חקר מבנה רקמת שומן על ידי ניקוי מתילסיילאט והדמיה תלת-ממדית
Summary
כאן, אנו מתארים שיטת סליקה פשוטה, זולה ומהירה כדי לפתור את המבנה 3D של רקמת שומן לבנה עכבר ואדם באמצעות שילוב של סמנים כדי לדמיין כלי דם, גרעין, תאים חיסוניים, נוירונים, וחלבונים מעיל שומנים-טיפות על ידי הדמיה פלואורסצנטית.
Abstract
השמנת יתר היא בעיה גדולה ברחבי העולם בריאות הציבור שמגביר את הסיכון לפתח מחלות לב וכלי דם, סוכרת סוג 2, ומחלות כבד. השמנת יתר מאופיינת בעלייה במסה של רקמת שומן (AT) בשל היפרפלזיה אדפוציט ו/או היסטרופיה, מה שמוביל לשיפוץ עמוק של המבנה התלת מימדי שלה. אכן, היכולת המקסימאלית של AT להתרחב במהלך השמנת יתר היא חיונית להתפתחות של פתולוגיות הקשורות להשמנת יתר. הרחבת AT זה היא מנגנון הוםוסטטי חשוב כדי לאפשר הסתגלות לעודף צריכת אנרגיה ולהימנע שפיכת שומנים מזיקים לאיברים מטבוליים אחרים, כגון שריר וכבד. לכן, הבנת השיפוץ המבני שמוביל לכישלון של הרחבת AT היא שאלה בסיסית עם ישימות קלינית גבוהה. במאמר זה, אנו מתארים שיטת ניקוי פשוטה ומהירה המשמשת באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי לחקור את המורפולוגיה של רקמת שומן לבנה של עכבר ואדם לבן על ידי הדמיית פלורסנט. שיטת ניקוי AT ממוטבת זו מבוצעת בקלות בכל מעבדה סטנדרטית המצוידת במכסה מנוע כימי, שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ומיקרוסקופ פלורסנט. יתר על כן, תרכובות כימיות בשימוש זמינים. חשוב לציין, שיטה זו מאפשרת לפתור את מבנה 3D AT על ידי הכתמת סמנים שונים כדי לדמיין באופן ספציפי את adipocytes, רשתות עצביות וסקולריות, ואת התפלגות תאי החיסון המולדת ואדפטיבית.
Introduction
השמנת יתר מאופיינת בעלייה במסת רקמת שומן והפכה לבעיה גדולה ברחבי העולם לבריאות הציבור, בהתחשב בכך שאנשים עם השמנת יתר יש סיכון מוגבר לפתח מחלות לב וכלי דם, סוכרת סוג 2, מחלות כבד וכמה סוגי סרטן.
פונקציה פיזיולוגית בסיסית של רקמת שומן היא לווסת גלוקוז כל הגוף הומאוסטאזיסשומנים 1,,2. במהלך תקופת ההאכלה, adipocytes (כלומר, התאים העיקריים של רקמת שומן) לאחסן את עודף הגלוקוז והשומנים המסופקים על ידי ארוחה לתוך טריגליצרידים. במהלך הצום, adipocytes לשבור את הטריגליצרידים לתוך חומצות שומן לא esterified גליצרול כדי לקיים את הביקוש האנרגיה של הגוף. במהלך התפתחות השמנת יתר, רקמת שומן להרחיב על ידי הגדלת הגודל (היסטרופיה) ו / או את המספר (היפרפלזיה) של adipocytes1,כדי להגדיל את קיבולת האחסון שלהם. כאשר ההתפשטות של רקמת שומן מגיע לגבול שלה, משתנה מאוד קבוע בקרב חולים, שומנים הנותרים מצטברים לתוך איברים מטבוליים אחרים כולל שרירים וכבד3, 4,המוביל לכשל התפקודישלהם וייזום סיבוכים אירוביים הקשורים להשמנת יתר1,,5. לכן, זיהוי המנגנונים השולטים בהרחבת רקמת שומן הוא אתגר קליני מרכזי.
השינויים המורפולוגיים המתועדים בתוך רקמות שומן במהלך השמנת יתר קשורים לתפקוד הפתולוגי שלה. מספר הליכי כתמים שימשו לתיאור ארגון הרקמות של רקמת השומן, כולל actin6, סמני כלידם 7, סמנים שומנים-טיפות8, וסמניםספציפיים תא חיסוני9,,10. עם זאת, בגלל הקוטר העצום של adipocytes (50 כדי 200 μm)11, זה חיוני לנתח חלק גדול של הרקמה כולה בשלושה ממדים על מנת לנתח במדויק את השינויים המבניים הדרמטיים AT שנצפו במהלך השמנת יתר. עם זאת, מכיוון שהאור אינו חודר רקמה אטומה, הדמיה ב3D בתוך דגימות רקמה גדולה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסץ אינה אפשרית. שיטות של ניקוי רקמות כדי להפוך אותם שקופים דווחו בספרות(לסקירה, ראה 12)המאפשר אחד לנקות רקמות ולבצע מעמיק, מיקרוסקופ פלואורסק של רקמות שלם. שיטות אלה מציעות הזדמנויות חסרות תקדים להעריך את הארגון הסלולרי 3D ברקמה בריאה וחלויה. לכל אחת מהשיטות המתוארות יש יתרונות וחסרונות, ולכן יש לבחור בקפידה בהתאם לרקמות הנחקרות (לסקירה,ראה 13). ואכן, גישות מסוימות דורשות תקופת דגירה ארוכה ו/או שימוש בחומרים או תרכובותיקרים, רעילים או קשים להשגה של 14, 15,,15,16,,17,,18,,19. תוך ניצול של אחת התרכובות הראשונות ששימשו לפני מאה שנה על ידי ורנר Spalteholzכדי לנקות רקמות 20, הקמנו פרוטוקול ידידותי למשתמש ולא יקר כי הוא מותאם היטב עבור ניקוי של כל העכבר ומחסני רקמת שומן אנושי בכל מעבדה עם ציוד טיפוסי כולל מכסה מנוע כימי, שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ומיקרוסקופ confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
השינויים המתרחשים בתוך רקמת השומן במהלך ההתקדמות הפתולוגית, כגון זה של השמנת יתר, הוא בסיסי להבנת המנגנונים מאחורי הפתולוגיה. מחקרים חלוציים שחשפו מנגנונים כאלה ברקמת שומן התבססו על גישות גלובליות כגון פרוטאומיקה רקמת שומןשלמה 21, ציתוםזרימה 22,23</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי INSERM, אוניברסיטת קוט ד ‘אזור, ועל ידי מענקים מסוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR) באמצעות ההשקעות עבור ה-Labex SIGNALIFE העתידי (ANR-11-LABX-0028-01), התוכנית UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) באמצעות האקדמיה 2 “מתחמי Systèmes” והאקדמיה 4 “Complexité et diversité du vivant”, Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), ואת תוכנית החוקר הצעיר לג’יי.ג’יי (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). אנו מודים גם למתקן ליבת ההדמיה של C3M במימון קונסיל דפרטמנטל דה אלפס-מריטיים ו-Région PACA, אשר נתמך גם על ידי פלטפורמת המיקרוסקופ וההדמיה IBISA Côte d’Azur (MICA). אנו מודים למריון דוסוט על העזרה הטכנית בהכנת רקמות. אנו מודים לאבי קאטריס, הנראות המדעית הבינלאומית של UCA, על קריאת כתב היד.
Materials
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes – Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes – Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software – IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope – Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom – AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
References
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
- Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
- Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
- Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
- Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
- Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
- Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
- Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
- Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).
- Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
- Spalteholz, W., Hierzel, S. . Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. , (1911).
- Shields, K. J., Wu, C. Differential Adipose Tissue Proteomics. Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).
- Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
- Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
- Coppack, S. W. Adipose tissue changes in obesity. Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).
- Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
- Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
- Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
- Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).
