Generazione di librerie di inserimento transposon in batteri Gram-Negativi per il sequenziamento ad alta velocità effettiva

Summary

Descriviamo un metodo per generare librerie mutanti trasposoni saturanti nei batteri Gram-negativi e la successiva preparazione di librerie di amplicone di DNA per il sequenziamento ad alto rendimento. Ad esempio, ci concentriamo sull’agente patogeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ma questo protocollo è summostico per una vasta gamma di organismi Gram-negativi.

Abstract

Il sequenziamento transposon (Tn-seq) è un metodo potente che combina la mutagenesi trasposone e il sequenziamento parallelo massiccio per identificare geni e percorsi che contribuiscono alla forma fisica batterica in una vasta gamma di condizioni ambientali. Le applicazioni Tn-seq sono estese e hanno anche permesso l’esame delle relazioni genotipo-fenotipo a livello di organismo, ma anche a livello di popolazione, comunità e sistemi. I batteri Gram-negativi sono altamente associati ai fenotipi di resistenza agli antimicrobici, che ha aumentato gli incidenti di insufficienza di trattamento antibiotico. La resistenza agli antimicrobici è definita come crescita batterica in presenza di antibiotici altrimenti letali. La colistina antimicrobica “ultima linea” viene utilizzata per trattare le infezioni batteriche Gram-negative. Tuttavia, diversi patogeni Gram-negativi, tra cui Acinetobacter baumannii possono sviluppare resistenza alla colistina attraverso una serie di meccanismi molecolari, alcuni dei quali sono stati caratterizzati utilizzando Tn-seq. Inoltre, le vie di trasduzione del segnale che regolano la resistenza alla colistina variano all’interno dei batteri Gram-negativi. Qui proponiamo un metodo efficiente di mutagenesi trasposone in A. baumannii che semplifica la generazione di una libreria di inserimento trasposone e la costruzione di librerie amplicon saturando eliminando la necessità di enzimi di restrizione, ligazione dell’adattatore e purificazione del gel. I metodi qui descritti consentiranno un’analisi approfondita dei determinanti molecolari che contribuiscono alla forma fisica di A. baumannii quando sono stati sfidati con la colistina. Il protocollo è applicabile anche ad altri patogeni ESKAPE Gram-negativi, che sono principalmente associati a infezioni ospedaliere farmacoresistenti.

Introduction

La scoperta di antibiotici è senza dubbio uno degli eventi più impattanti legati alla salute del^XX secolo. Non solo gli antibiotici risolvono rapidamente le infezioni batteriche gravi, ma svolgono anche un ruolo fondamentale nella medicina moderna. Grandi interventi chirurgici, trapianti e progressi nella medicina neonatale e nella chemioterapia lasciano i pazienti suscettibili a infezioni potenzialmente letali e queste terapie non sarebbero possibili senza antibiotici^1,2. Tuttavia, il rapido sviluppo e la diffusione della resistenza agli antibiotici tra i patogeni umani ha ridotto significativamente l’efficacia di tutte le classi clinicamente importanti di antibiotici³. Molte infezioni batteriche che una volta erano facilmente cancellate con il trattamento antibiotico, non rispondono più ai protocolli di trattamento classici, causando una grave minaccia per la salute pubblica^{globale 1}. La resistenza agli antimicrobici (AMR) è il luogo in cui le cellule batteriche crescono in concentrazioni altrimenti letali di antibiotici, indipendentemente dalla durata^{del trattamento 4,5}. È urgente comprendere i fattori molecolari e biochimici che regolano la resistenza antimicrobica, che aiuteranno a guidare lo sviluppo antimicrobico alternativo. In particolare, gli agenti patogeni ESKAPE sono problematici in ambienti clinici e associati a un’estesa AMR. Questi includono Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter spp. Mentre diversi meccanismi contribuiscono alla AMR negli agenti patogeni ESKAPE, questi ultimi quattro organismi sono Gram-negativi.

I batteri Gram-negativi assemblano una membrana esterna che li protegge da condizioni ambientali avverse. La membrana esterna serve come barriera permeabile per limitare l’ingresso di molecole tossiche, come gli antibiotici, nella cellula. A differenza di altre membrane biologiche, la membrana esterna è asimmetrica. Il foglietto illustrativo esterno è arricchito con lipopolysaccharide esposto in superficie, mentre il volantino interno è una miscela di fosfopididi⁶. Le molecole di lipopolysaccharide sono ancorate alla membrana esterna da un lipidico conservato A moiety incorporato all’interno del bistrato^{lipidico 7}. Il lipide canonico Un dominio di Escherichia coli lipopolysaccharide è necessario per la crescita della maggior parte dei batteri Gram-negativi ed è sintetizzato da un percorso ezimatico in nove passaggi che è uno dei percorsi più fondamentali e conservati negli organismi Gram-negativi^6,7,8.

Le polimixine sono peptidi antimicrobici cationici che prendono di mira il lipidico Un dominio di lipopolysaccharide per perturbare la membrana esterna e lyse la cellula. L’interazione elettrostatica tra residui caricati positivamente di polimixine e i gruppi di lipidi A caricati negativamente interrompe la membrana cellulare batterica portando infine alla morte^{cellulare 9,10,11,12,13}. La colistina (polimixine E) è un antimicrobico di ultima istanza utilizzato per trattare le infezioni causate da patogeni nosocomiali Gram-negativi multifarmaci, come Acinetobacter baumannii^14,15,16. Scoperte per la prima volta nel 1947, le polimixine sono prodotte dai batteri del suolo, Paenibacillus polymyxa^17,18,19. Polimixine sono stati prescritti per trattare le infezioni Gram-negative per anni prima che il loro uso clinico è stato limitato a causa di segnalazioni di nefrro- e neurotossicità^{significativa 20,21}.

A. baumannii è un patogeno nosocomiale Gram-negativo che ha aumentato drasticamente la morbilità e la mortalità degli esiti dei pazienti negli ultimi^{decenni 22}. Quello che una volta era considerato un agente patogeno a bassa minaccia, ora rappresenta un rischio significativo per l’infezione ospedaliera in tutto il mondo a causa della sua incredibile capacità di acquisire la RSI e^{dell’alto rischio di epidemia 23,24}. A. baumannii rappresenta più del 10% delle infezioni nosocomiali negli Stati Uniti. La malattia si manifesta come polmonite, batteriemia, infezioni delle vie urinarie, infezioni della pelle e dei tessuti molli, meningite ed endocardite²⁵. Le opzioni di trattamento per le infezioni da A. baumannii sono diminuite a causa della resistenza contro quasi tutte le classi antibiotiche, tra cui β-lactams, fluoroquinolones, tetracycline e aminoglicosides^23,24. La prevalenza di isolati A. baumannii, resistenti alla droga e antifarmacorta, ha portato a una rinascita del trattamento della colistina, che si è ritenuto essere una delle poche opzioni terapeutiche rimaste ancora efficaci contro la resistenza multifarmaco A. baumannii. Tuttavia, una maggiore resistenza alla colistina tra gli isolati di A. baumannii ha ulteriormente amplificato la sua minaccia per la salute pubblica globale^{10,11,12,13,27,30,31}.

I recenti progressi nelle tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento, come il sequenziamento dei traspositori (Tn-seq), hanno fornito importanti strumenti per far progredire la nostra comprensione della forma fisica batterica in vitro e in vivo. Tn-seq è un potente strumento che può essere sfruttato per studiare le interazioni genotipo-fenotipo nei batteri. Tn-seq è ampiamente applicabile tra i patogeni batterici, dove combina la mutagenesi tradizionale trasposone con il sequenziamento parallelo massiccio per mappare rapidamente i siti di inserimento, che possono essere utilizzati per collegare le mutazioni del DNA alle varianti fenotipico su una scala^{genomica 32,33,34,35}. Mentre i metodi di mutagenesi trasposone sono stati descritti in precedenza, i passaggi generali sono simili³³. In primo luogo, viene generata una libreria di inserimento utilizzando la mutagenesi trasposone, in cui ogni cellula batterica all’interno di una popolazione è limitata a un singolo inserimento di trasposone all’interno del DNA genomico (gDNA). Dopo la mutagenesi, i singoli mutanti sono in comune. gDNA viene estratto dal pool mutante di inserimento e le giunzioni trasposone vengono amplificate e sottoposte a sequenziamento ad alta velocità effettiva. Le letture rappresentano siti di inserimento, che possono essere mappati al genoma. Gli inserimenti di transposon che riducono la forma fisica cadono rapidamente dalla popolazione, mentre gli inserimenti benefici sono arricchiti. Tn-seq è stato strumentale per far progredire la nostra comprensione di come i geni influiscono sulla forma fisica batterica nello stress³³.

Il sistema di transposon di mariner Himar1 codificato in pJNW684 è stato specificamente costruito e ottimizzato ai fini della mutagenesi trasposone. Esso comprende marinerun transposon marinaio-famiglia che affianca il gene della resistenza kanamycin, che viene utilizzato per la selezione di mutanti di inserimento transposon in A. baumannii. Codifica anche un promotore specifico di A. baumannii che guida l’espressione del gene di codifica trasposizione³⁶. Il transposon a base di marinaiocontiene anche due terminatori trasmizionali a valle del gene di resistenza kanamycin, che impedisce la lettura a valle dell’inserimento³⁷. pJNW684 porta anche un’origine RP4/oriT/oriR6K-condizionale della replica che richiede che il gene λpir contribuito dal ceppo donatore si replica³⁸. In assenza del gene λpir, il vettore pJNW684 che trasporta il macchinario di trasposizione non sarà in grado di replicare nel ceppo del destinatario A. baumannii ^10,36,38. Pertanto, durante la coniugazione batterica, solo il trasposone viene inserito nel genoma ricevente senza inserimento in background del plasmide, che trasporta il gene trasposizione. Questo è significativo perché la perdita di attività di trasposizione insieme al plasmide si traduce in un singolo evento di trasposizione stabile che impedisce al trasposone di spostarsi in luoghi diversi una volta che si inserisce nel genoma del destinatario.

pJNW648 è stato anche testato per l’attività in un altro organismo Gram-negativo, E. coli. Il successo dell’assemblaggio di una libreria Tn-seq saturante nel ceppo E. coli W3110 ha indicato che il sistema è suscettibile di eseguire la mutagenesi in un’ampia gamma di agenti patogeni, tra cui Enterobacteriaceae. Inoltre, il promotore specifico di A. baumannii che guida l’espressione trasposizione può essere rapidamente scambiato con un promotore specifico della specie. Infine, il gene di resistenza al kanamycin può essere scambiato con altre cassette di resistenza, a seconda del fenotipo AMR dell’organismo in fase di studio.

Un fattore che contribuisce alla resistenza alla colistina in A. baumannii è la somministrazione di dosi insufficienti, dove i batteri sono esposti a pressioni selettive a livelli non^{letali 39}. Diversi rapporti hanno mostrato che le concentrazioni di antimicrobici subinibito possono indurre risposte regolamentate che alterano la fisiologia cellulare per ridurre la suscettibilità dell’intera popolazione^{batterica 11,12,30,31}. Utilizzando Tn-seq, abbiamo scoperto fattori che regolano la resistenza alla colistina nel ceppo A. baumannii ATCC 17978 dopo l’esposizione a concentrazioni inibitorie¹⁰ e subinibitory di colistina. In questo esempio viene illustrato come utilizzare un metodo Tn-seq che semplifica la costruzione e l’arricchimento di una libreria mutante trasposone satura utilizzando lafamiglia di trasposoni^40,41. Mentre diversi protocolli Tn-seq generano 20.000 – 100.000 mutanti^35,42,43,^44,45,46, il protocollo descritto qui può generare rapidamente una libreria transposon di 400.000 mutanti, che equivale approssimativamente a un transposon ogni inserimento di coppie di 10 basi in A. baumanni¹⁰.^, Inoltre, le dimensioni della libreria possono essere scalate senza uno sforzo aggiuntivo significativo. Questo metodo elimina anche la necessità di endonucleasi di restrizione, legatura dell’adattatore e purificazione del gel, che può ridurre la diversità finale della libreria.

Protocol

1. Preparazione del ceppo batterico Streak il ceppo”donatore” ( E. coli MFD DAP-/pJNW684, Tabella dei Materiali) per colonie isolate sull’agar Luria-Bertani integrato con acido diaminopimelico 600 M (DAP), 100 mg/L di ampicillina e 25 mg/L di kanamycin. Incubate durante la notte a 37 gradi centigradi. Utilizzando una singola colonia isolata, inoculare 50 mL di brodo di Luria (LB) integrato con 600 DAP, 100 mg/L di ampicillina e 25 mg/L di kanamycin in una fiaschetta Erlenme…

Representative Results

I metodi descritti descrivono la generazione di una libreria di transposon ad alta densità nel ceppo A. baumannii ATCC 17978 attraverso la coniugazione batterica utilizzando E. coli MFD DAP-, che replica il plasmide pJNW684 (Figura 4B). Il protocollo dettagliato utilizza la coniugazione batterica bi-parentale per il trasferimento di pJNW684 dal ceppo del donatore E. coli λpir- donatore al ceppo del ricevente A. baumannii. Si tratta …

Discussion

A. baumannii è una minaccia emergente per la salute pubblica globale a causa della rapida acquisizione di AMR contro terapie “di ultima linea”, come colistina^{10,11,12,23,24,30,31}. Negli ultimi decenni, Tn-seq ha svolto un ruolo fondamentale nel chiarire le interazioni genotipo-feno…

Materials

10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate	Affymetrix	77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate	Invitrogen	10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker	Promega	PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351029
150mm x 15mm Petri Dishes	Corning	351058
1X B&W	N/A	N/A	Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid	Alfa Aesar	B2239103	used at 600 µM
2X B&W	N/A	N/A	Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP	N/A	N/A	9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L)	Fisher Scientific	BP1760	used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system	BECKMAN COULTER	A63881
BioAnalyzer	Agilent	G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis	Agilent	5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP)	New England Biolabs (NEB)	N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack	Invitrogen	12321D
E.coli MFD Dap-	N/A	N/A	DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol	Fisher Scientific	A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials	Corning	09-761-71
Glass beads	Corning	72684
Glycerol	Fisher Scientific	G33
Inoculating loops	Fisher Scientific	22-363-602	Scraping tool
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906	used at 25 mg/L
LB agar, Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426
LoTE	N/A	N/A	Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer	N/A	N/A	9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.)	Fisher Scientific	BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution	Fisher Scientific	BP39920	Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher	Q33238
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher	Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath	Qsonica Sonicators	Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs (NEB)	S1420S
TE buffer	N/A	N/A	10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)	Promega	PR-M1875