Canlı Mikroskopi Görüntüleme Altında 3D Hidrojellerin Kontrollü Suşu
Summary
Sunulan yöntem, canlı konfokal mikroskopiye izin verirken silikon kauçuğun içine gömülü 3D yumuşak hidrojellerin tek eksenli gerilmesini içerir. Dış ve iç hidrojel suşlarının karakterizasyonu ve fiber hizalaması gösterilmiştir. Geliştirilen cihaz ve protokol, hücrelerin çeşitli gerinim rejimlerine tepkisini değerlendirebilir.
Abstract
Dış kuvvetler doku oluşumunda, gelişiminde ve bakımında önemli bir faktördür. Bu kuvvetlerin etkileri genellikle özel in vitro germe yöntemleri kullanılarak incelenir. Mevcut çeşitli sistemler 2D substrat bazlı sedyeler kullanırken, yumuşak hidrojelleri zorlamak için 3D tekniklerin erişilebilirliği daha kısıtlıdır. Burada, yumuşak hidrojellerin çevrelerinden dış gerilmesine izin veren bir yöntemi, numune taşıyıcı olarak elastik bir silikon şerit kullanarak açıklıyoruz. Bu protokolde kullanılan germe sistemi, 3D baskılı parçalardan ve düşük maliyetli elektronikten inşa edilmiştir, bu da diğer laboratuvarlarda çoğaltılmasını basit ve kolay hale getirir. Deneysel süreç, silikon şeridin ortasındaki bir kesmede kalın (>100 μm) yumuşak fibrin hidrojelleri (~100 Pa’nın Elastik Modülü) polimerizasyonu ile başlar. Silikon jel yapılar daha sonra baskılı germe cihazına tutturulur ve konfokal mikroskop aşamasına yerleştirilir. Canlı mikroskopi altında germe cihazı etkinleştirilir ve jeller çeşitli streç büyüklüklerinde görüntülenir. Görüntü işleme daha sonra elde edilen jel deformasyonlarını ölçmek için kullanılır ve jelin 3D kalınlığı(Zekseni) boyunca nispeten homojen suşları ve lif hizalamasını gösterir. Bu yöntemin avantajları arasında in situ mikroskopiyi yürütürken son derece yumuşak hidrojelleri 3D olarak germe yeteneği ve numunenin geometrisini ve boyutunu kullanıcının ihtiyaçlarına göre manipüle etme özgürlüğü yer almaktadır. Ek olarak, uygun adaptasyon ile bu yöntem diğer hidrojel türlerini (örneğin kollajen, poliakrilamid veya polietilen glikol) germek için kullanılabilir ve daha biyomimetik 3D koşullar altında dış kuvvetlere hücrelerin ve doku tepkisinin analizine izin verebilir.
Introduction
Mekanik kuvvetlere doku tepkisi, gen ekspresyasyonu1,hücre farklılaşması2ve doku tadilatı3dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik fonksiyonların ayrılmaz bir parçasıdır. Ayrıca, lif hizalama ve densifikasyon gibi hücre dışı matriste (ECM) kuvvet kaynaklı değişiklikler hücre davranışını ve doku oluşumunu etkileyebilir4,5,6. ECM’nin lifli ağ yapısı, doğrusal olmayan elastikiyet, afin dışı deformasyon ve plastik deformasyonlar 7 , 8 , 9,10,11,12gibi ilgi çekici mekaniközellikleresahiptir. Bu özellikler, hücrelerin ve çevresindeki mikroçevriciliğin dış mekanik kuvvetlere nasıl tepki verdiğini etkiler13,14. ECM ve dokuların mekanik kuvvetlere nasıl tepki verdiğini anlamak, doku mühendisliği alanında ve daha doğru hesaplamalı ve teorik modellerin geliştirilmesinde ilerleme sağlayacaktır.
Örnekleri mekanik olarak germek için en yaygın yöntemler, hücre davranışı üzerindeki etkilerini araştırmak için hücre yüklü 2B substratlara odaklanmıştır. Bunlar, örneğin, polidimetilsiloksan (PDMS) substratlarına gerinim uygulamak ve 15 , 16, 17,18,19streç yönüne göre hücre yeniden yönlendirme açılarını analiz etmektir. Yine de, doku mikroçevrimini daha yakından taklit eden bir durum olan 3D hücre gömülü hidrojellerin dış streçlere yanıtını araştıran yöntemler daha sınırlıdır. 3D germe yöntemlerine yönelik gelişmeler özel bir öneme sahiptir, çünkü hücreler 3B matrisler 20 ile karşılaştırıldığında2Bsubstratlarda farklı davranırlar. Bu davranışlar hücresel yeniden hizalama, protein ifade düzeyleri ve geçişörüntüleri 21,22,23içerir.
3D numune germe için izin veren yöntem ve cihazlar hem ticari olarak mevcut24,25,26,27,28hem de laboratuvar araştırması için geliştirilenleri içerir29. Bu yöntemler,30,çok kuyulu odalar 31, kelepçeler26 , 32, biyoreaktörler11,33,cantilevers34 , 35,36ve mıknatıslar 37,38kullanır. Bazı teknikler, örneğin jel5’tekiiki tek noktadan iğne çekerek 3D hidrojelleri yerel olarak deforme eden streç oluştururken, diğerleri jelin tüm kütlesinin deformasyonuna izin verir16. Ayrıca, bu sistemlerin çoğu X-Y düzleminde gerinim alanının analizine odaklanır ve Zyönündeki gerinim alanı hakkında sınırlı bilgi ile. Ek olarak, bu cihazlardan sadece bir avuç mikroskobik yerinde görüntüleme yeteneğine sahiptir. Yerinde yüksek büyütme görüntüleme (örneğin, konfokal mikroskop) ile temel zorluk, objektif lensten örneğe birkaç yüz mikronun sınırlı çalışma mesafesidir. Esneme sırasında canlı görüntülemeye izin veren cihazlar, Zeksenindeki gerinim homojenliğini feda eder veya nispeten karmaşıktır ve diğer laboratuvarlarda çoğaltilmesi zordur39,40.
3D hidrojelleri germe yaklaşımı, canlı konfokal mikroskopi sırasında statik veya döngüsel tek eksenli gerilme sağlar. Germe cihazı (‘Akıllı Döngüsel Tek Eksenli Sedye – SCyUS’ olarak adlandırılır) 3D baskılı parçalar ve düşük maliyetli donanım kullanılarak inşa edilir ve diğer laboratuvarlarda kolay üreme sağlar. Cihaza bağlı, merkezinde geometrik bir kesme ile piyasada bulunan bir silikon kauçuktur. Hidrojel bileşenleri, kesmeyi doldurmak için polimerize edilir. Polimerizasyon sırasında, fibrin veya kollajen gibi biyolojik hidrojeller doğal olarak kesmenin iç duvarlarına yapışır. SCyUS kullanılarak, silikon şerit, kontrollü suşları gömülü 3D hidrojel41’eaktararak, cinsel olarak gerilir.
Bu sistem, mevcut diğer yöntemlere kıyasla benzersiz bir özellik ve avantaj kombinasyonu sağlar. İlk olarak, sistem, hidrojel boyunca Z-homojen deformasyon ile çevrelerinden kalın 3D yumuşak hidrojellerin (>100 μm kalınlığında, <1 kPa sertliği) tek eksenli gerilmesine izin verir. Bu hidrojeller geleneksel çekme teknikleri ile kavranamayacak ve uzatılamayacak kadar yumuşaktır. İkincisi, 3D baskı araştırmacılar tarafından kolayca kullanılabildiğinden ve tasarımda kullanılan elektronikler düşük maliyetli olduğundan, germe cihazı diğer laboratuvarlarda kolayca çoğaltılabilir. Üçüncüsü ve belki de en çekici özelliği, silikon şeritteki geometri ve kesmenin boyutu kolayca manipüle edilebilir, bu da ayarlanabilir gerinim gradyanları ve sınır koşullarının yanı sıra birkaç mikrolitreye kadar çeşitli örnek hacimlerin kullanılmasına izin verir.
Sunulan protokol, fibrin jelinin canlı konfokal mikroskopi altında tek eksenli streçle devam eden 0,5 mm kalınlığında silikon kauçuk şeritlerde ~2 mm çapında disklere kalıplanarak çıkarılmasından oluşur. Aşağıda, geometrik kesime etkili olan suşların ölçülmesi ve analiz edilmesi için deneysel prosedürler, hidrojelde geliştirilen iç suşlar ve çeşitli esneme manipülasyonlarından sonra elde edilen lif hizalaması ayrıntılı olarak ele alınmıştır. Son olarak, hücrelerin hidrojel içine gömülmesi ve kontrollü dış streçlere maruz kalma olasılığı tartışılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan yöntem ve protokol büyük ölçüde Roitblat Riba ve ark.41 tarafından yapılan önceki çalışmamıza dayanmaktadır.
Sunulan yöntemin mevcut yaklaşımlara göre en büyük avantajları arasında çok yumuşak 3D hidrojellerin (~100 Pa’nın Elastik Modülü) çevrelerinden ve canlı konfokal görüntüleme altında zorlanma olasılığı yer almaktadır. Diğer yöntemler genellikle Zekseninde gerinim alanları uygulama …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Burada yer alan bazı rakamlar Telif Hakkı Temizleme Merkezi’nden izin alarak uyarlanmıştır: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Canlı mikroskopi görüntülemeyi mümkün kılarken 3D hidrojelleri tek tip z ekseni suşlarıyla germe, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Telif Hakkı© (2019).
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7
Materials
| Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20002 | |
| Cell Medium (DMEM High Glucose) | Biological Industries | 01-052-1A | Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate |
| Cover Slip #1.5 | Bar-Naor Ltd. | BN72204-30 | 22×40 mm |
| DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO | Sigma-Aldrich Inc. | D-5879-500 ML | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Biological Industries | 02-023-1A | |
| EVICEL Fibrin Sealant (Human) | Omrix Biopharmaceuticals | 3902 | Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL |
| Fibrinogen Buffer | N/A | Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2) | |
| Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) | Invitrogen | F8820 | Orange (540/560) Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide |
| High-Temperature Silicone Rubber | McMaster-Carr | 3788T41 | 580 µm-thick E = 1.5 Mpa Poisson Ratio = 0.48 Tensile Strength = 4.8 MPa Upper limit of stretch = +300% engineering strain |
| HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) | GE Healthcare | 17-1408-01 | |
| HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | HIVAC-G 100 | |
| ImageJ FIJI software39 | National Institute of Health, Bethesda, MD | Version 1.8.0_112 | |
| Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) | Arduino/Adafruit | Arduino-DK001/Adafruit-1438 | |
| MicroVL 21R Centrifuge | Thermo Scientific | 75002470 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Primovert Light Microscope | Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. | 491206-0011-000 | |
| SCyUS CAD (Solidworks) | Dassault Systèmes | N/A | |
| SCyUS Code37 | N/A | N/A | |
| Servomotor – TowerPro SG-5010 | Adafruit | 155 | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | For 50 mL tubes |
| Sterile 10 cm non-culture plates | Corning | 430167 | |
| Thrombin buffer | N/A | Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0) | |
| Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries | 03-052-1B | |
| USB Cable (Type B Male to Type A Male) | N/A | N/A | |
| Zeiss LSM 880 Confocal Microscope | Carl Zeiss AG | 2811000417 | |
| ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) | Carl Zeiss AG | Release Version 14.0.0.0 |
References
- Bleuel, J., Zaucke, V., Bruggemann, G. P., Niehoff, A. Effects of cyclic tensile strain on chondrocyte metabolism: a systematic review. PLoS ONE. 10, 0119816 (2015).
- Pennisi, C. P., Olesen, C. G., de Zee, M., Rasmussen, J., Zachar, V. Uniaxial cyclic strain drives assembly and differentiation of skeletal myocytes. Tissue Engineering Part A. 17, 2543-2550 (2011).
- Grodzinsky, A. J., Levenston, M. E., Jin, M., Frank, E. H. Cartilage Tissue Remodeling in Response to Mechanical Forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2 (1), 691-713 (2000).
- Munster, S., et al. Strain history dependence of the nonlinear stress response of fibrin and collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110, 12197-12202 (2013).
- Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS ONE. 4, 5902 (2009).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 377-383 (2002).
- Natan, S., Koren, Y., Shelah, O., Goren, S., Lesman, A. . Molecular Biology of the Cell. 31 (14), 1474-1485 (2020).
- Ban, E., et al. Mechanisms of Plastic Deformation in Collagen Networks Induced by Cellular Forces. Biophysical Journal. 114 (2), 450-461 (2018).
- Kim, J., et al. Stress-induced plasticity of dynamic collagen networks. Nature Communications. 8, 842 (2017).
- Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. Nonlinear elasticity in biological gels. Nature. 435, 191-194 (2005).
- Wen, Q., Basu, A., Janmey, P. A., Yodh, A. G. Non-affine deformations in polymer hydrogels. Soft Matter. 8, 8039-8049 (2012).
- Muiznieks, L. D., Keeley, F. W. Molecular assembly and mechanical properties of the extracellular matrix: A fibrous protein perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1832, 866-875 (2012).
- Brown, A. E. X., Litvinov, R. I., Discher, D. E., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Multiscale mechanics of fibrin polymer: gel stretching with protein unfolding and loss of water. Science. 325, 741-744 (2009).
- Carroll, S. F., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Cyclic tensile strain can play a role in directing both intramembranous and endochondral ossification of mesenchymal stem cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 73 (2017).
- Livne, A., Bouchbinder, E., Geiger, B. Cell reorientation under cyclic stretching. Nature Communications. 5, 3938 (2014).
- Wang, L., et al. Patterning cellular alignment through stretching hydrogels with programmable strain gradients. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 15088-15097 (2015).
- Xu, G. K., Feng, X. Q., Gao, H. Orientations of Cells on Compliant Substrates under Biaxial Stretches: A Theoretical Study. Biophysical Journal. 114 (3), 701-710 (2017).
- Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2013).
- Lu, J., et al. Cell orientation gradients on an inverse opal substrate. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (19), 10091-10095 (2015).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
- Bono, N., et al. Unraveling the role of mechanical stimulation on smooth muscle cells: a comparative study between 2D and 3D models. Biotechnology and Bioengineering. 113, 2254-2263 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
- Riehl, B. D., Park, J. H., Kwon, I. K., Lim, J. Y. Mechanical stretching for tissue engineering: two-dimensional and three-dimensional constructs. Tissue Engineering Part B: Reviews. 18, 288-300 (2012).
- Flexcell. Linear Tissue Train Culture Plate. Flexcell. , (2019).
- Flexcell. Tissue Train. Flexcell. , (2019).
- CellScale. MCT6 Stretcher. CellScale. , (2019).
- STREX. STB-150. STREX. , (2019).
- STREX. Stretch Chambers. STREX. , (2019).
- Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab on a Chip. 16, 3193-3203 (2016).
- Weidenhamer, N. K., Tranquillo, R. T. Influence of cyclic mechanical stretch and tissue constraints on cellular and collagen alignment in fibroblast-derived cell sheets. Tissue Engineering Part C: Methods. 19, 386-395 (2013).
- Yung, Y. C., Vandenburgh, H., Mooney, D. J. Cellular strain assessment tool (CSAT): precision-controlled cyclic uniaxial tensile loading. Journal of Biomechanics. 42, 178-182 (2009).
- Chen, K., et al. Role of boundary conditions in determining cell alignment in response to stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 115, 986-991 (2018).
- Heher, P., et al. A novel bioreactor for the generation of highly aligned 3D skeletal muscle-like constructs through orientation of fibrin via application of static strain. Acta Biomaterialia. 24, 251-265 (2015).
- Foolen, J., Deshpande, V. S., Kanters, F. M. W., Baaijens, F. P. T. The influence of matrix integrity on stress-fiber remodeling in 3D. Biomaterials. 33, 7508-7518 (2012).
- Walker, M., Godin, M., Pelling, A. E. A vacuum-actuated microtissue stretcher for long-term exposure to oscillatory strain within a 3D matrix. Biomedical Microdevices. 20, 43 (2018).
- Zhao, R. G., Boudou, T., Wang, W. G., Chen, C. S., Reich, D. H. Decoupling cell and matrix mechanics in engineered microtissues using magnetically actuated microcantilevers. Advanced Materials. 25, 1699-1705 (2013).
- Li, Y. H., et al. Magnetically actuated cell-laden micro-scale hydrogels for probing strain-induced cell responses in three dimensions. NPG Asia Materials. 8, 238 (2016).
- Li, Y. H., et al. An approach to quantifying 3D responses of cells to extreme strain. Scientific Reports. 6, 19550 (2016).
- Humphrey, J. D., et al. A theoretically-motivated biaxial tissue culture system with intravital microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 7, 323-334 (2008).
- Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 107, 3335-3339 (2010).
- Roitblat Riba, A., et al. Straining 3D hydrogels with uniform z-axis strains while enabling live microscopy imaging. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
- Gomez, D., Natan, S., Shokef, Y., Lesman, A. Mechanical interaction between cells facilitates molecular transport. Advanced Biosystems. 3 (12), 1900192 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open- source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- EPFL Switzerland. OrientationJ plug in. EPFL Switzerland. , (2019).
- Goren, S., Koren, Y., Xu, X., Lesman, A. Elastic anisotropy governs the decay of cell-induced displacements. Biophysical Journal. 118 (5), 1152-1164 (2019).
- Notbohm, J., Lesman, A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Quantifying cell-induced matrix deformation in three dimensions based on imaging matrix fibers. Integrative Biology. 7 (10), 1186-1195 (2015).
- Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. Journal of Cell Biology. 205 (2), 155-162 (2014).
- Cha, C. Y., et al. Tailoring Hydrogel Adhesion to Polydimethylsiloxane Substrates Using Polysaccharide Glue. Angewandte Chemie International Edition. 52, 6949-6952 (2019).
- Wirthl, D., et al. Instant tough bonding of hydrogels for soft machines and electronics. Science Advances. 3, (2017).
- Juarez-Moreno, J. A., Avila-Ortega, A., Oliva, A. I., Aviles, F., Cauich-Rodriguez, J. V. Effect of wettability and surface roughness on the adhesion properties of collagen on PDMS films treated by capacitively coupled oxygen plasma. Applied Surface Science. 349, 763-773 (2015).
- Kim, H. T., Jeong, O. C. PDMS surface modification using atmospheric pressure plasma. Microelectronic Engineering. 88, 2281-2285 (2011).
- Prasad, B. R., et al. Controlling cellular activity by manipulating silicone surface roughness. Colloids and Surfaces. 78, 237-242 (2010).
