Explorar la estructura del tejido adiposo mediante la limpieza de metilsalicilatos y las imágenes 3D
Summary
Aquí, describimos un método de limpieza simple, barato y rápido para resolver la estructura 3D del tejido adiposo blanco humano y de ratón utilizando una combinación de marcadores para visualizar vasculatura, núcleos, células inmunitarias, neuronas y proteínas de la capa de gotas de lípidos mediante imágenes fluorescentes.
Abstract
La obesidad es un importante problema de salud pública en todo el mundo que aumenta el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares, diabetes tipo 2 y enfermedades hepáticas. La obesidad se caracteriza por un aumento de la masa del tejido adiposo (AT) debido a la hiperplasia de adipocitos y/o hipertrofia, lo que conduce a una profunda remodelación de su estructura tridimensional. De hecho, la capacidad máxima de AT para expandirse durante la obesidad es fundamental para el desarrollo de patologías asociadas a la obesidad. Esta expansión AT es un importante mecanismo homeostático para permitir la adaptación a un exceso de ingesta de energía y para evitar el derrame de lípidos nocivos a otros órganos metabólicos, como el músculo y el hígado. Por lo tanto, entender la remodelación estructural que conduce al fracaso de la expansión AT es una cuestión fundamental con alta aplicabilidad clínica. En este artículo, describimos un método de limpieza simple y rápido que se utiliza rutinariamente en nuestro laboratorio para explorar la morfología del ratón y el tejido adiposo blanco humano por imágenes fluorescentes. Este método de compensación AT optimizado se realiza fácilmente en cualquier laboratorio estándar equipado con una capucha química, un agitador orbital con temperatura controlada y un microscopio fluorescente. Además, los compuestos químicos utilizados están fácilmente disponibles. Es importante destacar que este método permite resolver la estructura 3D AT manchando varios marcadores para visualizar específicamente los adipocitos, las redes neuronales y vasculares, y la distribución de células inmunitarias innatas y adaptativas.
Introduction
La obesidad se caracteriza por un aumento de la masa de tejido adiposo y se ha convertido en un importante problema de salud pública en todo el mundo, dado que las personas con obesidad tienen un mayor riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares, diabetes tipo 2, enfermedades hepáticas y algunos tipos de cáncer.
Una función fisiológica fundamental del tejido adiposo es modular la glucosa de todo el cuerpo y la homeostasis lipídica1,2. Durante el período de alimentación, los adipocitos (es decir, las células principales del tejido adiposo) almacenan el exceso de glucosa y lípidos proporcionado por una comida en triglicéridos. Durante el ayuno, los adipocitos descomponen los triglicéridos en ácidos grasos no esterificados y glicerol para mantener la demanda de energía del cuerpo. Durante el desarrollo de la obesidad, el tejido adiposo se expande aumentando el tamaño (hipertrofa) y/o el número (hiperplasia) de adipocitos1,para aumentar su capacidad de almacenamiento. Cuando la expansión del tejido adiposo alcanza su límite, una constante altamente variable entre los pacientes, los lípidos restantes se acumulan en otros órganos metabólicos incluyendo músculos e hígado3,,4, lo que conduce a su fracaso funcional e inicia complicaciones cardio-metabólicas relacionadas con la obesidad1,,5. Por lo tanto, identificar los mecanismos que rigen la expansión del tejido adiposo es un desafío clínico clave.
Las modificaciones morfológicas documentadas dentro de los tejidos adiposos durante la obesidad están vinculadas a su disfunción patológica. Se han utilizado varios procedimientos de tinción para describir la organización tisular del tejido adiposo, incluyendo actina6,marcadores vasculares7, marcadores de gotas de lípidos8, y marcadores específicos de células inmunitarias9,10. Sin embargo, debido al enorme diámetro de los adipocitos (50 a 200 m)11, es esencial analizar una gran parte de todo el tejido en tres dimensiones con el fin de analizar con precisión los dramáticos cambios estructurales de AT observados durante la obesidad. Sin embargo, debido a que la luz no penetra en un tejido opaco, no es posible tomar imágenes en 3D dentro de una gran muestra de tejido utilizando microscopía de fluorescencia. En la literatura se han notificado métodos de limpieza de tejidos para hacerlos transparentes (para una revisión, véase12), lo que permite limpiar los tejidos y realizar una microscopía de fluorescencia de tejido entero en profundidad. Estos métodos ofrecen oportunidades sin precedentes para evaluar la organización celular 3D en tejido sano y enfermo. Cada uno de los métodos descritos tiene ventajas e inconvenientes, y por lo tanto debe ser cuidadosamente seleccionado dependiendo del tejido estudiado (para una revisión, ver13). De hecho, algunos enfoques requieren un largo período de incubación y/o el uso de materiales o compuestos que sean caros, tóxicos o difíciles de obtener14,,15,,16,,17,,18,,19. Aprovechando uno de los primeros compuestos utilizados hace un siglo por Werner Spalteholz para limpiar los tejidos20,hemos establecido un protocolo fácil de usar y económico que está muy bien adaptado para la limpieza de todos los depósitos de tejido adiposo humano y ratón en cualquier laboratorio con equipos típicos que incluyen una capucha química, un agitador orbital controlado por temperatura y un microscopio confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las modificaciones que se producen dentro del tejido adiposo a lo largo de la progresión patológica, como la de la obesidad, son fundamentales para la comprensión de los mecanismos detrás de la patología. Estudios pioneros que revelaron estos mecanismos en el tejido adiposo se han basado en enfoques globales como la proteómica entera del tejido adiposo21,la citometría de flujo22,,23,y la transcriptómica24,<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el INSERM, Universidad De Costa Azul, y con subvenciones de la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR) a través de las Inversiones para el Futuro Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), el programa UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) a través de Academy 2 “Syst-mes Complexes” y Academy 4 “Complexité et diversité du vivant”, La Fundación para la Recherche Médical (quipe FRM DEQ20180839587), y el Programa de Jóvenes Investigadores a J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Agradecemos también el Fondo Básico de Imagen del C3M financiado por el Conseil Départemental des Alpes-Maritimes y la Région PACA, y que también cuenta con el apoyo de la Plataforma de Microscopía e Imagen de IBISA (MICA). Agradecemos a Marion Dussot por la ayuda técnica en la preparación de tejidos. Agradecemos a Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, por la lectura comprobante del manuscrito.
Materials
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes – Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes – Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software – IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope – Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom – AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
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