Gerando Bibliotecas de Inserção Transposon em bactérias gram-negativas para sequenciamento de alto rendimento

Summary

Descrevemos um método para gerar bibliotecas mutantes transposon saturadas em bactérias Gram-negativas e preparação subsequente de bibliotecas de amplicon de DNA para sequenciamento de alto rendimento. Como exemplo, focamos no patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii,mas este protocolo é agradável para uma ampla gama de organismos Gram-negativos.

Abstract

O sequenciamento transposon (Tn-seq) é um método poderoso que combina mutagênese transposon e sequenciamento paralelo maciço para identificar genes e caminhos que contribuem para a aptidão bacteriana sob uma ampla gama de condições ambientais. As aplicações tn-seq são extensas e não só permitiram o exame das relações genótipo-fenótipo a nível de organismo, mas também nos níveis populacional, comunitário e de sistemas. As bactérias gram-negativas estão altamente associadas com fenótipos de resistência antimicrobiana, o que aumentou os incidentes de falha no tratamento de antibióticos. A resistência antimicrobiana é definida como crescimento bacteriano na presença de antibióticos letais de outra forma. A colistina antimicrobiana de “última linha” é usada para tratar infecções bacterianas gram-negativas. No entanto, vários patógenos Gram-negativos, incluindo Acinetobacter baumannii podem desenvolver resistência à colistina através de uma série de mecanismos moleculares, alguns dos quais foram caracterizados usando Tn-seq. Além disso, as vias de transdução de sinais que regulam a resistência à colistina variam dentro das bactérias Gram-negativas. Aqui propomos um método eficiente de mutagênese transposon em A. baumannii que agiliza a geração de uma biblioteca de inserção transposon saturada e construção de biblioteca de amplicon, eliminando a necessidade de enzimas de restrição, ligadura adaptadora e purificação de gel. Os métodos aqui descritos permitirão uma análise aprofundada dos determinantes moleculares que contribuem para a aptidão de A. baumannii quando desafiados com colistina. O protocolo também é aplicável a outros patógenos ESKAPE gram negativos, que estão principalmente associados a infecções hospitalares resistentes amedicamentos.

Introduction

A descoberta de antibióticos é, sem dúvida, um dos eventos mais impactantes relacionados à saúde do século^XX. Os antibióticos não só resolvem rapidamente infecções bacterianas graves, como também desempenham um papel fundamental na medicina moderna. Cirurgias de grande porte, transplantes e avanços em medicina neonatal e quimioterapia deixam pacientes suscetíveis a infecções que ameaçam a vida e essas terapias não seriam possíveis sem antibióticos^1,,2. No entanto, o rápido desenvolvimento e disseminação da resistência a antibióticos entre patógenos humanos diminuiu significativamente a eficácia de todas as classes clinicamente importantes de antibióticos³. Muitas infecções bacterianas que antes eram facilmente eliminadas com tratamento de antibióticos, não respondem mais a protocolos clássicos de tratamento, causando uma grave ameaça à saúde pública global¹. Resistência antimicrobiana (AMR) é onde as células bacterianas crescem em concentrações letais de antibióticos, independentemente da duração do tratamento^4,5. É urgente compreender fatores moleculares e bioquímicos que regulam a RM, o que ajudará a orientar o desenvolvimento antimicrobiano alternativo. Especificamente, os patógenos ESKAPE são problemáticos em ambientes clínicos e associados a amr extensa. Estes incluem Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter spp. Enquanto vários mecanismos contribuem para a AMR em patógenos ESKAPE, os quatro últimos organismos são Gram-negativos.

Bactérias gram-negativas montam uma membrana externa que as protege de condições ambientais adversas. A membrana externa serve como uma barreira de permeabilidade para restringir a entrada de moléculas tóxicas, como antibióticos, na célula. Ao contrário de outras membranas biológicas, a membrana externa é assimétrica. O folheto externo é enriquecido com lipopólise exposto à superfície, enquanto o folheto interno é uma mistura de fosfolipídios⁶. Moléculas de lipopolisacarídeo são ancoradas na membrana externa por um lipídio conservado Uma moiety incorporada dentro da bicamada lipídica⁷. O lipídio canônico Um domínio de Escherichia coli lipopolysaccharide é necessário para o crescimento da maioria das bactérias Gram-negativas e é sintetizado por uma via enzimática de nove passos que é uma das vias mais fundamentais e conservadas em organismos Gram-negativos^6,,7,,8.

Polimicônias são peptídeos antimicrobianos cônicos que visam o domínio lipídico A de lipopólise para perturbar a membrana externa e lise a célula. A interação eletrostática entre resíduos carregados positivamente de polimíxinos e os grupos lipídicos lipídicos abofíticos carregados negativamente interrompem a membrana celular bacteriana, levando à morte celular^{9,,10,,11,,12,13}. Colistina (polimicina E) é um antimicrobiano de última instância usado para tratar infecções causadas por patógenos nosocomias gram-negativos multidrogas, como acinetobacter baumannii^14,,15,16. Descoberto pela primeira vez em 1947, os polimíxinos são produzidos pelas bactérias do solo, Paenibacillus polymyxa^17,18,19. Polimíxins foram prescritos para tratar infecções gram-negativas por anos antes de seu uso clínico ser limitado devido a relatos de nefrocígenidade significativa^20,21.

A. baumannii é um patógeno gram-negativo nosocomial que aumentou drasticamente a morbidade e mortalidade dos desfechos dos pacientes nas últimas décadas²². O que antes era considerado um patógeno de baixa ameaça, agora representa um risco significativo para infecção hospitalar em todo o mundo devido à sua incrível capacidade de adquirir AMR e alto risco de epidemia^23,24. A. baumannii é responsável por mais de 10% das infecções nosocomiais nos estados unidos. A doença se manifesta como pneumonia, bacteremia, infecções do trato urinário, infecções de pele e tecidos moles, meningite e endocardite²⁵. As opções de tratamento para infecções de A. baumannii diminuíram devido à resistência contra quase todas as classes de antibióticos, incluindo β-lactams, fluoroquinolones, tetraciclina e aminoglycosides^23,24. A prevalência de isolamentos a. baumannii, resistentes a medicamentos multidrogas, extensivamente resistentes a medicamentos e resistentes a medicamentos, levou a um ressurgimento do tratamento da colistina, que foi considerado uma das poucas opções terapêuticas remanescentes ainda eficazes contra a resistência multidroga A. baumannii. No entanto, o aumento da resistência à colistina entre os isolados A. baumannii ampliou ainda mais sua ameaça à saúde pública global^{10,11,12,13,27,30,31}.

Os recentes avanços em tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, como o sequenciamento transposon (Tn-seq), forneceram ferramentas importantes para avançar nossa compreensão da aptidão bacteriana in vitro e in vivo. Tn-seq é uma ferramenta poderosa que pode ser aproveitada para estudar interações genótipo-fenótipo em bactérias. O Tn-seq é amplamente aplicável entre patógenos bacterianos, onde combina mutagênese transposon tradicional com sequenciamento paralelo maciço a locais de inserção de mapas rápidos, que podem ser usados para ligar mutações de DNA a variantes fenotípicas em uma escala de genoma^{32,,33,,34,35}. Embora os métodos de mutagênese transposon tenham sido descritos anteriormente, os passos gerais são semelhantes³³. Primeiro, uma biblioteca de inserção é gerada usando mutagênese transposon, onde cada célula bacteriana dentro de uma população é restrita a uma única inserção transposon dentro do DNA genômico (gDNA). Após mutagênese, mutantes individuais são agrupados. gDNA é extraído da piscina mutante de inserção e as junções transposon são amplificadas e submetidas a sequenciamento de alto rendimento. As leituras representam locais de inserção, que podem ser mapeados para o genoma. Inserções transposon que reduzem o condicionamento físico rapidamente caem da população, enquanto as inserções benéficas são enriquecidas. Tn-seq tem sido fundamental para avançar nossa compreensão de como os genes impactam a aptidão bacteriana no estresse³³.

O sistema de transposon himar1 marítimo codificado em pJNW684 foi especificamente construído e otimizado para fins de mutagênese transposon. Inclui um transposon da família marinerflanqueando o gene de resistência à kanamicina, que é usado para a seleção de mutantes de inserção transposon em A. baumannii. Ele também codifica um promotor específico de A. baumannii que impulsiona a expressão do gene de codificação transposase³⁶. O transposon baseado em marinheirotambém contém dois terminadores translacionais a jusante do gene de resistência à kanamicina, que impede a leitura a jusante da inserção³⁷. pJNW684 também carrega uma origem RP4/oriT/oriR6K-condicional de replicação que requer o gene λpir contribuído pela cepa do doador para replicar³⁸. Na ausência do gene λpir, o vetor pJNW684 que transporta o maquinário de transposição não poderá se replicar na cepa receptora A. baumannii ^10,,36,38. Portanto, durante a conjugação bacteriana, apenas o transposon é inserido no genoma receptor sem inserção de fundo do plasmídeo, que carrega o gene transposase. Isso é significativo porque a perda da atividade de transposase juntamente com o plasmídeo resulta em evento de transposição único e estável que impede o transposon de se mover para diferentes locais uma vez que insere no genoma receptor.

pJNW648 também foi testado para atividade em outro organismo Gram-negativo, E. coli. A montagem bem sucedida de uma biblioteca Sn-seq saturada na cepa E. coli W3110 indicou que o sistema é capaz de realizar mutagênese em uma ampla gama de patógenos, incluindo Enterobacteriaceae. Além disso, o promotor específico A. baumannii que impulsiona a expressão transposase pode ser rapidamente trocado com um promotor específico da espécie. Por fim, o gene de resistência à kanamicina pode ser trocado por outras fitas de resistência, dependendo do fenótipo amr do organismo que está sendo estudado.

Um fator que contribui para a resistência à colistina em A. baumannii é a administração de doses insuficientes, onde as bactérias são expostas à pressão seletiva em níveis não^{letais 39}. Vários relatos mostraram que concentrações antimicrobianas subinibitórias podem induzir respostas regulamentadas que alteram a fisiologia celular para reduzir a suscetibilidade de toda a população bacteriana^{11,,12,,30,,31}. Usando Tn-seq, descobrimos fatores que regulam a resistência à colistina em A. baumannii cep ATCC 17978 após exposição a concentrações inibitórias¹⁰ e subinibitórias de colistina. Este exemplo detalha um método Tn-seq que agiliza a construção e o enriquecimento de uma biblioteca mutante transposon saturada usando a família detransposons^40,41. Enquanto vários protocolos Tn-seq geram 20.000 – 100.000 mutantes^{35,42,43,44,45,46}, o protocolo aqui descrito pode gerar rapidamente uma biblioteca transposon de 400.000 + mutantes, que equivale aproximadamente a uma inserção transposon a cada pares de 10 bases em A. baumannii¹⁰. Além disso, o tamanho da biblioteca pode ser ampliado sem um esforço adicional significativo. Este método também elimina a exigência de restrição de endonucleases, ligadura adaptador e purificação de gel, o que pode reduzir a diversidade final da biblioteca.

Protocol

1. Preparação de cepas bacterianas Listrar a cepa “doador”(E. coli MFD DAP-/pJNW684, Tabela de Materiais) para colônias isoladas no ágar Luria-Bertani suplementado com ácido diaminopimelic de 600 μM (DAP), 100 mg/L de ampicillina e 25 mg/L de kanamicina. Incubar durante a noite a 37 °C. Utilizando uma única colônia isolada, inocular 50 mL de caldo de Luria (LB) suplementado com 600 μM DAP, 100 mg/L de ampicillina e 25 mg/L de kanamicina em um frasco erlenmeyer de …

Representative Results

Os métodos descritos descrevem a geração de uma biblioteca transposon de alta densidade em A. baumannii cep ATCC 17978 através de conjugação bacteriana utilizando E. coli MFD DAP-, que replica o plasmídeo pJNW684 (Figura 4B). O protocolo detalhado utiliza a conjugação bacteriana bi-parental para transferência de pJNW684 da cepa E. coli λpir+ doador para a cepa receptora A. baumannii. Este é um método eficiente e barato pa…

Discussion

A. baumannii é uma ameaça emergente à saúde pública global devido à rápida aquisição da AMR contra terapêuticas de “última linha”, como colistina^{10,,11,12,,23,,24,,30,,31}. Nas últimas décadas, tn-seq tem desempenhado um papel crítico na elucidação das interações ge…

Materials

10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate	Affymetrix	77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate	Invitrogen	10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker	Promega	PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351029
150mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351058
1X B&W	N/A	N/A	Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid	Alfa Aesar	B2239103	used at 600 µM
2X B&W	N/A	N/A	Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP	N/A	N/A	9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)	Fisher Scientific	BP1760	used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system	BECKMAN COULTER	A63881
BioAnalyzer	Agilent	G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis	Agilent	5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP)	New England Biolabs (NEB)	N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack	Invitrogen	12321D
E.coli MFD Dap-	N/A	N/A	DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol	Fisher Scientific	A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials	Corning	09-761-71
Glass beads	Corning	72684
Glycerol	Fisher Scientific	G33
Inoculating loops	Fisher Scientific	22-363-602	Scraping tool
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906	used at 25 mg/L
LB agar, Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426
LoTE	N/A	N/A	Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer	N/A	N/A	9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.)	Fisher Scientific	BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher Scientific	BP39920	Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33238
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher	Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath	Qsonica Sonicators	Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs (NEB)	S1420S
TE buffer	N/A	N/A	10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)	Promega	PR-M1875