가축의 초기 개국 여포에서 온수에 대한 생체 외 문화 전략
Summary
우리는 발달의 초기 단계에서 난소 여포에서 성장 난모세포의 분리절차뿐만 아니라 완전히 자란 단계까지 성장과 차별화를 지원할 수있는 체외 문화 시스템의 설정에 대해 설명합니다.
Abstract
성숙하고 열렬한 난모세포의 제한된 예비는 포유류에서 보조 번식의 성공을위한 주요 장벽을 나타냅니다. 생식 수명이 성숙하고 배란되는 난소세포의 약 1%에 불과하다는 점을 고려할 때, 난소 보호구역의 착취를 비배란 여포의 인구증가로 증가시키는 몇 가지 기술이 개발되었다. 이러한 기술은 불임 보존, 가축 의 선택 프로그램 및 멸종 위기에 처한 종의 보존에 대한 개입을 허용했습니다. 그러나 난소 보호구역의 광대한 잠재력은 여전히 크게 악용되지 않습니다. 예를 들어, 소에서는 특정 발달 단계에서 난모세포의 체외 문화를 지원하기 위한 시도가 있었지만 효율적이고 신뢰할 수 있는 프로토콜은 아직 개발되지 않았습니다. 여기서 우리는 생체 내의 중간 개성적인 여포에 대응하는 소 초기 개량 여포에서 완전히 자란 단계로 소 초기 개량 여포에서 수집된 체외 성장 난모를 개발하기 위해 정의된 해당 여포 단계의 생리적 조건을 재현하는 배양 시스템을 설명합니다. 호르몬과 인포디세아제 3 억제제의 조합은 불시의 메이오틱 재개를 방지하고 난소 세포의 분화를 안내하는 데 사용되었다.
Introduction
생식 수명 동안 난소에 존재하는 난소의 극히 일부만 성숙하고 배란 시 나팔관에서 방출되며, 수정되어 실행 가능한 배아1로발전할 수 있다. 다른 한편으로는, 난소 내의 난모세포의 대부분은 atresia를 겪고 결코 배란되지 않습니다. 시험관 내 배아 생산(IVP) 기술은 난소예비2,,3의착취를 증가시키려 고 시도했다. 지금까지 이러한 기술은 불임 보존, 가축 의 선택 프로그램 및 멸종 위기 종의 보존에 대한 개입을 허용했습니다. 그럼에도 불구 하 고, 대부분의 프로토콜 은 기본적으로 개소 난소 여포 내에서 성장 단계를 완료 한 난모 세포를 사용 하 여, 따라서 완전히 성장 된 난모 세포로 언급. IVP 기술이 널리 사용되는 가축에서는 완전히 자란 난모세포가 약 120 μm의 최종 직경에 도달하고 직경 2~8mm(중간 개미 여포)1에이르는 여포로부터 채취된다. 여포에서 격리되면, 이러한 난모세포는 체외에서 성숙하고 수정됩니다. 그런 다음 zygotes는 배아세포 단계까지 배양되고 수령인 또는 냉동 보존으로 옮겨갑니다. 가축에서뿐만 아니라 다른 많은 종에서, IVP에 의해 제공 된 잠재력에도 불구하고, 소 당 생체 외 생산 배아의 수는 크게 지난 40 년 동안 개선되지 않았다. 이는 주어진 시간에 난소를 채우는 완전히 자란 난소의 수가 제한되어 있기 때문에 부분적으로 표준 IVP 기술4,,5,,6을회수하고 복종할 수 있다.
초기 개미 여포 내에서 동봉된 난초, 즉 직경이 2mm 미만인 여포는 불임 보존 프로그램7에서 사용할 수 있는 잠재적인 근원을 나타내며, 난소는 대략 중간 개미8보다10배 더 이른 개량여제를 함유하고 있다. 그러나, 이러한 난모세포는 여전히 성장 단계에 있으며 아직 완전히 성장 한단계 9에도달하지 않았습니다. 이와 같이, 그들은 여전히 전사 활성, 나중에 발달 단계에 저장됩니다 mRNA를 생산, 아직 자발적으로 재개하고 meiosis를 완료의 능력으로 난모를 부여하는 데 필요한 모든 분화 과정을 겪지 않은 나는 한 번 여포 구획에서 분리10,,11. 따라서 표준 시험관 성숙(IVM) 프로토콜에 직접 제출할 수는 없지만 성장 단계를 완료하고 적절하게 차별화할 수 있는 추가 문화 기간이 필요합니다.
여포가 초기 개랑자에서 중간 개소 단계로 발전할 때 발생하는 완전히 자란 단계로의 전환은 난모세포 발달 중 중요한 단계 중 하나입니다. 가축에서, 몇몇 연구 결과는 시험관 외2,,,,12,13,14,,15,,16,17,,18,,19에서이 사건을 재구성하는 것을 시도했습니다., 그러나 현재까지 신뢰할 수 있는 프로토콜이 개발되지 않았으며 제한된 성공만 보고되었습니다. 이전 연구에 따르면20,이러한 성장 난모세포는 균일 한 인구를 구성. 전사활성 외에도, 그들의 크로마틴은 GV02,21이라는구성으로 발아 소포(GV)에2분산된다. 반대로, 중형 개포로부터 수득된 완전히 자란 난모세포의 인구는 이질적이며,20을관찰할 수 있는 크로마틴 다짐(GV1, GV2 및 GV3)의 다양한 정도에 의해 미러되는 상태이다. 이들 중, 이전 데이터는 GV2 와 GV3 난모세포가 전반적으로 더 나은 품질과 더 높은 배아 발달 능력(20,,21,,22, 23,,,24)을특징으로하는 것으로 나타났습니다.23
위의 관찰부터 시작하여, 우리는 초기 개울 여포에서 적혈구 -oocyte 복합체 (COC)로 격리 된 난모 세포의 분화를 허용하는 5 일 간의 긴 배양 시스템을 설명합니다. 이러한 배양 전략은 실험실에서 10년 동안 진행된 연구에서 진화하여 이전에 개발된 시험관 내분비 배양(IVCO)2,선조 시스템23,25 및난소 배양 시 아연 보충제에 뿌리를 두고 있다. 여포 자극 호르몬(FSH)과 인포디스세라제-3(PDE3) 억제제의 조합으로, 적정성-난낭화통신2를향상시킬 수 있고, 불시의 메이오틱 재개2를방지하고, 난낭 성장2를 지원하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 우리는 그들의 생존력을 지원하고 메이오틱 재개를 방지하여 5 일 동안 난낭 개발을 촉진하는 난모세포 재배를위한 문화 시스템을 설명합니다. 이러한 후자의 측면은 메이오능 및 배아 발달 능력2,,20과난낭을 부여하는 데 필요한 지속적인 성장과 분화를 허용하는 것이 가장 중요합니다.
이 배양 시스템을 개발할 때, 우리는 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 지역 롬바르디아 PSR INNOVA n.201801061529 및 UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01 의해 지원되었다
Materials
| 4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
| 96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
| Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
| Cell culture water | Sigma | W3500 | |
| Cilostamide | Sigma | C7971 | |
| Cysteamine | Sigma | M9768 | |
| Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
| Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
| Estradiol | Sigma | E2758 | |
| Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Gonal F | Merck Serono | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Hepes | Sigma | H3784 | |
| Vacuum pump | Cook-IVF | ||
| Incubator | Sanyo | ||
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
| Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for hepes-buffered TCM199 |
| Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for M199-D |
| Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
| Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilin | Sigma | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium choride | Sigma | P5886 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Testosterone | Sigma | 86500 | |
| Triton X | Sigma | T9284 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Water | Sigma | W3500 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |
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