In Vitro Культурная стратегия для Oocytes от раннего антрального фолликула в крупного рогатого скота
Summary
Мы описываем процедуры изоляции растущих яйцеклеток от фолликулов яичников на ранних стадиях развития, а также установку системы культуры in vitro, которая может поддерживать рост и дифференциацию до полностью выращенной стадии.
Abstract
Ограниченный резерв зрелых, удобренных яйцеклеток представляет собой основной барьер для успеха вспомогательной репродукции у млекопитающих. Учитывая, что в период репродуктивной жизни только около 1% яйцеклеток в яичниках зрелых и овуляции, несколько методов были разработаны для увеличения эксплуатации яичников резерва для растущей популяции неовуляторных фолликулов. Такие технологии позволили проведить сохранение плодородия, программы отбора скота и сохранения исчезающих видов. Тем не менее, огромный потенциал резерва яичников по-прежнему в значительной степени неэксплуатируются. У коров, например, предпринимались некоторые попытки поддержать культуру экстракорпорального использования яйцеклеток на конкретных стадиях развития, однако эффективные и надежные протоколы еще не разработаны. Здесь мы описываем культурную систему, которая воспроизводит физиологические условия соответствующей фолликулярной стадии, определяемой для развития в пробирке растущих яйцеклеток, собранных из ранних антральных фолликулов крупного рогатого скота на полностью выращенную стадию, соответствующую среднему антральную фолликулу in vivo. Сочетание гормонов и ингибитора фосфодиэстеразы 3 было использовано для предотвращения несвоевременного мейотического возобновления и для руководства дифференциацией яйцеклеток.
Introduction
Во время репродуктивной жизни, только минимальная доля яйцеклеток, которые присутствуют в яичнике зрелые, высвобождаются в фаллопиевых труб после овуляции, и доступны для оплодотворения и развиваться в жизнеспособный эмбрион1. С другой стороны, большинство яйцеклеток в яичнике проходят атрезию и никогда не овуляции. Технологии производства эмбрионов in vitro (IVP) пытались увеличить эксплуатацию резерва яичников2,,3. До сих пор такие технологии позволяли мероприятия по сохранению плодородия, программам отбора скота и сохранению исчезающих видов. Тем не менее, большинство протоколов использовать яйцеклетки, которые в основном завершили фазу роста в антрал яичников фолликула, и, следовательно, называются полностью выращенных яйцеклеток. В крупного рогатого скота, где технологии IVP широко используются, полностью выращенные яйцеклетки достигают конечного диаметра около 120 мкм и собираются из фолликулов, которые охватывают от 2 до 8 мм в диаметре (средние антрал фолликулы)1. После изоляции от фолликулов такие яйцеклетки созревают и оплодотворяются в пробирке. Зиготы затем культурны до стадии бластоцист и либо переданы получателю или криоконсервированы. У крупного рогатого скота, как и у многих других видов, несмотря на потенциал, предлагаемый IVP, количество эмбриона в пробирке на корову в значительной степени не улучшась в течение последних 40 лет. Отчасти это связано с ограниченным числом полностью выращенных яйцеклеток, которые населяют яичник в данный момент времени, которые могут быть извлечены и подвергнуты стандартным методам IVP4,,5,,6.
Ооциты, заключенные в ранние антрал фолликулы, т.е. те фолликулы диаметром менее 2 мм, представляют собой потенциальный источник, который будет использоваться впрограммах сохранения плодородия 7, так как яичник примерно содержит в 10 раз больше ранних антрал-фолликулов, чем среднийантрал 8. Тем не менее, эти яйцеклетки все еще находятся в фазе роста и еще не достигли полностью выращенной стадии9. Таким образом, они по-прежнему транскрипционно активны, производя mRNAs, которые будут храниться для более поздних шагов развития, и еще не прошли весь процесс дифференциации, необходимые для придать яйцеклетки с возможностью спонтанного возобновления и завершения мейоза я когда-то изолированы от фолликулярногоотсека 10,11. Поэтому они не могут быть непосредственно представлены к стандартным протоколам созревания in vitro (IVM), но они требуют дополнительного периода культуры, который позволил бы им завершить фазу роста и правильно дифференцировать.
Переход от выращивания к полностью выращенной стадии, которая у крупного рогатого скота происходит, когда фолликул развивается от ранней антраля к средней антральную стадию, является одним из важнейших шагов во время развития яйцеклеток. В крупного рогатого скота, несколько исследований пытались повторить эти события впробирке2,12,,13,,14,,15,,16,,17,,18,19. Однако до настоящего времени никаких надежных протоколов не разрабатывалось, и сообщалось лишь об ограниченном успехе. Согласно предыдущим исследованиям20, эти растущие яйцеклетки представляют собой однородную популяцию. Помимо транскрипционной активной, их хроматин рассеивается в зародышевой везикуле (GV), в конфигурации, которая называется GV02,21. И наоборот, популяция полностью выращенных яйцеклеток, полученных из средних антрал фолликулов, является более неоднородной, состояние, которое отражается в различных степенях уплотнения хроматина (GV1, GV2 и GV3), которыеможно наблюдать 20. Среди них, предыдущие данные показали, что GV2 и GV3 ооцитов в целом характеризуется лучшим качеством и более высокойэмбриональной компетенции развития 20,21,22,23,24.
Начиная с вышеуказанных наблюдений, здесь мы описываем 5-дней культурную систему ооцитов (L-IVCO), которая позволяет дифференцировать ооциты, изолированные как кумулятиво-ооцитные комплексы (COCs) от ранних антралальных фолликулов. Эта стратегия культуры развивалась из 10 лет исследований, проведенных в нашей лаборатории и корни его землю на ранее разработанных 24-48 часов в пробирке ооцитов культуры (IVCO)2,недоношенных систем 23,25 и цинк добавок во время культуры яйцеклеток . Использовалась комбинация фолликулостимулирующего гормона (ФФГ) и ингибитора фосфодиэстеразы-3 (PDE3), способного усилить кумулятивно-ооцитнуюсвязь 2, предотвратитьнесвоевременное межиоптическое возобновление 2,атакже поддержать рост яйцеклеток 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем культурную систему выращивания яйцеклеток, которая способствует развитию яйцеклеток в течение 5 дней, поддерживая их жизнеспособность и предотвращая мейотические возобновления. Этот последний аспект имеет первостепенное значение, чтобы обеспечить дальнейший рост…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Регион Ломбардия PSR INNOVA N.201801061529 и UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01
Materials
| 4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
| 96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
| Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
| Cell culture water | Sigma | W3500 | |
| Cilostamide | Sigma | C7971 | |
| Cysteamine | Sigma | M9768 | |
| Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
| Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
| Estradiol | Sigma | E2758 | |
| Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Gonal F | Merck Serono | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Hepes | Sigma | H3784 | |
| Vacuum pump | Cook-IVF | ||
| Incubator | Sanyo | ||
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
| Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for hepes-buffered TCM199 |
| Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for M199-D |
| Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
| Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilin | Sigma | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium choride | Sigma | P5886 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Testosterone | Sigma | 86500 | |
| Triton X | Sigma | T9284 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Water | Sigma | W3500 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |
References
- Lonergan, P., Fair, T. Maturation of Oocytes in Vitro. Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).
- Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s). Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Galli, C. Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective. Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).
- Luciano, A. M., Sirard, M. A. Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation. Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).
- Lonergan, P., Fair, T. In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts. Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).
- Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link. Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).
- Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).
- Blondin, P., Sirard, M. A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).
- Harada, M., et al. Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine. Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles. Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).
- Taketsuru, H., et al. Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification. Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).
- Endo, M., et al. Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles. Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).
- Makita, M., Miyano, T. Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells. Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).
- Yamamoto, K., et al. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).
- Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture. Theriogenology. 118, 110-118 (2018).
- Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence. Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).
- Lodde, V., et al. Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).
- Dieci, C., et al. Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production. Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).
- Soares, A. C. S., et al. Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle. Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).
- Soares, A. C. S., et al. Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds. Theriogenology. 141, 146-152 (2020).
- Franciosi, F., et al. Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes. Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization. Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).
- Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos. Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).
- Dieci, C., et al. The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer. Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).
- Shu, Y. M., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Lodde, V., et al. Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes. Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).
- Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).
- Kruip, T. A., Dieleman, S. J. Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle. Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).
- Sakaguchi, K., et al. Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle. Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).
- Makita, M., Miyano, T. Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes. Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).
- Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J. Androgen actions and the ovary. Biology of Reproduction. 78 (3), 380-389 (2008).
- Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium. Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).
- Gordon, I. . Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , (2003).
- Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
