracciare i picchi caratteristici con lo spettro XRD misurato in un programma di fogli di calcolo.

9. Composizione della superficie delle nanoparticelle (FTIR)

  1. Aggiungere la polvere di nanoparticella MnO secca al supporto del campione per l'analisi della spettroscopia a infrarossi (FTIR) di Fourier.
  2. Valutare la chimica della superficie delle nanoparticelle utilizzando FTIR. Raccogliere spettri FTIR tra un intervallo di lunghezza d'onda di 4000 e 400 cm-1 con una risoluzione di 4 cm-1.
  3. Pulire il supporto del campione FTIR e aggiungere l'oleylamina liquida. Ripetere il passaggio 9.2.

10. Analisi degli spettri FTIR

  1. Nel programma di analisi FTIR, rimuovere lo sfondo dallo spettro FTIR raccolto selezionando Trasformazioni nel menu a discesa, seguito da Correzione linea di base. Selezionare Lineare come tipo di correzione.
  2. Utilizzare il tasto sinistro del mouse per selezionare i punti della linea di base sullo spettro originale. Al termine, salvare lo spettro con un altro nome selezionando Aggiungi o sostituisci lo spettro precedente selezionando Sostituisci.
    NOTA: La correzione dello sfondo può migliorare la prevalenza di picchi di interesse FTIR più deboli.
  3. Per esportare lo spettro FTIR, selezionare prima lo spettro specifico dall'elenco. Quindi, fare clic su File sulla barra degli strumenti, seguito da Esporta spettro.
  4. Scegliere formato di file csv dalla finestra Salva con nome e fare clic su Salva. Aprire e rappresentare graficamente il file csv utilizzando un foglio di calcolo.
  5. Confrontare la nanoparticella MnO acquisita con gli spettri FTIR di oleylamina come descritto nella sezione Risultati rappresentativi per valutare il limite delle nanoparticelle con l'oleylamina.

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Representative Results

Per confermare la corretta sintesi, le nanoparticelle di MnO devono essere analizzate per dimensioni e morfologia (TEM), composizione di massa (XRD) e composizione superficiale (FTIR). La figura 2 mostra immagini TEM rappresentative di nanoparticelle MnO sintetizzate utilizzando rapporti decrescenti di oleylamina (OA, lo stabilizzatore) all'etere dibenzyl (DE, il solvente organico): 60:0, 50:10, 40:20, 30:30, 20:40, 10:50. Le immagini TEM ideali sono costituite da singole nanoparticelle (mostrate come ottagoni arrotondati scuri nella Figura 2), con una sovrapposizione minima. È fondamentale ottenere un'adeguata separazione delle nanoparticelle per un dimensionamento manuale accurato dei diametri delle nanoparticelle utilizzando lo strumento di traccia della linea in ImageJ.

La figura 3 mostra la preparazione del campione TEM non ottimale. Se un'alta concentrazione di nanoparticelle MnO viene sospesa nell'etanolo o troppe gocce di sospensione delle nanoparticelle vengono aggiunte alla griglia TEM, ogni immagine sarà costituita da grandi agglomerazioni di nanoparticelle (Figura 3A,B). A causa della sostanziale sovrapposizione di nanoparticelle, i limiti di ogni diametro delle nanoparticelle non possono essere distinti, il che impedisce una misurazione accurata. Se viene preparata una bassa concentrazione di nanoparticelle nell'etanolo, le nanoparticelle potrebbero essere ben separate, ma distribuite scarsamente sulla griglia TEM (Figura 3C,D). Quando in ogni immagine TEM appaiono solo una o due nanoparticelle, è necessario acquisire più immagini per ottenere una dimensione del campione sufficientemente grande e la distribuzione completa potrebbe non essere acquisita con precisione. Il protocollo di preparazione TEM descritto qui stesso mira a produrre immagini TEM con circa 10-30 nanoparticelle per immagine (più nanoparticelle possono essere ospitate per immagine se il diametro è piccolo).

TEM può essere utilizzato per valutare i cambiamenti nella dimensione delle nanoparticelle con una variazione nei parametri di sintesi. La figura 4 mostra i diametri medi delle nanoparticelle MnO sintetizzate con rapporti decrescenti di OA:DE. I diametri per ogni condizione di sintesi sono stati quantificati da 75 a 90 immagini TEM, con un totale di 900-1100 nanoparticelle MnO analizzate per condizione. Per garantire la riproducibilità, sono stati sintetizzati 3 lotti di nanoparticelle per ogni rapporto OA:DE. Nel complesso, una diminuzione del rapporto tra OA:DE ha prodotto nanoparticelle MnO più piccole con meno variazioni di dimensioni; l'unica eccezione si è verificata quando solo l'OA è stato utilizzato durante la sintesi, che ha prodotto nanoparticelle di dimensioni simili al rapporto 30:30. Gli istogrammi che mostrano la distribuzione completa di tutti i gruppi di nanoparticelle MnO vengono visualizzati nella Figura S2.

Dopo aver confermato le dimensioni delle nanoparticelle e la morfologia con TEM, la composizione delle nanoparticelle sfusa può essere testata utilizzando XRD. Misurando l'angolo e l'intensità del fascio di raggi X diffracted dal campione, XRD può essere utilizzato per determinare la struttura e la fase del cristallo delle nanoparticelle. La figura 5A-F mostra gli spettri XRD grezzi raccolti per ogni campione di nanoparticelle MnO sintetizzato con rapporti decrescenti di OA:DE. I picchi XRD ottenuti sugli spettri campione sono abbinati ai picchi XRD da composti noti come MnO e Mn3O4 attraverso il database del programma di analisi XRD. I picchi standard per MnO vengono visualizzati a 35, 40, 58, 70, 73 e 87, come illustrato nella Figura 5G. Quando si confrontano gli spettri XRD nanoparticelle con noti MnO, è evidente che tutti gli spettri delle nanoparticelle possiedono i 5 picchi più alti di MnO, indicando una sintesi di successo delle nanoparticelle di MnO. XRD può anche essere utilizzato per stimare le dimensioni delle nanoparticelle utilizzando l'equazione di Scherrer; picchi più ampi su XRD indicano diametri di nanoparticelle più piccoli. Ad esempio, la figura 5F con i picchi XRD più ampi è associata alle nanoparticelle più piccole, come mostrato da TEM (18,6 x 5,5 nm).

La figura 6 mostra gli spettri XRD di due prodotti indesiderati nella sintesi delle nanoparticelle MnO. Per incoraggiare la formazione della fase MnO ad alte temperature (280 o C), l'azoto viene utilizzato durante la sintesi delle nanoparticelle pereliminare l'aria dal sistema. Se si applica un flusso di azoto inadeguato, una composizione mista di Mn3O4 (51%) e MnO (49%) viene prodotto (Figura 6A). Attraverso il confronto con i picchi standard di Mn3O4 (Figura 6C) e MnO (Figura 6D), il basso flusso di azoto produce spettri XRD con gli 8 picchi più alti per Mn3O4 e i 5 picchi più alti per MnO. TEM di nanoparticelle sintetizzate sotto basso flusso di azoto hanno rivelato una popolazione mista di grandi nanoparticelle circondate da nanoparticelle più piccole (Figura 6E). Il flusso di azoto può essere monitorato attraverso la lettura del regolatore di azoto e la velocità di gorgogliamento attraverso il gorgogliatore di olio minerale. Un altro parametro critico nella sintesi delle nanoparticelle MnO è l'inclusione di uno stabilizzatore. Nel tentativo di produrre nanoparticelle MnO ancora più piccole rispetto al rapporto 10:50 OA:DE, il DE puro è stato utilizzato senza alcun OA. Una piccola quantità di una polvere sconosciuta è stata sintetizzata in assenza di stabilizzatore. Come mostrato nella Figura 6B, gli spettri XRD per il rapporto 0:60 OA:DE erano rumorosi e contenevano i 3 picchi più alti di Mn3O4. Dall'analisi nel database del programma XRD, il composto aveva una composizione chimica di 67% Mn3O4 e 33% MnO. Come sostenuto dai picchi ampi negli spettri XRD, il TEM ha confermato che le nanoparticelle molto piccole sono state sintetizzate in assenza di stabilizzatore (Figura 6F). Le nanoparticelle apparivano anche di forma irregolare e agglomerate. Inoltre, solo un 33% resa è stato ottenuto senza alcun stabilizzatore, il che significa che una piccola quantità di prodotto è stato sintetizzato. Pertanto, l'elevato flusso di azoto e l'inclusione di uno stabilizzatore come l'OA o l'acido oleico sono necessari per la sintesi delle nanoparticelle di MnO.

Per integrare la composizione delle nanoparticelle sfusa con XRD, la composizione della superficie può essere valutata utilizzando FTIR. La figura 7 mostra gli spettri FTIR delle nanoparticelle MnO dopo la correzione dello sfondo. Tutti gli spettri mostrano i picchi simmetrici easimmetrici CH 2 (2850-2854 e 2918-2926 cm-1, contrassegnati da asterischi) associati ai gruppi oleici60, oltre ai picchi di vibrazione piegatura NH2 (1593 cm-1 e 3300 cm-1, contrassegnati da quadrati) associati ai gruppi di amine61. Poiché le nanoparticelle MnO condividono gli stessi picchi per i gruppi oleili e i gruppi di ammine presenti negli spettri FTIR di OA(Figura S3),si può concludere che le nanoparticelle sono rivestite con uno strato superficiale di OA. Inoltre, tutti gli spettri FTIR nanoparticelle contengono vibrazioni di legame Mn-O e Mn-O-Mn intorno a 600 cm-1 (contrassegnati da triangoli), che confermano la composizione trovata attraverso XRD62.

Figure 1
Figura 1: L'azoto e l'acqua scorrono attraverso la configurazione della sintesi delle nanoparticelle MnO.
Le connessioni di tubazione sono etichettate 1-15. L'azoto privo di aria entra (1) ed esce (2) nella colonna di essiccazione e viene indotta nell'ingresso del collettore (3). Durante la reazione, l'azoto elimina l'aria dal sistema inserendo il pavone destro sul collettore (4). L'azoto scorre dal pavone di stop al portamiera di vetro (5), trappola rotovap, fiaschetta inferiore rotonda, condensatore, adattatore a gomito di vetro (6) e attraverso una serie di due bollicine di olio minerale (7-9). Nel collettore, l'azoto in eccesso che non scorre attraverso la reazione lascerà il sistema attraverso il stopcock sinistro (10), che è collegato al bollitore di olio minerale con la più grande quantità di olio di silicone (11). Stopcock #10 è quello di rimanere sempre aperto. L'acqua fluirà dal rubinetto (12) attraverso l'ingresso del condensatore (13) e l'uscita (14) e nello scarico del cappuccio dei fumi (15). Il tubo è fissato al condensatore con morsetti metallici. Tutti i tubi devono essere tubi resistenti alla chimica ad eccezione dei tubi compatibili con l'acqua utilizzati per il condensatore. Le principali vetreria e attrezzature sono etichettate nella Figura S1. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: immagini TEM di nanoparticelle MnO sintetizzate con rapporti decrescenti di OA:DE.
Sono stati utilizzati i seguenti rapporti: (A) 60:0, (B) 50:10, (C) 40:20, (D) 30:30, (E) 20:40, (F) 10:50. Le nanoparticelle MnO appaiono come ottagoni separati e arrotondati con una sovrapposizione minima per consentire una chiara delineazione dei bordi delle nanoparticelle. Il rapporto rea reagire è stato osservato per influenzare le dimensioni complessive delle nanoparticelle, con 50:10 sintetizzando le nanoparticelle più grandi e 10:50 producendo le nanoparticelle più piccole. Le barre di scala sono 50 nm. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Immagini TEM non ottimali risultanti da una preparazione non corretta della griglia TEM.
(A,B) Se la sospensione delle nanoparticelle è troppo concentrata o se le gocce in eccesso di sospensione delle nanoparticelle vengono caricate sulla griglia TEM, le nanoparticelle si aggregano in grandi masse con notevoli sovrapposizioni. Le singole nanoparticelle non possono essere osservate nella maggior parte delle aree della griglia. (C,D) In alternativa, una bassa concentrazione di nanoparticelle potrebbe causare griglie TEM popolate da una scarsa quantità di nanoparticelle. Le singole nanoparticelle sono distanti, ma richiedono più immagini per catturare la distribuzione delle dimensioni della popolazione del campione. Le barre di scala sono 50 nm. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Diametro medio delle nanoparticelle MnO misurato dalle immagini TEM.
In generale, una minore quantità di stabilizzatore (OA) con una maggiore quantità di solvente organico (DE) ha portato a nanoparticelle MnO più piccole e uniformi. Un totale di 900-1100 diametri di nanoparticelle sono stati calcolati su immagini TEM utilizzando lo strumento di traccia delle linee in ImageJ per ogni gruppo. Le barre di errore mostrano la deviazione standard. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Spettri XRD di nanoparticelle MnO sintetizzate con rapporti decrescenti di OA:DE.
Sono stati utilizzati i seguenti rapporti: (A) 60:0, (B) 50:10, (C) 40:20, (D) 30:30, (E) 20:40, (F) 10:50. (G) I picchi di diffrazione standard per MnO vengono visualizzati dal database del programma di analisi XRD. Tutte le nanoparticelle prodotte mostrano i 5 picchi XRD ad alta intensità per MnO, indicando una sintesi di successo delle nanoparticelle di MnO. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Spettri XRD e immagini TEM di nanoparticelle indesiderate.
Gli spettri XRD sono mostrati per la sintesi delle nanoparticelle MnO utilizzando (A) il basso flusso di azoto e (B) un rapporto 0:60 di OA:DE (non è presente alcun stabilizzatore). I picchi di diffrazione standard per (C) Mn3O4 e (D) MnO vengono visualizzati dal database del programma di analisi XRD. Attraverso il confronto con gli spettri standard, il flusso diazoto inadeguato( A ) ha creato nanoparticelle con una miscela di Mn3O4 (51%) e MnO (49%). In assenza di oleylamina (B), si ottiene uno spettro XRD più ampio, che corrisponde ai 3 picchi più alti di Mn3O4. Sulla base dell'analisi eseguita dal database del programma XRD, queste nanoparticelle sintetizzate sono 67% Mn3O4 e 33% MnO. Le immagini TEM di nanoparticelle (E) sintetizzate con basso flusso di azoto mostrano grandi nanoparticelle circondate da quelle più piccole. Le immagini TEM di nanoparticelle (F) sintetizzate con un rapporto 0:60 di OA:DE mostrano nanoparticelle aggregate molto piccole con forma irregolare. Le barre di scala sono 50 nm. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Spettri FTIR di nanoparticelle MnO sintetizzati con rapporti decrescenti di OA:DE.
Sono stati utilizzati i seguenti rapporti: (A) 60:0, (B) 50:10, (C) 40:20, (D) 30:30, (E) 20:40, (F) 10:50. Gli asterischi e i quadrati corrispondono rispettivamente a gruppi oleyl e gruppi di ammine, mentre i triangoli indicano la vibrazione dei legami Mn-O e Mn-O-Mn. Gli inset boxed evidenziano i due picchi distinti di gruppi oleyl. Gli spettri FTIR indicano che le nanoparticelle MnO sono rivestite di oleylamina, come confermato attraverso il confronto con lo spettro solo FTIR di oleylamina nella Figura S3. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura S1: Vetro principale e attrezzature della configurazione di sintesi delle nanoparticelle MnO. Il collettore è fissato al reticolo metallico da morsetti ad artigli metallici e disperde l'azoto nella reazione. Mn(II) ACAC, etere dibenzyl, oleylamina e una barra di mescolare vengono aggiunti alla fiaschetta inferiore rotonda con quattro colli. Il collo destro del pallone è attaccato alla trappola rotovap e a un adattatore per gomito, mentre il collo sinistro è attaccato a un condensatore e a un adattatore per gomito. Il collo centrale del pallone inferiore rotondo è coperto da un tappo di gomma. La sonda di temperatura viene inserita nella più piccola apertura del pallone inferiore rotondo, ed è circondata da una pellicola di plastica o-ring e paraffina per formare una guarnizione a tenuta d'aria. Il flacone inferiore rotondo si trova sulla parte superiore di un mantello riscaldante e una piastra di mescolare per mescolare vigorosamente la reazione durante il riscaldamento. La sonda di temperatura e il mantello di riscaldamento sono collegati al controller di temperatura per fornire la regolazione automatizzata in tempo reale del profilo di temperatura. Il flacone inferiore rotondo e il condensatore sono fissati al reticolo metallico con morsetti ad artiglio metallico. Ci sono tre bollicine di olio minerale, due a sinistra e uno a destra, riempito con quantità crescenti di olio di silicone dal bollitore sinistro al bollitore destro nell'immagine. I bollicri sono anche attaccati al reticolo metallico con morsetti ad artiglio. Le clip coniche in plastica verde sono attaccate a connessioni in vetro sicure prima dell'inizio della reazione. Le connessioni di tubazioni sono descritte in dettaglio nella Figura 1. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura S2: Istogrammi che mostrano la distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle MnO per rapporti decrescenti di OA:DE. Sono stati utilizzati i seguenti rapporti: (A) 60:0, (B) 50:10, (C) 40:20, (D) 30:30, (E) 20:40, (F) 10:50. Complessivamente, con l'avvicinarsi del rapporto 10:50, la distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle si sposta verso sinistra (indicando diametri più piccoli) e diventa più compatta (indicando dimensioni più uniformi delle nanoparticelle). Il diametro medio per ogni distribuzione è mostrato nella Figura 4. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura S3: spettro FTIR di oleylamina. Gli asterischi e i quadrati rappresentano rispettivamente i gruppi oleyl e i gruppi di ammine di oleylamina. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

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Discussion

Il protocollo qui descrive una facile sintesi di nanoparticelle di MnO utilizzando Mn(II) ACAC, DE e OA. Mn(II) ACAC viene utilizzato come materiale di partenza per fornire una fonte di Mn2 per la formazione di nanoparticelle MnO. Il materiale di partenza può essere facilmente sostituito per consentire la produzione di altre nanoparticelle di ossido di metallo. Ad esempio, quando si applica il ferro(III) ACAC, le nanoparticelle Fe3O4 possono essere generate utilizzando le stesse apparecchiature di sintesi delle nanoparticelle e lo stesso protocollodescritto 63. DE serve come solvente organico ideale per le reazioni di decomposizione termica, in quanto ha un alto punto di ebollizione di 295-298 gradi centigradi.61,63 Simile al DE, L'OA ha un alto punto di ebollizione di 350 gradi centigradi per resistere alle alte temperature della decomposizione termica. Le seguenti due osservazioni possono essere utilizzate come prova di una generazione di nanoparticelle MnO durante la sintesi: 1) l'aspetto di una tonalità verde alla miscela di reazione durante la decomposizione termica a 280 gradi centigradi e 2) la formazione di un grande pellet marrone scuro sul fondo dei tubi di centrifugazione a seguito della centrifugazione in esano ed etanolo. Le nanoparticelle risultanti dovrebbero essere ulteriormente caratterizzate da TEM, XRD e FTIR per valutare rispettivamente le dimensioni/morfologia, la composizione di massa e la composizione della superficie.

Durante la sintesi delle nanoparticelle, diverse variabili devono essere annotate e controllate per garantire la produzione di nanoparticelle uniformi con la fase cristallina MnO. In primo luogo, il rapporto tra tutti i materiali di partenza dovrebbe rimanere lo stesso, come abbiamo dimostrato che i rapporti decrescenti tra OA e DE diminuiscono le dimensioni delle nanoparticelle (Figura 4). In secondo luogo, la reazione dovrebbe essere suscitata con vigore per consentire un'adeguata dispersione delle nanoparticelle nucleanti, del riscaldamento uniforme e della riduzione della variazione delle dimensioni. In terzo luogo, poiché la temperatura svolge un ruolo importante nel controllo della nanoparticella di ossido di metallodi dimensione 47,48,50 e composizione di fase47,48,50, è fondamentale immergere correttamente la punta della sonda di temperatura nella miscela di reazione senza contattare il vetro del flacone inferiore rotondo che leggerà una temperatura imprecisa. In quarto luogo, il flusso di azoto dovrebbe essere abbastanza alto da eliminare tutta l'aria dalla reazione per incoraggiare la formazione della fase cristallina MnO su Mn3O4. Come illustrato nella Figura 6A, il basso flusso di azoto si tradurrà in nanoparticelle con una composizione mista MnO/Mn3O4. Corretto riempimento dei bollitori di olio minerale con crescenti quantità di olio di silicone dal bollitore sinistro (1 pollice di olio) al bollitore centrale (1,5 pollici di olio) al bollitore destro (2 pollici di olio) imposta la resistenza per il flusso di azoto per essere più basso attraverso la reazione (#4 in Figura 1). Il tasso di gorgogliamento del gorgogliatore di olio minerale medio (di #7,8 nella figura 1) può essere utilizzato per misurare il tasso di azoto che scorre attraverso la reazione. Infine, uno stabilizzatore come l'OA deve essere aggiunto alla miscela di reazione per coordinare la nucleazione e la crescita delle nanoparticelle. Come mostrato nella Figura 6B, DE senza OA ha creato una piccola quantità di prodotto, per lo più di un Mn3O4 (67%) Composizione. Questo prodotto è stato anche osservato per avere una forma irregolare con nanoparticelle aggregate da TEM, che non si è verificato quando OA era presente nella reazione (Figura 6F).

Diverse variabili della reazione di decomposizione termica possono essere modificate per ottimizzare le dimensioni delle nanoparticelle, morfologia, e composizione compreso il tipo di gas inerte47,48,50, temperatura di reazione di picco44,47,48,49, tempo di reazione totale44,45,46, e tipi / rapporti di composti chimici iniziali utilizzati nella reazione20,45,47,48,50. Salazar-Alvarez et al.50 e Seo et al.48 hanno dimostrato che il flusso di argon durante la decomposizione termica di Mn(II) forma Mn3O4 a temperature di reazione di picco più basse che vanno da 150 gradi centigradi a 200 gradi centigradi. Quando si utilizza azoto o aria, Nolis et al.47 ha ottenuto risultati simili per la decomposizione Mn(III) ACAC, dove Mn3O4 nanoparticelle sono state prodotte a temperature più basse (150 oC o 200 o C) e le nanoparticelle MnO sono state generate solo atemperature più elevate (250 C e 300 gradi centigradi)47. Temperature di reazione di picco più elevate e tempi più lunghi tenuti alla temperatura di reazione di picco, noto anche come il tempo di invecchiamento, sono stati associati anche ad un aumento delle nanoparticelledi dimensione 44,45,46,47,48,49. Inoltre, il tasso di riscaldamento della reazione può influire sulle dimensioni delle nanoparticelle. Schladt et al.44 ha scoperto che l'aumento della velocità di riscaldamento da 1,5 gradi centigradi/min fino a90 o C/min ha fatto cadere la dimensione delle nanoparticelle da 18,9 nm a 6,5 nm, rispettivamente. Infine, diverse sostanze chimiche possono essere aggiunte come agenti di riduzione e stabilizzatori nelle reazioni di decomposizione termica del manganese; tuttavia, OA20,47,48,50 e acido oleico20,45 sono più comunemente utilizzati. Il rapporto tra OA e acido oleico ha dimostrato di influenzare la chimica e la forma delle nanoparticelle di MnO sintetizzate. Secondoil 20, OA ha portato solo alla formazione di nanoparticelle Mn3O4, una combinazione di OA e acido oleico ha portato ad una miscela di nanoparticelle Mn3O4 e MnO, e l'acido oleico ha prodotto solo nanoparticelle di MnO. È interessante notare che l'esperienza dimostra che le nanoparticelle di MnO possono essere fabbricate solo con OA, e che l'acido oleico non è necessario per promuovere la formazione della fase cristallina MnO. Inoltre, l'uso di OA da solo fabbricato nanoparticelle sferiche, mentre l'acido oleico da solo generato nanoparticelle a forma distella 20,64. Chiaramente, c'è molta flessibilità nell'alterare i parametri di sintesi per influenzare le proprietà fisiche e chimiche risultanti delle nanoparticelle di MnO.

Nonostante il protocollo dettagliato, possono verificarsi istanze che richiedono la risoluzione dei problemi. Nel paragrafo seguente vengono descritti in dettaglio alcuni problemi e soluzioni comuni. Durante la reazione, se la temperatura sembra stabilizzarsi intorno ai 100 gradi centigradi, un po 'd'acqua potrebbe essere fuoriuscita nel mantello di riscaldamento. Controllare visibilmente l'area circostante per la perdita d'acqua dal condensatore. Non toccare direttamente il mantello o il flacone di fondo rotondo senza guanti resistenti al calore, in quanto saranno molto caldi. Se si osserva acqua, spegnere immediatamente il controller di temperatura, scollegare il mantello di riscaldamento e lasciarlo asciugare durante la notte. Per evitare perdite future, utilizzare un morsetto a tubo a forma di verme interbloccato per fissare il tubo dell'acqua al condensatore. Nel caso in cui il prodotto desiderato sia MnO, ma viene prodotto solo Mn3O4, è importante controllare il flusso di azoto durante la reazione. Il gorgogliatore centrale dovrebbe avere un flusso costante di bolle (vedi il video per la corretta velocità di gorgogliamento), mentre il bubbler destro dovrebbe avere solo una o due bolle che si formano in esso. Un flusso di azoto errato può verificarsi se i livelli differenziali di olio di silicone in ogni bollitore di olio minerale non vengono mantenuti. Controllare i livelli di olio prima di ogni esperimento e riempire i bollicre secondo il punto 1.5, se necessario. Durante la raccolta delle nanoparticelle, il protocollo specifica di versare il supernatanto senza disturbare il pellet delle nanoparticelle. Il modo migliore per scartare il supernatant è quello di versarlo con un movimento continuo veloce piuttosto che uno lento. Tuttavia, se il pellet viene facilmente staccato dal tubo di centrifuga, si consiglia l'uso di una pipetta di trasferimento per rimuovere il supernante. Durante la raccolta delle nanoparticelle e la preparazione della griglia TEM, la sonicazione del bagno è un passo chiave. Se le nanoparticelle non vengono rievocate correttamente, spostare il tubo intorno al sonicatore del bagno d'acqua fino a quando non si trova un'area in cui la sonicazione può essere sentita dalla mano che tiene il tubo. Il pellet di nanoparticelle può anche essere visibilmente visto disintegrarsi sotto una forte sonicazione da bagno se il tubo è nel punto corretto. Dopo la ricorsione delle nanoparticelle, è importante che la griglia TEM sia sospesa nell'aria con pinzette inversi piuttosto che posizionata su una salvietta o direttamente su una superficie assorbente della panca. La superficie della panca assorbente o della salvia assorbente wickerà la sospensione delle nanoparticelle fuori dalla griglia TEM prima dell'essiccazione, con conseguente insufficiente deposizione di nanoparticelle sulla griglia per l'imaging.

Anche se la reazione di decomposizione termica è abbastanza semplice e semplice da seguire per sintetizzare le nanoparticelle di MnO, ci sono alcune limitazioni associate al metodo. Mentre è possibile controllare le proprietà fisiche e chimiche delle nanoparticelle in una certa misura, alcune variabili come la temperatura e il tempo di invecchiamento influiscono simultaneamente sia sulla dimensione delle nanoparticelle che sulla composizione della fase. Pertanto, è difficile avere sempre un controllo indipendente preciso delle proprietà delle nanoparticelle utilizzando questo metodo. Inoltre, l'aumento della sintesi delle nanoparticelle triplicando o quadruplicando la quantità di materiali di partenza può causare la reazione a diventare instabile e violenta. Anche le dimensioni del batch più grandi sono associate a una resa ridotta. Inoltre, nonostante lo stoccaggio di nanoparticelle di MnO all'interno di fiale scintillanti con tappo avvolto in pellicola di plastica paraffina, abbiamo visto l'ossidazione della superficie delle nanoparticelle a Mn3O4, come valutato dalla spettroscopia fotoelettro a raggi X. Infine, le nanoparticelle MnO generate da questa tecnica saranno idrofobiche e limitate all'OA (Figura 7). Sarà necessario applicare ulteriori modifiche superficiali alle nanoparticelle di transizione verso uno stato idrofilo per consentire la sospensione delle nanoparticelle in supporti aque. Sono stati istituiti diversi metodi per promuovere la dispersione delle nanoparticelle nelle soluzioni biologiche, tra cui l'incapsulamento di nanoparticelle all'interno dei polimeri14, il rivestimento della superficie delle nanoparticelle con lipidi52, o lo scambio di ligando per sostituire l'OA sulla superficie delle nanoparticelle con ligande idrofili come poli(acido acrilico)20. Per ottenere l'incapsulamento delle nanoparticelle MnO all'interno del polimerico (acido coglico) (PLGA), seguire il dettagliato protocollo JoVE 65di McCall e Sirianni; Le nanoparticelle di MnO possono essere aggiunte direttamente alla soluzione polimerica PLGA, come descritto per i farmaci idrofobici, al punto 8 della sezione Preparazione nanoparticelle. La distribuzione nanocristalla MnO all'interno delle nanoparticelle PLGA può essere valutata utilizzando il TEM e il caricamento di Mn all'interno del polimero PLGA può essere determinato dall'analisi termogravimetrica, come mostrato nella pagina .

Anche se le nanoparticelle MnO possono essere utilizzate per un'ampia varietà di applicazioni grazie alle loro proprietà magnetiche, elettroniche e catalitiche, siamo interessati ad applicare nanoparticelle MnO come agenti di contrasto T1 RMI comodibili. In precedenza, il nostro gruppo e altri hanno dimostrato che le nanoparticelle MnO intatte hanno un contrasto T1 1 RMI trascurabile (il segnale RMI è "OFF") a pH fisiologico 7.4 imitando ilsangue 14,15,16,17,18,19. Tuttavia, MnO si scioglie per creare notevoli ioni Mn2 a basso pH 5 imitando gli endosomi cellulari; rilasciato Mn2 si coordinerà con le molecole d'acqua circostanti per trasformare il segnale di risonanza magnetica "ON" a basso pH14,15,16,17,18,19. Le nanoparticelle di MnO possono essere localizzate in diverse cellule di interesse, come le cellule tumorali, attraverso l'aggiunta di peptidi o anticorpi mirati alla superficie delle nanoparticelle51,66. Qui, descriviamo la sintesi delle nanoparticelle MnO con un diametro medio che va da 18,6 nm a 38,8 nm. Il controllo delle dimensioni delle nanoparticelle può essere utile per migliorare l'efficacia dell'agente di contrasto della risonanza magnetica. In particolare, si prevede che le nanoparticelle più grandi avranno più superficie per l'attaccamento dei ligand di targeting per migliorare l'accumulo di nanoparticelle nel sito di interesse come i tumori. Tuttavia, la dimensione complessiva delle nanoparticelle con gruppi di superficie aggiunti dovrebbe essere limitata a 50-100 nm per massimizzare l'accumulodi tumore 67,68. Le nanoparticelle più piccole, d'altra parte, hanno un rapporto superficie-volume più elevato per facilitare il rilascio più rapido di Mn2 in ambienti acidi e dovrebbero consentire volumi di imballaggio di nanoparticelle potenziate all'interno di sistemi di consegna polimerica. La sintesi di MnO su Mn3O4 dovrebbe anche migliorare il contrasto della risonanza magnetica, poiché MnO ha dimostrato di dissolversi più velocemente di Mn3O4 in soluzioni acide concentrate per generare più Mn2 ioni69. In sintesi, abbiamo descritto un protocollo di decomposizione termica per la fabbricazione di nanoparticelle MnO che è relativamente semplice e personalizzabile per consentire l'ottimizzazione della progettazione delle nanoparticelle per un uso futuro in applicazioni come agenti di contrasto RMI intelligenti, biosensori, catalizzatori, batterie e purificazione dell'acqua.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di avvio del Dipartimento di Ingegneria Chimica e Biomedica WVU (M.F.B.). Gli autori ringraziano la Dott.ssa Marcela Redigolo per la preparazione della griglia e la cattura delle immagini di nanoparticelle con TEM, dr. Qiang Wang per il supporto sulla valutazione degli spettri XRD e FTIR, Dr. John e Hunter Snoderly per la programmazione e l'integrazione del controllore di temperatura nel protocollo di sintesi delle nanoparticelle, James Hall per il suo aiuto nell'assemblaggio della configurazione della sintesi delle nanoparticelle , Alexander Pueschel e Jenna Vito per aver aiutato nella quantificazione dei diametri delle nanoparticelle MnO dalle immagini TEM e del WVU Shared Research Facility per l'uso del TEM, XRD e FTIR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals and Gases
Benzyl ether (DE) Acros Organics AC14840-0010 Concentration: 99%, 1 L
Drierite W. A. Hammond Drierite Co. LTD 23001 Drierite 8 mesh, 1 lb
Ethanol Decon Laboratories  2701 200 proof, 4 x 3.7 L
Hexane Macron Fine Chemicals 5189-08 Concentration:  ≥98.5%, 4 L
Hydrochloric acid VWR BDH3030-2.5LPC Concentration: 36.5 - 38.0 % ACS, 2.5 L
Manganese (II) acetyl acetonate (Mn(II)ACAC) Sigma Aldrich 245763-100G 100 g
Nitrogen gas tank Airgas NI R300 Research 5.7 grade nitrogen, size 300 cylinder
Nitrogen regulator Airgas Y11244D580-AG Single stage brass 0-100 psi analytical cylinder regulator CGA-580 with needle outlet
Oleylamine (OA) Sigma Aldrich O7805-500G Concentration: 70%, technical grade, 500 g
Silicone oil Beantown Chemical 221590-100G 100 g
Equipment
Centrifuge Beckman-Coulter Avanti J-E JA-20 fixed-angle aluminum rotor, 8 x 50 mL, 48,400 x g
Hemisphere mantle Ace Glass Inc. 12035-17 115 V, 270 W, 500 mL, temperature up to 450 °C
Hot plate stirrer VWR 97042-642 120 V, 1000 W, 8.3 A, ceramic top
Temperature controller Yokogawa Electric Corporation UP351
Temperature probe Omega KMQXL-040G-12 Immersion probe, temperature up to 1335 °C
Vacuum oven Fisher Scientific 282A 120 V, 1800 W, temperature up to 280 °C
Vortex mixer Fisher Scientific 02-215-365 120 V, 50/60 Hz, 150 W
Water bath sonicator Fisher Scientific FS30H Ultrasonic power 130 W, 3.7 L tank
Tools and Materials
Dumont tweezer Electron Microscopy Sciences 72703D Style 5/45, Dumoxel, 109 mm, for picking up TEM grids
Dumont reverse tweezer Ted Pella 5748 Style N2a, 118 mm, NM-SS, self-closing, holding TEM grids in place for sample preparation
Mortar and pestle Amazon BS0007 BIPEE agate mortar and pestle, 70 X 60 X 15 mm labware
Nalgene™ Oak Ridge tubes ThermoFisher Scientific 3139-0050 Polypropylene copolymer, 50,000 x g, 50 mL, pack of 10
Scintillation vials Fisher Scientific 03-337-4 20 mL vials with white caps, case of 500
TEM grids Ted Pella 01813-F Carbon Type-B, 300 mesh, copper, pack of 50
Glassware Setup
4-neck round bottom flask Chemglass Life Sciences CG-1534-01 24/40 joint, 500 mL, #7 chem thread for thermometers
6-port vacuum manifold Chemglass Life Sciences CG-4430-02 480 nm, 6 ports, 4 mm PTFE stopcocks
Adapter Chemglass Life Sciences CG-1014-01 24/40 inner joint, 90°
Condenser Chemglass Life Sciences CG-1216-03 24/40 joint, 365 mm, 250 mm jacket length
Drierite 26800 drying column Cole-Parmer  EW-07193-00 200 L/hr, 90 psi
Funnel Chemglass Life Sciences CG-1720-L-02 24/40 joint, 100 powder funnel, 195 mm OAL
Interlocked worm gear hose clamp Grainger 16P292 1/2" wide stainless steel clamp, 3/8" to 7/8" diameter, to secure condenser tubing, 10 pack 
Keck clips Kemtech America Inc CS002440 24/40 joint
Metal claw clamp Fisher Scientific 05-769-7Q 22cm, three-prong extension clamps
Metal claw clamp holder Fisher Scientific 05-754Q Clamp regular holder
Mineral oil bubbler Kemtech America Inc B257040 185 mm
Rotovap trap Chemglass Life Sciences CG-1319-02 24/40 joints, 100 mL, self washing rotary evaporator
Rubber stopper Chemglass Life Sciences CG-3022-98 24/40 joints, red rubber
Tubing for air/water  McMaster-Carr 6516T21 Clear Tygon PVC for air/water, B-44-3, 1/4" ID, 1/16" wall, 25 ft
Tubing for air/water  McMaster-Carr 6516T26 Clear Tygon PVC for air/water, B-44-3, 3/8" ID, 1/16" wall, 25 ft
Tubing for chemicals McMaster-Carr 5155T34 Clear Tygon PVC for chemicals, E-3603, 3/8" ID, 1/16" wall, 50 ft
Analysis Programs
XRD analysis program Malvern Panalytical N/A X'Pert HighScore Plus
FTIR analysis program Varian, Inc. N/A Varian Resolutions Pro

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Sintesi di Nanoparticolo di ossido di Manganese per decomposizione termica di Manganese(II) Acetylacetonate
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Martinez de la Torre, C., Bennewitz, … More

Martinez de la Torre, C., Bennewitz, M. F. Manganese Oxide Nanoparticle Synthesis by Thermal Decomposition of Manganese(II) Acetylacetonate. J. Vis. Exp. (160), e61572, doi:10.3791/61572 (2020).

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