여기서, 우리는 형광 화상 진찰에 의하여 혈관, 핵, 면역 세포, 뉴런 및 지질 물방울 외투 단백질을 시각화하기 위하여 마커의 조합을 사용하여 마우스와 인간 백색 지방 조직의 3D 구조를 해결하는 간단하고 저렴하고 빠른 청산 방법을 기술합니다.
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이 논문에서
요약
초록
비만은 심장 혈관 질병, 타입-2 당뇨병 및 간 질병을 개발하는 리스크를 증가시키는 중요한 세계적인 공중 위생 문제점입니다. 비만은 지방 조직 (AT) 대두 증식 및 비대성으로 인해 질량의 증가를 특징으로하며, 3 차원 구조의 심오한 리모델링으로 이어진다. 실제로, 비만 도중 확장하는 AT의 최대 용량은 비만 관련 병학의 발달에 중추적인 입니다. 이 AT 확장은 에너지 섭취량의 과잉에 적응을 가능하게하고 다른 신진 대사 기관에 해로운 지질 유출을 피하기 위해 중요한 정향적 메커니즘입니다, 근육과 간 등. 따라서 AT 확장의 실패로 이어지는 구조적 리모델링을 이해하는 것은 높은 임상 적용성을 가진 근본적인 질문입니다. 이 기사에서는 형광 이미징에 의한 마우스 및 인간 백색 지방 조직의 형태를 탐구하기 위해 실험실에서 일상적으로 사용되는 간단하고 빠른 클리어링 방법을 설명합니다. 이 최적화된 AT 클리어링 방법은 화학 후드, 온도 제어 궤도 셰이커 및 형광 현미경을 갖춘 모든 표준 실험실에서 쉽게 수행됩니다. 또한 사용되는 화학 화합물을 쉽게 사용할 수 있습니다. 중요한 것은, 이 방법은 다양한 마커를 염색하여 3D AT 구조를 구체적으로 시각화하여, 신경 및 혈관 네트워크, 그리고 선천적이고 적응적인 면역 세포 분포를 확인할 수 있게 한다.
서론
비만은 지방 조직 질량에 있는 증가를 특징으로 하고 비만을 가진 사람들이 심장 혈관 질병, 타입-2 당뇨병, 간 질병 및 몇몇 암을 개발의 리스크를 증가했다는 것을 감안할 때, 중요한 세계적인 공중 위생 문제점이 되었습니다.
지방 조직의 근본적인 생리적 기능은 전신 포도당과 지질 항상성1,,2를조절하는 것입니다. 먹이 주기 동안, 지방 조직의 주요 세포(즉, 지방 조직의 주요 세포)는 식사에서 제공하는 포도당과 지질의 과잉을 트리글리세라이드로 저장합니다. 금식 하는 동안, 지방 세포는 신체의 에너지 수요를 유지 하기 위해 비 에스테르 지방산 과 글리세롤으로 트리 글리세라이드를 분해. 비만의 발달 도중, 지방 조직은 그들의 저장 용량을 증가시키기 위하여 adipocytes의크기 (비대성) 및/또는 수 (hyperhyperasia)를 증가시킴으로써 확장합니다. 지방 조직의 팽창이 한계에 도달하면, 환자 들 사이에서 일정한 높게 변수, 나머지 지질은 근육과 간3을포함하여 다른 신진 대사 기관에 축적3,4,
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프로토콜
이 프로토콜은 테스트되었으며 모든 마우스 및 인간 흰색 지방 조직 창고에 대해 검증되었습니다. 인간과 마우스 조직 조직은 유럽 법률에 따라 수집및 프랑스와 스웨덴 윤리위원회에 의해 승인되었다.
1. 마우스와 인간의 흰색 지방 조직의 고정
- 수확한 마우스 또는 인간의 백색 지방 조직을 15mL 플라스틱 튜브에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 함유한 PBS의 최소 10mL에 담급니다.
- 1 시간 동안 압연 접시에 실온에서 플라스틱 튜브를 흔들어.
- 플라스틱 튜브를 하룻밤 동안 롤링 플레이트에 4°C로 두고 고정을 완료합니다.
참고: 본 프로토콜은 마우스로부터 얻은 전체 부피지방 패드와 같은 대형 지방 조직 샘플에 적응되어 정상적인 식단을 공급합니다(≈250 mg - ≈0.6 cm3). 쥐로부터 얻은 고지방 지방 패드(≈1.5g-≈4cm3)또는 인간 지방 조직 샘플을 공급한 고지방 지방 패드와 같은 더 큰 시료의 경우, 클리어링 프로토콜은 전체 샘플(PFA 및 항체 혼합물을 스케일업하여)에 완벽하게 작동해야 하지만, 일반적으로, 1g(≈2.5cm3)주위의 조직 조각을 절단하여 추가 적인 시료를 예비합니다. PFA (단계 1.1.)의 경우....
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결과
여기에 기재된 절차를 이용하여 도 1에요약된, 우리는 도 2A 및 도 2B에각각 제시된 바와 같이 인간및 마우스 백색 지방 조직을 각각 얼룩지게 하고 광학적으로 맑은 조직할 수 있었다. 클리어된 조직은 공초점 이미징(도 3A)을 수행하기 위해 금속 이미징 챔버로옮겨졌다. 클리어링은 우리가 획득할 수 있었던 조직 이미지의 깊이를 크게향상(도 3B 및 도 3C). 전체 지방 조직은 4배 목표(보충 동영상 1 참조)를사용하여 낮은 배율에서 3D로 획득할 수 있으며, 3D 맵을 생성하여 20배 목표(도3D)를사용하여 높은 배율에서 획득할.......
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토론
비만과 같은 병리학적 진행 과정에서 지방 조직 내에서 발생하는 수정은 병리학 뒤에 있는 메커니즘의 이해에 기본입니다. 지방 조직에서 이러한 메커니즘을 밝힌 선구적인 연구는 전체 지방 조직프로테오믹스(21),유동 세포측정법(22,,23)및전사학(24,,25)과같은 글로벌 접근법에 기반을 두고 있다.22 또한, 조직학적 분석을 이용하여 지방 조직에서 발생하는 구조적 변화를 탐구하기 위한 노력이 이루어지고 있다26,,27,,28,,29. 그러나, 5-10 μ.......
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공개 사항
저자는 공개 할 충돌이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 INSERM에 의해 지원되었다, 유니버시테 코트 다쥐르( Côte d'Azur)와 프랑스 국립연구청(ANR)의 보조금으로 퓨처 라벡스 시나라이프(ANR-11-LABX-0028-01), 아카데미 2 "시스테메스 컴플렉스" 및 아카데미 4 "비벤테"를 통해 프로그램 UCA JEDI(ANR-15-IDEX-01) 라 레체르체 메디칼(에키페 FRM DEQ20180839587)과 J.G.(ANR18-CE14-0035-01-길러론)에 대한 젊은 조사 프로그램 도 쏟아졌다. 또한 콘세일 데파르테멘탈 데 알프스-마리타임스와 레지온 PACA가 지원하는 C3M의 이미징 코어 시설에 감사드리며, IBISA 현미경 및 이미징 플랫폼 코트 다쥐르(MICA)가 지원합니다. 우리는 조직 준비에 기술적 인 도움을 매리언 두소트 감사합니다. 우리는 애비 컷트리스, UCA 국제 과학 가시성, 원고의 증거 읽기에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 마이크로튜브 | Eppendorff 튜브 - Dutscher | 33528 | |
| 15 mL 플라스틱 튜브 | , Falcon 튜브 - Dutscher | 352096 | |
| 18 mm 원형 유리 커버슬립 | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL 유리병 | , Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | 희석: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | 희석: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE 항체 | Biolegend | BLE145703 | 희석: 1/100 |
| CD31 항체 | AbCam | ab215912 | 희석: 1/50 |
| 상용 3D 분석 소프트웨어 - IMARIS | Oxford instrument | 셀 모듈 | |
| 포함 컨포칼 현미경 - Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | 재고 농도: 5 mg/mL; 희석 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 항체 | Santa Cruz | sc-53566 | 희석: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | 재고 농도 : 2 µ g/&마이크로; L; IV 주입 : 50 µ 유리 |
| 바닥이 장착된 L/마우스 금속 이미징 챔버 - AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| 메틸 살리실레이트 | Sigma-aldrich | M6752 | |
| 페리리핀 항체 | Progen | 651156 | 희석: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | 희석: 1/100 |
| TCR-&베타;-PB 항체 | Biolegend | BLE109225 | 희석: 1/100 |
| TH 항체 | AbCam | ab112 | 희석: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
참고문헌
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E.
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