In Vitro kulturstrategi för Oocytes från tidig Antral Follicle i nötkreatur
Summary
Vi beskriver de förfaranden för isolering av växande oocytes från äggstockscancer folliklar i tidiga skeden av utvecklingen, samt inställning av en in vitro-kultur system som kan stödja tillväxt och differentiering upp till fullvuxen skede.
Abstract
Den begränsade reserven av mogna, fruktbara äggceller utgör en stor barriär för framgång assisterad reproduktion hos däggdjur. Med tanke på att under den reproduktiva livslängden endast cirka 1% av äggceller i en äggstock mogna och ägglossning, har flera tekniker utvecklats för att öka exploatering av äggstocksreserven till den växande befolkningen av icke-ägglossning folliklar. Sådan teknik har tillåtit insatser av fertilitet bevarande, urvalsprogram i boskap, och bevarande av utrotningshotade arter. Men den stora potentialen i äggstocksreserven är fortfarande i stort sett outnyttjad. Hos kor har till exempel vissa försök gjorts att stödja in vitro-kulturen av oocyter i specifika utvecklingsstadier, men effektiva och tillförlitliga protokoll har ännu inte utvecklats. Här beskriver vi ett kultursystem som återger de fysiologiska villkoren för motsvarande follikulära skede, definieras för att utveckla in vitro växande oocyter som samlats in från nötkreatur tidiga antrala folliklar till fullvuxen skede, motsvarande den medelstora antral follicle in vivo. En kombination av hormoner och en phosphodiesterase 3-hämmare användes för att förhindra untimely meiotic återupptagande och att vägleda äggcells differentiering.
Introduction
Under den reproduktiva livslängden, endast en minimal fraktion av de äggceller som är närvarande i en äggstock mogna, frigörs i äggledarna vid ägglossningen, och är tillgängliga för att befruktas och utvecklas till en livskraftig embryo1. Å andra sidan, de flesta av äggceller inom en äggstock genomgår atresia och är aldrig ägglossning. In vitro embryo produktion (IVP) teknik har försökt att öka utnyttjandet av äggstocksreserven2,3. Hittills har sådan teknik tillåtit insatser av fertilitet bevarande, urvalsprogram i boskap, och bevarande av utrotningshotade arter. Ändå, de flesta protokoll använder oocyter som i princip har avslutat tillväxtfasen inom antral ovariefolicle, och därmed kallas fullvuxna äggceller. Hos nötkreatur, där IVP-teknik används i stor utsträckning, når fullvuxna äggceller en slutlig diameter på cirka 120 μm och samlas in från folliklar som sträcker sig från 2 till 8 mm i diameter (medelstora antrala folliklar)1. Vid isolering från folliklaren, är sådana äggceller in vitro mognat och befruktas. Zygoterna odlas sedan upp till blastocyststadiet och antingen överförs till en mottagare eller cryopreserved. Hos nötkreatur, liksom i många andra arter, trots den potential som ivp erbjuder, förbättrades inte i hög grad antalet in vitro-producerade embryon per ko under de senaste 40 åren. Detta beror delvis på det begränsade antalet fullvuxna äggceller som fyller en äggstock vid en viss tidpunkt som kan hämtas och utsättas för standard IVP-tekniker4,5,6.
De oocyter inneslutna inom tidiga antral folliklar, dvs de folliklar som är mindre än 2 mm i diameter, utgör en potentiell källa som ska användas i fertilitet bevarande program7 , som en äggstock ungefär innehåller 10 gånger mer tidiga antral folliklar än medium en8. Dessa oocyter befinner sig dock fortfarande i tillväxtfasen och har ännu inte nått det fullvuxna stadiet9. Som sådan, de är fortfarande transkriptionellt aktiva, producerar mRNAs som kommer att lagras för senare utvecklingsmässiga steg, och har ännu inte genomgått alla de differentieringsprocess som krävs för att förläna oocyterna med förmåga att spontant återuppta och slutföra meios jag en gång isolerade från follikulära fack10,11. Därför kan de inte direkt överlämnas till standardprotokoll för in vitro-mognad (IVM), men de kräver ytterligare en period av kultur som skulle göra det möjligt för dem att slutföra tillväxtfasen och korrekt differentiera.
Övergången från det växande till det fullvuxna stadiet, som hos nötkreatur sker när follikeln utvecklas från den tidiga antral till det medelstora antralstadiet, är ett av de kritiska stegen under oocyteutvecklingen. Hos nötkreatur, flera studier försökt att rekapitulera dessa händelser in vitro2,12,13,14,15,16,17,18,19. Hittills har dock inga tillförlitliga protokoll utvecklats och endast begränsad framgång har rapporterats. Enligt tidigare studier20, dessa växande oocyter utgör en homogen population. Förutom att vara transkriptionellt aktiv, är deras kromatin spridda i germinal vesikel (GV), i en konfiguration som heter GV02,21. Omvänt är befolkningen i fullvuxna oocyter som erhålls från medelstora antrala folliklar mer heterogena, ett tillstånd som speglas av de olika grader av kromatin kompaktering (GV1, GV2 och GV3) som kan observeras20. Bland dessa har tidigare uppgifter visat att GV2 och GV3 oocyter är övergripande kännetecknas av en bättre kvalitet och högre embryonal utvecklingskompetens20,21,22,23,24.
Med utgångspunkt från ovanstående iakttagelser, här beskriver vi en 5-dagars lång kultur system av äggceller (L-IVCO) som gör det möjligt att differentiera oocytes isoleras som cumulus-oocyte komplex (COCs) från tidiga antrala folliklar. Denna kultur strategi har utvecklats från 10 år långa studier som genomförts i vårt labb och rötter sin grund på de tidigare utvecklade 24-48 timmar in vitro-oocyte kultur (IVCO)2, prematuration system23,25 och zink tillskott under äggcell kultur . En kombination av follikelstimulerande hormon (FSH) och en phosphodiesterase-3 (PDE3) hämmare, kunna förstärka cumulus-oocyte kommunikation2, förhindra untimely meiotisk återupptagande2, och stöd oocyte tillväxt2 användes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi ett kultursystem för växande oocyter som främjar oocyte utveckling i 5 dagar genom att stödja deras livskraft och förhindra meiotiska återupptagande. Denna senare aspekt är av yttersta vikt att tillåta fortsatt tillväxt och differentiering som är nödvändig för att förläna oocyten med meiotisk och embryonal utvecklingskompetens2,20, som annars skulle blockeras av ett förtidigt återupptagande av meiotiska divisionen.
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 och UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01
Materials
| 4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
| 96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
| Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
| Cell culture water | Sigma | W3500 | |
| Cilostamide | Sigma | C7971 | |
| Cysteamine | Sigma | M9768 | |
| Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
| Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
| Estradiol | Sigma | E2758 | |
| Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Gonal F | Merck Serono | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Hepes | Sigma | H3784 | |
| Vacuum pump | Cook-IVF | ||
| Incubator | Sanyo | ||
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
| Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for hepes-buffered TCM199 |
| Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for M199-D |
| Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
| Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilin | Sigma | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium choride | Sigma | P5886 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Testosterone | Sigma | 86500 | |
| Triton X | Sigma | T9284 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Water | Sigma | W3500 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |
References
- Lonergan, P., Fair, T. Maturation of Oocytes in Vitro. Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).
- Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s). Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Galli, C. Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective. Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).
- Luciano, A. M., Sirard, M. A. Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation. Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).
- Lonergan, P., Fair, T. In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts. Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).
- Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link. Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).
- Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).
- Blondin, P., Sirard, M. A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).
- Harada, M., et al. Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine. Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles. Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).
- Taketsuru, H., et al. Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification. Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).
- Endo, M., et al. Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles. Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).
- Makita, M., Miyano, T. Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells. Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).
- Yamamoto, K., et al. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).
- Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture. Theriogenology. 118, 110-118 (2018).
- Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence. Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).
- Lodde, V., et al. Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).
- Dieci, C., et al. Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production. Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).
- Soares, A. C. S., et al. Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle. Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).
- Soares, A. C. S., et al. Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds. Theriogenology. 141, 146-152 (2020).
- Franciosi, F., et al. Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes. Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization. Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).
- Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos. Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).
- Dieci, C., et al. The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer. Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).
- Shu, Y. M., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Lodde, V., et al. Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes. Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).
- Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).
- Kruip, T. A., Dieleman, S. J. Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle. Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).
- Sakaguchi, K., et al. Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle. Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).
- Makita, M., Miyano, T. Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes. Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).
- Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J. Androgen actions and the ovary. Biology of Reproduction. 78 (3), 380-389 (2008).
- Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium. Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).
- Gordon, I. . Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , (2003).
- Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
