We beschrijven een methode om verzadigende transposon mutantbibliotheken te genereren in gramnegatieve bacteriën en de daaropvolgende voorbereiding van DNA-ampliconbibliotheken voor hoge doorvoersequenties. Als voorbeeld richten we ons op de ESKAPE-ziekteverwekker, Acinetobacter baumannii,maar dit protocol is vatbaar voor een breed scala aan gramnegatieve organismen.
Transposon sequencing (Tn-seq) is een krachtige methode die transposon mutagenesis en massieve parallelle sequencing combineert om genen en paden te identificeren die bijdragen aan bacteriële fitness onder een breed scala van omgevingsomstandigheden. Tn-seq toepassingen zijn uitgebreid en hebben niet alleen het onderzoek van genotype-fenotype relaties op organisme niveau, maar ook op de bevolking, gemeenschap en systemen niveaus. Gram-negatieve bacteriën zijn sterk geassocieerd met antimicrobiële resistentie fenotypes, die incidenten van antibiotica behandeling falen heeft verhoogd. Antimicrobiële resistentie wordt gedefinieerd als bacteriële groei in de aanwezigheid van anders dodelijke antibiotica. De “last-line” antimicrobiële colistin wordt gebruikt voor de behandeling van gram-negatieve bacteriële infecties. Echter, verschillende Gram-negatieve ziekteverwekkers, waaronder Acinetobacter baumannii kan ontwikkelen colistine resistentie door middel van een reeks van moleculaire mechanismen, waarvan sommige werden gekenmerkt met behulp van Tn-seq. Bovendien, signaal transductie trajecten die colistin resistentie reguleren variëren binnen Gram-negatieve bacteriën. Hier stellen we een efficiënte methode voor om mutagenesis in A. baumannii te transtreren die de generatie van een verzadigende transposon insertiebibliotheek en amplicon bibliotheekbouw stroomlijnt door de noodzaak van beperkingsenzymen, adapterligatie en gelzuivering te elimineren. De hierin beschreven methoden maken een diepgaande analyse mogelijk van moleculaire determinanten die bijdragen aan A. baumannii-geschiktheid wanneer ze worden uitgedaagd met colistine. Het protocol is ook van toepassing op andere Gram-negatieve ESKAPE-pathogenen, die. voornamelijk geassocieerd worden met resistente ziekenhuisinfecties.
De ontdekking van antibiotica is ongetwijfeld een van de meest impactvolle gezondheidsgerelateerde gebeurtenissen van de20e eeuw. Niet alleen antibiotica snel oplossen ernstige bacteriële infecties, ze spelen ook een centrale rol in de moderne geneeskunde. Grote operaties, transplantaties en vooruitgang in de neonatale geneeskunde en chemotherapie verlaten patiënten die vatbaar zijn voor levensbedreigende infecties en deze therapieën zouden niet mogelijk zijn zonder antibiotica1,2. De snelle ontwikkeling en verspreiding van antibioticaresistentie onder menselijke pathogenen heeft echter de werkzaamheid van alle klinisch belangrijke klassen van antibiotica aanzienlijk verminderd3. Veel bacteriële infecties die ooit gemakkelijk werden gewist met antibiotica behandeling, niet langer reageren op klassieke behandeling protocollen, waardoor een ernstige bedreiging voor de wereldwijde volksgezondheid1. Antimicrobiële resistentie (AMR) is waar bacteriële cellen groeien in anders dodelijke concentraties van antibiotica, ongeacht de behandelingsduur4,5. Er is een dringende noodzaak om moleculaire en biochemische factoren te begrijpen die AMR reguleren, wat zal helpen bij het begeleiden van alternatieve antimicrobiële ontwikkeling. Specifiek, ESKAPE pathogenen zijn problematisch in klinische omgevingen en geassocieerd met uitgebreide AMR. Deze omvatten Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa en Enterobacter spp. Hoewel verschillende mechanismen bijdragen aan AMR in ESKAPE-pathogenen, zijn de laatste vier organismen gramneg negatief.
Gram-negatieve bacteriën monteren een bepalend buitenste membraan dat hen beschermt tegen ongunstige omgevingsomstandigheden. Het buitenste membraan dient als een doorlaatbaarheidsbarrière om de toegang van giftige moleculen, zoals antibiotica, in de cel te beperken. In tegenstelling tot andere biologische membranen is het buitenste membraan asymmetrisch. De buitenste bijsluiter is verrijkt met aan de oppervlakte blootgestelde lipopolysaccharide, terwijl de binnenste bijsluiter een mengsel is van fosfolipiden6. Lipopolysaccharide moleculen zijn verankerd aan het buitenste membraan door een geconserveerde lipide A moiety ingebed in de lipide bilayer7. Het canonieke lipide A-domein van Escherichia coli lipopolysaccharide is vereist voor de groei van de meeste Gram-negatieve bacteriën en wordt gesynthetiseerd door een negen-staps enzymatische route die een van de meest fundamentele en geconserveerde trajecten in Gram-negatieve organismen6,7,8is .
Polymyxinen zijn kationische antimicrobiële peptiden die zich richten op de lipide A domein van lipopolysaccharide om het buitenste membraan te verstoren en lyse de cel. De elektrostatische interactie tussen positief geladen residuen van polymyxinen en de negatief geladen lipide A-fosfaatgroepen verstoren het bacteriële celmembraan uiteindelijk tot celdood9,10,11,12,13. Colistine (polymyxine E) is een antimicrobiële in laatste instantie die wordt gebruikt voor de behandeling van infecties veroorzaakt door multiresistente gramnagende nosocomiale pathogenen, zoals Acinetobacter baumannii14,15,16. Voor het eerst ontdekt in 1947, polymyxinen worden geproduceerd door de bodembacteriën, Paenibacillus polymyxa17,18,19. Polymyxinen werden voorgeschreven om gram-negatieve infecties te behandelen voor de jaren voordat hun klinisch gebruik werd beperkt als gevolg van meldingen van significante nephro- en neurotoxiciteit20,21.
A. baumannii is een nosocomiale gramnegatieve ziekteverwekker die de morbiditeit en mortaliteit van de patiëntresultaten in de afgelopen decennia drastisch heeft verhoogd22. Wat ooit werd beschouwd als een ziekteverwekker met een lage dreiging, vormt nu een aanzienlijk risico voor ziekenhuisinfecties over de hele wereld vanwege zijn ongelooflijke vermogen om AMR te verwerven en een hoog risico opepidemie 23,24. A. baumannii is goed voor meer dan 10% van de nosocomiale infecties in de Verenigde Staten. Ziekte manifesteert zich als longontsteking, bacteremie, urineweginfecties, huid- en weke delen infecties, meningitis, en endocarditis25. Behandelingsopties voor A. baumannii-infecties zijn afgenomen als gevolg van resistentie tegen bijna alle antibioticaklassen, waaronder β-lactams, fluoroquinolonen, tetracycline en aminoglycosides23,24. De prevalentie van multiresistente, langdurig resistente en panresistente A. baumannii isolaten heeft geleid tot een opleving in de colistine behandeling, waarvan werd gedacht dat het een van de weinige overgebleven therapeutische opties nog steeds effectief tegen multidrug resistente A. baumannii. De toegenomen colistineresistentie onder A. baumannii-isolaten heeft echter zijn bedreiging voor de mondiale volksgezondheid verder versterkt10,11,,12,13,27,30,31.
Recente vooruitgang in high-throughput sequencing technologieën, zoals transposon sequencing (Tn-seq), hebben belangrijke instrumenten om ons begrip van bacteriële fitness in vitro en in vivote bevorderen. Tn-seq is een krachtig hulpmiddel dat kan worden ingezet om genotype-fenotype interacties in bacteriën te bestuderen. Tn-seq is breed toepasbaar voor bacteriële pathogenen, waarbij het traditionele transposon mutagenesis combineert met massieve parallelle sequencing om snel invoegingsplaatsen in kaart te brengen, die kunnen worden gebruikt om DNA-mutaties te koppelen aan fenotypische varianten op een genoombrede schaal32,33,34,35. Hoewel transposon mutagenesis methoden zijn eerder beschreven, de algemene stappen zijn vergelijkbaar33. Ten eerste wordt een invoegbibliotheek gegenereerd met behulp van transposon mutagenesis, waarbij elke bacteriële cel binnen een populatie beperkt is tot één transposon invoeging binnen het genomische DNA (gDNA). Na mutagenesis worden individuele mutanten samengevoegd. gDNA wordt gewonnen uit de invoegpot en de transposon-knooppunten worden versterkt en onderworpen aan hoge doorvoersequencing. De reads vertegenwoordigen invoegplaatsen, die in kaart kunnen worden gebracht aan het genoom. Transposon inserties die de conditie te verminderen snel uit de bevolking vallen, terwijl gunstige toevoegingen zijn verrijkt. Tn-seq is instrumenteel geweest om ons begrip van hoe genen bacteriële fitness beïnvloeden in stress33te bevorderen.
Het Himar1 mariner transposon systeem gecodeerd in pJNW684 werd specifiek gebouwd en geoptimaliseerd voor de omzetting van mutagenesis. Het omvat een mariner-familietransposon flankeren van de kanamycine resistentie gen, die wordt gebruikt voor de selectie van transposon insertion mutanten in A. baumannii. Het codeert ook een A. baumannii specifieke promotor die de expressie van de transposase codering gen36drives . De op zeeherengebaseerde transposon bevat ook twee translationele terminators stroomafwaarts van het kanamycine resistentiegen, dat lees-door stroomafwaarts van de invoeging37voorkomt. pJNW684 draagt ook een RP4/oriT/oriR6K-voorwaardelijke oorsprong van replicatie die vereist dat het λpir-gen dat door de donorstam wordt bijgedragen, zich vermenigvuldigt38. Bij afwezigheid van het λpir-gen zal de pJNW684-vector die de omzettingsmachine draagt, zich niet kunnen vermenigvuldigen in de A. baumannii-ontvangerstam 10,36,38. Daarom wordt tijdens bacteriële vervoeging alleen het transposon in het ontvangende genoom ingebracht zonder achtergrondinbrengen van het plasmide, dat het transposasegen draagt. Dit is belangrijk omdat het verlies van transposase activiteit samen met de plasmide resulteert in een enkele, stabiele omzetting gebeurtenis die voorkomt dat de transposon zich naar verschillende locaties zodra het invoegt in de ontvanger genoom.
pJNW648 is ook getest op activiteit in een ander Gram-negatief organisme, E. coli. Succesvolle assemblage van een verzadigende Tn-seq bibliotheek in E. coli stam W3110 gaf aan dat het systeem vatbaar is om mutagenese uit te voeren in een breed scala van ziekteverwekkers, waaronder Enterobacteriaceae. Bovendien kan de A. baumannii-specifieke promotor die de omzettingsexpressie stimuleert, snel worden uitgewisseld met een soortspecifieke promotor. Ten slotte kan het kanamycineresistentiegen worden ingeruild voor andere weerstandscassettes, afhankelijk van het AMR-fenotype van het onderzochte organisme.
Een factor die bijdraagt aan de resistentie van colistine in A. baumannii is toediening van onvoldoende doses, waarbij bacteriën worden blootgesteld aan selectieve druk op niet-dodelijke niveaus39. Verschillende rapporten toonden aan dat subinhibitory antimicrobiële concentraties gereguleerde reacties kunnen veroorzaken die de celfysiologie veranderen om de gevoeligheid van de gehele bacteriële populatie te verminderen11,12,30,31. Met behulp van Tn-seq ontdekten we factoren die de colistineresistentie in A. baumannii-stam ATCC 17978 reguleren na blootstelling aan remmende10- en subinhibitorische concentraties van colistine. In dit voorbeeld wordt een Tn-seq-methode beschreven die de constructie en verrijking van een verzadigde transposon mutantbibliotheek stroomlijnt met behulp van de op marinergebaseerde familie van transposons40,41. Terwijl verschillende Tn-seq protocollen genereren 20.000 – 100.000 mutanten35,42,43,44,45,46, kan het hierin beschreven protocol snel een transposon bibliotheek van 400.000 + mutanten genereren, die ruwweg gelijk staat aan een transposon inbrengen elke 10-base paren in A. baumannii10. Bovendien kan de grootte van de bibliotheek zonder noemenswaardige extra inspanning worden opgeschaald. Deze methode elimineert ook de vereiste voor beperking endonucleases, adapter ligatie en gel zuivering, die de uiteindelijke bibliotheek diversiteit kan verminderen.
A. baumannii is een opkomende bedreiging voor de wereldwijde volksgezondheid als gevolg van de snelle verwerving van AMR tegen “last-line” therapeutica, zoals colistin10,11,12,23,24,30,31. In de afgelopen decennia heeft Tn-seq een cruciale rol gespeeld bij het ophelderen van genotyp…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door financiering van het National Institute of Health (Grant AI146829 aan J.M.B.) en wordt dankbaar erkend.
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate | Affymetrix | 77112 | |
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate | Invitrogen | 10217-016 | |
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker | Promega | PR-G2101 | |
100mm x 15mm Petri Dishes | Corning | 351029 | |
150mm x 15mm Petri Dishes | Corning | 351058 | |
1X B&W | N/A | N/A | Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W. |
2,6-Diaminopimelic acid | Alfa Aesar | B2239103 | used at 600 µM |
2X B&W | N/A | N/A | Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature. |
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP | N/A | N/A | 9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C. |
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 12344 | |
Acinetobacter baumannii ATCC 17978 | ATCC | N/A | AmpS, KanS |
Ampicillin (100 mg/L) | Fisher Scientific | BP1760 | used at 100 mg/L |
AMPure XP PCR purification system | BECKMAN COULTER | A63881 | |
BioAnalyzer | Agilent | G2939B | |
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis | Agilent | 5067-4626 | |
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP) | New England Biolabs (NEB) | N0447L | |
DynaMag-2 Magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
E.coli MFD Dap- | N/A | N/A | DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36). |
Ethanol | Fisher Scientific | A4094 | |
Externally Threaded Cryogenic Vials | Corning | 09-761-71 | |
Glass beads | Corning | 72684 | |
Glycerol | Fisher Scientific | G33 | |
Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-602 | Scraping tool |
Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | used at 25 mg/L |
LB agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425 | |
LB broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426 | |
LoTE | N/A | N/A | Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature. |
Lysis buffer | N/A | N/A | 9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL) |
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.) | Fisher Scientific | BP1752I | |
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher Scientific | BP39920 | Diluted to 1X |
Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33238 | |
Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher | Q32856 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
Sonicator with refridgerated waterbath | Qsonica Sonicators | Q2000FCE | |
Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs (NEB) | S1420S | |
TE buffer | N/A | N/A | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0) |
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt) | Promega | PR-M1875 |