توليد مكتبات الإدراج Transposon في البكتيريا السلبية الغرامية لتسلسل عالي الإنتاجية

Summary

نحن وصف طريقة لتوليد مكتبات متحولة تشبع transposon في البكتيريا السلبية الغرام وإعداد لاحقة من مكتبات ابيرليكون الحمض النووي لتسلسل عالية الإنتاجية. على سبيل المثال، ونحن نركز على مسببات الأمراض ESKAPE، Acinetobacter baumannii، ولكن هذا البروتوكول هو قابل لمجموعة واسعة من الكائنات الحية سلبية الغرام.

Abstract

إن تسلسل الـ Transposon (Tn-eq) هو طريقة قوية تجمع بين التوازج المُتَرْكَمِيّة المُتَرْكِم والتسلسل المُزَاَتِقِي لتحديد الجينات والمسارات التي تُسهم في اللياقة البدنية الجرثومية في ظل مجموعة واسعة من الظروف البيئية. 31 – إن تطبيقات Tn-eq هي تطبيقات واسعة النطاق ولم تُمكّن فقط من فحص العلاقات بين النمط الجيني والفينوين على مستوى الكائنات الحية، بل أيضاً على مستوى السكان والمجتمع المحلي والنظم. ترتبط البكتيريا السلبية بالجرام ارتباطًا كبيرًا بالأنماط الظاهرية المقاومة للميكروبات ، والتي زادت من حوادث فشل العلاج بالمضادات الحيوية. تُعرَّف مقاومة مضادات الميكروبات بأنها نمو البكتيريا في وجود مضادات حيوية قاتلة. يستخدم الكُليسين المضاد للميكروبات “الخط الأخير” لعلاج العدوى البكتيرية السالبة بالجرام. ومع ذلك ، يمكن أن العديد من مسببات الأمراض سلبية الغرام ، بما في ذلك Acinetobacter baumannii تطوير مقاومة colistin من خلال مجموعة من الآليات الجزيئية ، والتي تم وصف بعضها باستخدام Tn-seq. وعلاوة على ذلك، تختلف مسارات نقل الإشارة التي تنظم مقاومة الكولستين داخل البكتيريا السالبة للجرام. هنا نقترح طريقة فعالة من التحول المطفرة في A. baumannii أن يبسط توليد مكتبة الإدراج transposon تشبع وبناء مكتبة أمليكون من خلال القضاء على الحاجة إلى الإنزيمات تقييد, ربط محول, وتنقية هلام. الأساليب المذكورة هنا ستمكن من التحليل المتعمق للمحددات الجزيئية التي تسهم في اللياقة البدنية A. baumannii عندما تحدى مع colistin. كما ينطبق البروتوكول على مسببات الأمراض الأخرى ESKAPE السلبية للجرام ، والتي ترتبط في المقام الأول بالعدوى التي يتم الحصول عليها من المستشفيات المقاومةللأدوية.

Introduction

اكتشاف المضادات الحيوية هو بلا شك واحدة من الأحداث الأكثر تأثيرا ذات الصلة بالصحة في^القرن 20. لا تقتصر المضادات الحيوية على حل الالتهابات البكتيرية الخطيرة بسرعة، بل تلعب أيضًا دورًا محوريًا في الطب الحديث. العمليات الجراحية الكبرى، وعمليات زرع وتقدم في طب حديثي الولادة والعلاج الكيميائي ترك المرضى عرضة للعدوى تهدد الحياة وهذه العلاجات لن يكون ممكنا من دون المضادات الحيوية^1,2. ومع ذلك ، فإن التطور السريع وانتشار مقاومة المضادات الحيوية بين مسببات الأمراض البشرية قد انخفض بشكل كبير فعالية جميع الفئات الهامة سريريًا من المضادات الحيوية³. العديد من الالتهابات البكتيرية التي تم تطهيرها مرة واحدة بسهولة مع العلاج بالمضادات الحيوية، لم تعد تستجيب لبروتوكولات العلاج الكلاسيكية، مما تسبب في تهديد خطير للصحة العامة العالمية¹. مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) هي المكان الذي تنمو فيه الخلايا البكتيرية في تركيزات قاتلة من المضادات الحيوية ، بغض النظر عن مدة العلاج^4،5. هناك حاجة ملحة لفهم العوامل الجزيئية والبيوكيميائية التي تنظم العلاج بمضادات الميكروبات، والتي ستساعد على توجيه التنمية البديلة لمضادات الميكروبات. على وجه التحديد، مسببات الأمراض ESKAPE هي إشكالية في البيئات السريرية والمرتبطة AMR واسعة النطاق. وتشمل هذه Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa وEnterobacter spp. في حين أن العديد من الآليات تساهم في AMR في مسببات الأمراض ESKAPE ، فإن الكائنات الأربعة الأخيرة سلبية الغرام.

البكتيريا السلبية الغرام تجميع غشاء خارجي محدد أن يحميهم من الظروف البيئية الضارة. يعمل الغشاء الخارجي كحاجز نفاذي لتقييد دخول الجزيئات السامة، مثل المضادات الحيوية، إلى الخلية. خلافا للأغشية البيولوجية الأخرى، والغشاء الخارجي غير متناظرة. يتم إثراء النشرة الخارجية مع lipopolysaccharide المكشوفة السطح ، في حين أن النشرة الداخلية هي مزيج من الفوسفاتية^6. يتم إرساء جزيئات Lipopolysaccharide إلى الغشاء الخارجي من قبل الحفاظ على الدهون A moiety جزءا لا يتجزأ من ثنائي الطبقات الدهنية^7. مطلوب من الدهون الكنسي المجال من الإشريكية القولونية lipopolysaccharide لنمو معظم البكتيريا سلبية الغرام ويتم تصنيعها من قبل مسار انزيمي من تسع خطوات التي هي واحدة من المسارات الأساسية الأكثر والحفاظ عليها في الكائنات الحية سلبية الغرام^6,7,8.

البوليميكسينات هي الببتيدات المضادة للميكروبات الكاتيونية التي تستهدف نطاق الدهون A من السكاريد الدهنية لاضطرابات الغشاء الخارجي وثقب الخلية. التفاعل الكهربائي بين بقايا مشحونة إيجابيا من البولي الديميسينات والدهون المشحونة سلبا مجموعات الفوسفات تعطل غشاء الخلية البكتيرية مما يؤدي في نهاية المطاف إلى موت الخلية^{9,10,11,12,13}. Colistin (بوليميكسين E) هو الملاذ الأخير المضادة للميكروبات المستخدمة لعلاج العدوى الناجمة عن عدة مسببات الأمراض المقاومة للأدوية الغرام سلبية الرضّع، مثل Acinetobacter baumannii^14،15،16. اكتشفت لأول مرة في عام 1947 ، يتم إنتاج البوليميكسينات من قبل بكتيريا التربة ، Paenibacillus بوليميكا^17،18،19. وقد وصفت polymyxins لعلاج التهابات الغرام السلبية لسنوات قبل استخدامها السريري كان محدودا بسبب تقارير عن nephro كبيرة ،^{والأعصاب 20،21}.

A. baumannii هو مرض الأمراض السلبية الغرام nosocomial التي زادت بشكل كبير من المراضة والوفيات من نتائج المرضى على مدى العقود الأخيرة²². ما كان يعتبر مرة واحدة كمسببات الأمراض منخفضة التهديد، تشكل الآن خطرا كبيرا للعدوى المكتسبة في المستشفى في جميع أنحاء العالم بسبب قدرتها لا يصدق للحصول على AMR وارتفاع خطر الوباء^23،24. ألف baumannii مسؤولة عن أكثر من 10 ٪ من الإصابات النوسومية في الولايات المتحدة. يظهر المرض مثل الالتهاب الرئوي، البكتيريا، التهابات المسالك البولية، التهابات الجلد والأنسجة الرخوة، التهاب السحايا، والتهاب الشغاف²⁵. وقد تضاءلت خيارات العلاج لعدوى A. baumannii بسبب المقاومة ضد جميع فئات المضادات الحيوية تقريبا، بما في ذلك β-lactams، الفلوروكينولون، التتراسيكلين، و aminoglycosides^23،24. وقد أدى انتشار مقاومة للأدوية المتعددة، ومقاومة للأدوية على نطاق واسع ومقاومة للأدوية A. baumannii عزل إلى عودة في علاج colistin، الذي كان يعتقد أن يكون واحدا من الخيارات العلاجية القليلة المتبقية لا تزال فعالة ضد مقاومة للأدوية المتعددة A. baumannii. ومع ذلك ، زيادة مقاومة colistin بين العزل A. baumannii قد تضخيم تهديدها للصحة العامة العالمية^{10،11،12،13،27،30،31}.

وقد وفرت التطورات الأخيرة في التكنولوجيات ذات الإنتاجية العالية التسلسل، مثل التسلسل transposon (TN-seq)، أدوات هامة لتعزيز فهمنا للياقة البدنية البكتيرية في المختبر وفي الجسم الحي. Tn-seq هي أداة قوية يمكن الاستفادة منها لدراسة التفاعلات ذات النمط الجيني-النمط الظاهري في البكتيريا. TN-seq قابلة للتطبيق على نطاق واسع عبر مسببات الأمراض البكتيرية، حيث يجمع بين التطفرة التقليدية transposon مع تسلسل متوازي ضخمة لمواقع الإدراج خريطة بسرعة، والتي يمكن استخدامها لربط طفرات الحمض النووي إلى المتغيرات الظاهرية على نطاق الجينوم على نطاق^{32،33،34،35}. في حين أن طرق التاطفرة التي تم وصفها سابقاً، فإن الخطوات العامة مماثلة³³. أولاً، يتم إنشاء مكتبة إدخال باستخدام التماطيل المُتَرَكَّة، حيث تقتصر كل خلية بكتيرية داخل مجموعة سكانية على إدخال واحد في مادة الـ DNA الجينومية (gDNA). بعد الطفرات، يتم تجميع المسوخ الفردية. يتم استخراج gDNA من تجمع متحولة الإدراج ويتم تضخيم وصلات transposon وتخضع لتسلسل عالي الإنتاجية. تمثل القراءة مواقع الإدراج، والتي يمكن تعيينها إلى الجينوم. إدراج Transposon التي تقلل من اللياقة البدنية تسقط بسرعة من السكان, في حين يتم إثراء عمليات الإدراج المفيدة. TN-seq كان له دور فعال في تعزيز فهمنا لكيفية تأثير الجينات على اللياقة البكتيرية في الإجهاد³³.

وقد تم بناء نظام همار 1 للناور بالبوافير المشفّر المشفّر في pJNW684 على وجه التحديد وجرى تحسينه على النحو الأمثل لغرض التوليد المُتَجَدّ. وهو يشمل تبديل -الأسرة البحريةيحيط جين مقاومة كاناميسين, الذي يستخدم لاختيار المسوخ transposon في A. baumannii. كما أنه يشفّر A. baumannii المروج محددة أن يدفع التعبير عن ترميز transposase الجين³⁶. يحتوي transposon أساسًامن البحار أيضًا على جهازي إنهاء تحويلي في اتجاه مجرى النهر من جين مقاومة الكاناميسين ، والذي يمنع القراءة من خلال المصب³⁷من الإدراج . pJNW684 يحمل أيضا RP4/oriT/oriR6K-مشروط أصل النسخ المتماثل الذي يتطلب الجين λpir التي ساهمت بها سلالة المانحة لتكرار³⁸. في غياب الجين λpir، لن يكون الناقل pJNW684 الذي يحمل آلية نقل القدرة على تكرار في سلالة المتلقي A. baumannii ^10،36،38. لذلك, أثناء الاقتران بكتيريّة, فقط التبّاجن يكون أدخلت داخل الالجتم جينوم دون خلفيّة إدراج من البلازميّ, أيّ يحمل الpopoase مورثة. وهذا أمر هام لأن فقدان نشاط الـ transposase جنبا إلى جنب مع نتائج البلازميد في واحد, حدث نقل مستقرة التي تمنع transposon من الانتقال إلى مواقع مختلفة بمجرد إدراجها في الجينوم المتلقي.

PJNW648 كما تم اختبار للنشاط في كائن آخر غرام سالبة، E. القولونية. وأشار التجميع الناجح لمكتبة Tn-seq المشبعة في سلالة القولونية W3110 إلى أن النظام قابل لإجراء الطفرات في مجموعة واسعة من مسببات الأمراض ، بما في ذلك Enterobacteriaceae. وعلاوة على ذلك، يمكن بسرعة تبادل المروج A. baumannii محددة التي تدفع التعبير transposase مع المروج الأنواع المحددة. وأخيراً، يمكن استبدال جين مقاومة الكاناميسين بشرائط المقاومة الأخرى، وذلك حسب النمط الظاهري AMR للكائن الحي الذي تجري دراسته.

أحد العوامل التي تساهم في مقاومة الكولستين في A. baumannii هو إدارة جرعات غير كافية ، حيث تتعرض البكتيريا لضغوط انتقائية عند مستويات غير قاتلة³⁹. وأظهرت عدة تقارير أن تركيزات مضادة للميكروبات دون الباطنية يمكن أن تحفز الاستجابات المنظمة التي تغير فسيولوجيا الخلية للحد من قابلية جميع السكان البكتيرية^11,12,30,31. باستخدام Tn-seq، اكتشفنا العوامل التي تنظم مقاومة الكليستين في سلالة A. baumannii ATCC 17978 بعد التعرض لتركيزات^{مثبطة 10} و subinhibitory من colistin. هذا المثال تفاصيل طريقة Tn-seq التي تبسط بناء وإثراء مكتبة متحولة transposon المشبعة باستخدام الأسرة أساسها marinerمن transposons^40،41. في حين أن العديد من بروتوكولات Tn-seq تولد 20،000 – 100،000 المسوخ^{35،42،43،44،45،46}، البروتوكول الموصوف هنا يمكن أن تولد بسرعة مكتبة transposon من 400،000 + المسوخ ، الذي يعادل تقريبا إلى الإدراج transposon كل أزواج 10 قاعدة في A. baumannii¹⁰. وعلاوة على ذلك، يمكن توسيع حجم المكتبة دون بذل جهد إضافي كبير. هذه الطريقة أيضا يلغي شرط تقييد endonucleases ، ربط محول وتنقية هلام ، والتي يمكن أن تقلل من تنوع المكتبة النهائية.

Protocol

1. إعداد سلالة بكتيرية خط “المانح” سلالة(E. القولونية MFD DAP-/ pJNW684، جدول المواد)للمستعمرات المعزولة على Luria-Bertani agar تكملها 600 ميكرومتر ديامينوميليك حمض (DAP)، 100 ملغ/لتر من الأمبيسيلين و 25 ملغم/لتر من kanamycin. احتضان ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية. باستخدام مستعمرة معزولة واحدة،…

Representative Results

تصف الطرق المبينة توليد مكتبة نقل عالية الكثافة في سلالة A. baumannii ATCC 17978 من خلال الاقتران البكتيري باستخدام E. coli MFD DAP-، الذي يكرر pJmid pJNW684 (الشكل 4B). البروتوكول المفصل يستخدم الاقتران البكتيرية ثنائية الوالدين لنقل pJNW684 من سلالة E. القولونية λpir+ المانح…

Discussion

A. baumannii هو تهديد ناشئ للصحة العامة العالمية بسبب الاكتساب السريع لـ AMR ضد العلاجيات “الخط الأخير” مثل colistin^{10,11,12,23,24,30,31}. في العقود الأخيرة، Tn-seq لعبت دورا حاسما …

Materials

10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate	Affymetrix	77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate	Invitrogen	10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker	Promega	PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351029
150mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351058
1X B&W	N/A	N/A	Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid	Alfa Aesar	B2239103	used at 600 µM
2X B&W	N/A	N/A	Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP	N/A	N/A	9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)	Fisher Scientific	BP1760	used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system	BECKMAN COULTER	A63881
BioAnalyzer	Agilent	G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis	Agilent	5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP)	New England Biolabs (NEB)	N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack	Invitrogen	12321D
E.coli MFD Dap-	N/A	N/A	DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol	Fisher Scientific	A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials	Corning	09-761-71
Glass beads	Corning	72684
Glycerol	Fisher Scientific	G33
Inoculating loops	Fisher Scientific	22-363-602	Scraping tool
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906	used at 25 mg/L
LB agar, Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426
LoTE	N/A	N/A	Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer	N/A	N/A	9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.)	Fisher Scientific	BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher Scientific	BP39920	Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33238
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher	Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath	Qsonica Sonicators	Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs (NEB)	S1420S
TE buffer	N/A	N/A	10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)	Promega	PR-M1875