제시된 방법은 실리콘 고무에 내장된 3D 소프트 하이드로겔의 단종 스트레칭을 포함하면서 살아있는 공초점 현미경 검사를 허용합니다. 섬유 정렬뿐만 아니라 외부 및 내부 하이드로겔 균주의 특성화가 입증된다. 개발된 장치 및 프로토콜은 다양한 변형 정권에 대한 세포의 반응을 평가할 수 있다.
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이 논문에서
요약
초록
외부 힘은 조직 형성, 발달 및 유지 보수에 중요한 요소입니다. 이러한 힘의 효과 종종 시험 관 스트레칭 방법을 전문 사용 하 여 공부. 다양한 사용 가능한 시스템은 2D 기판 기반 들것을 사용하는 반면, 3D 기술의 접근성은 부드러운 하이드로겔을 변형시키는 데 더 제한적입니다. 여기서는 탄성 실리콘 스트립을 샘플 캐리어로 사용하여 둘레에서 부드러운 하이드로겔의 외부 스트레칭을 허용하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에 활용되는 스트레칭 시스템은 3D 인쇄 부품과 저비용 전자 장치로 구성되므로 다른 실험실에서 간단하고 쉽게 복제할 수 있습니다. 실험 공정은 실리콘 스트립의 중앙에 컷아웃에서 두꺼운(>100 μm) 소프트 피브린 하이드로겔(탄성 계수 ~100Pa)을 중합하는 것으로 시작됩니다. 그런 다음 실리콘 겔 구조는 인쇄 된 스트레칭 장치에 부착되고 공초점 현미경 단계에 배치됩니다. 살아있는 현미경 검사에서 스트레칭 장치가 활성화되고 겔은 다양한 스트레치 크기로 이미지됩니다. 영상 처리는 젤의 3D 두께(Z-축)에 걸쳐 상대적으로 균일한 균질균및 섬유 정렬을입증하여 생성된 겔 변형을 정량화하는 데 사용됩니다. 이 방법의 장점은 시투 현미경 검사법에서 실행하는 동안 3D에서 매우 부드러운 하이드로겔을 변형시키는 능력과 사용자의 요구에 따라 샘플의 형상 및 크기를 조작 할 수있는 자유를 포함한다. 또한, 적절한 적응을 통해, 이 방법은 다른 유형의 하이드로겔(예를 들어, 콜라겐, 폴리아크릴라미드 또는 폴리에틸렌 글리콜)을 스트레칭하는 데 사용될 수 있으며, 더 많은 생체 모방 3D 조건 하에서 외부 력에 대한 세포 및 조직 반응의 분석을 허용할 수 있다.
서론
기계적 힘에 대한 조직 반응은 유전자 발현1,세포 분화2및 조직 리모델링3을포함하는 광범위한 생물학적 기능의 필수적인 부분이다. 더욱이, 섬유 정렬 및 밀도와 같은 세포외 매트릭스(ECM)의 강제 유도 된 변화는 세포 거동 및 조직형성에영향을 미칠 수 있습니다4,5,6. ECM의 섬유질 메쉬 구조는 비선형 탄성, 비미세 변형 및 플라스틱 변형7,8,9,10,11,12와같은 흥미로운 기계적 특성을 갖는다. 이러한 특성은 세포와 주변 미세 환경이 외부 기계적힘(13,14)에
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프로토콜
1. 솔루션 준비 (사전에 수행 될)
- 피브리노겐 라벨링
참고: 피브린 젤의 변형을 분석하는 경우에만 라벨링 단계가 필요합니다. 세포 실험의 경우 라벨이 없는 젤을 사용할 수 있습니다.- 10 mg/mL succinimidyl 에스테르 형광 염료 (DMSO에 용해)의 38 μL을 50 mL 원심분리기 튜브에 15 mg /mL 피브리노겐 용액 (5:1의 어금니 비율)의 1.5 mL에 추가하고 실온에서 1 시간 동안 셰이커에 놓습니다. 그 후, 800 x g (실온)에서 3 분 동안 원심분리기에 튜브를 놓습니다.
- 이 단계를 수행하여 미반응염염을 분리하기 위해 덱스텐 겔 수지(재료표)로 포장된 탈염 컬럼을 통해 이전 단계로부터 상체를 필터링한다.
- 25mL의 피브리노겐 버퍼로 컬럼을 미리 세척합니다.
- 1.1.1 단계에서 라벨이 부착된 피브리노겐을 컬럼에 천천히 주입하여 필터에 거품이 들어오지 않도록 합니다. 용액의 첫 번째 ~0.3 mL (희미한 색깔의 액체 4-6 방울)를 폐기하십시오. 그런 다음 정제 된 솔루션의 다음 1.0-1.5 mL을 수집합니다 (자세한 내용은 제조업체의 프로토콜을 따르십시오).
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결과
1 μm 형광 구슬이 내장된 3D 피브린 하이드로겔을 운반하는 실리콘 스트립에 가해지는 증가 크기의 정적 스트레치로부터의 대표적인 데이터가 도 9에도시된다. 이 분석은 실리콘 스트레치가 절단의 기하학적 변화뿐만 아니라 젤 내의 개발 된 균주에 미치는 영향을 보여줍니다. 전체 젤의 Z-스택이미지는 타원형형상(도 9A)에컷아웃된 원래 원의 변형을 평가하는 데 사용된다. 이러한 이미지는 ε xx(구멍)(방정식 2)를계산하는 데 사용됩니다. 겔 스트레칭 동안 여러 비드 골재(도9B)를확대 및 수동으로 추적하여, 축 ε xx(gel)및 수직 εyy(gel)방향(도9
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토론
본 원에 제시된 방법 및 프로토콜은 주로 Roitblat Riba 외.41에 의한 이전 연구를 기반으로 하며, 여기에 SCyUS 장치의 전체 컴퓨터 지원 설계(CAD), 파이썬 및 마이크로 컨트롤러 코드를 포함합니다.
기존 접근법에 비해 제시된 방법의 주요 장점은 매우 부드러운 3D 하이드로겔(+100 Pa의 탄성 계수)을 둘레에서, 그리고 살아있는 공초점 이미징하에서 변형할 가능성을 포함한다. 다른 방법은 일반적으로 Z축에서 변형 필드를 적용하는 능력이 제한되며 주로 샘플에서 객관적렌즈에 이르는 작업 거리 제한으로 인해 스트레칭하는 동안 현장에서 높은 배율 현미경 이미지를 제공할 수 없습니다. 대부분의 사용 가능한 시스템은 생리 조직 환경을 모방하는 데 제한된 2D 기판 스트레칭을 기반으로합니다.
시스템의 한계는 젤 포스트 폴리머화(도
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
여기에 포함 된 일부 수치는 저작권 허가 센터의 허가에 의해 적응되었습니다 : 스프링어 자연, 생물 의학 공학의 연보. 라이브 현미경 이미징을 가능하게하면서 균일 한 z 축 균주를 가진 3D 하이드로겔을 긴장, A. Roitblat 리바, S. 나탄, A. 콜렐, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, 저작권© (2019).
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 546 카르복실산, 숙시니미딜 에스테르 | Invitrogen | A20002 | |
| 세포 배지(DMEM 고포도당) | 생물학 산업 | 01-052-1A | 10% FBS, 1% PNS, 1% L-글루타민, 1% 피루브산 나트륨 |
| 추가 커버 슬립 #1.5 | Bar-Naor Ltd. | BN72204-30 | 22× 40 < >mm< / em> |
| 디메틸 설폭 사이드 99.5 % GC DMSO | 시그마 - Aldrich Inc. | D-5879-500 ML | |
| Dulbecco의 인산염 완충 식염 | 생물학 산업 | 02-023-1A | |
| EVICEL 피브린 실란트(인간) | Omrix Biopharmaceuticals | 3902 | 피브리노겐: 70mg/mL, 트롬빈: 800-1200 IU/mL |
| 피브리노겐 완충액 | N/A | 1L 레시피 : NaCl 7g, 구연산 삼나트륨 2.94g, 글리신 9g, 아르기닌 염산염 20g & 0.15g 염화칼슘 이수화물. PuW (pH 7.0-7.2) | |
| 형광 마이크로 비즈 FluoSpheres (1 µ m) | Invitrogen | F8820 | 오렌지 (540/560) 물에 현탁액(2% 고체)으로 제공되고 2mM 아지드화나트륨 |
| 고온 실리콘 고무 | McMaster-Carr | 3788T41 | 580 µ m-두께 E = 1.5 Mpa 푸아송 비율 = 0.48 인장 강도 = 4.8 MPa 스트레치 상한 = +300% 엔지니어링 변형 |
| HiTrap 탈염 컬럼 5 mL(Sephadex G-25 포장) | GE Healthcare | 17-1408-01 | |
| HIVAC-G 고진공 밀봉 컴파운드 | Shin-Etsu Chemical Co., 주식 회사. | HIVAC-G 100 | |
| ImageJ FIJI 소프트웨어39 | National Institute of Health, Bethesda, MD | 버전 1.8.0_112 | |
| 마이크로컨트롤러(Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) | Arduino/ | Adafruit Arduino-DK001/Adafruit-1438 | |
| MicroVL 21R 원심분리기 | Thermo Scientific | 75002470 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Primovert 광학 현미경 | Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. | 491206-0011-000 | |
| SCyUS CAD (Solidworks) | Dassault Systè mes | N/A | |
| SCyUS 코드37 | N/A | N/A | |
| 서보 모터 - TowerPro SG-5010 | Adafruit | 155 | |
| SL 16R 원심분리기 | Thermo Scientific | 75004030 | 50 mL 튜브용 |
| 멸균 10 cm 비배양 플레이트 | Corning | 430167 | |
| 트롬빈 완충제 | N/A | 레시피: 만니톨 20g, NaCl 8.77g, 아세트산 나트륨 삼수화물 2.72g, 24mL 25% 인간 혈청 알부민, 염화칼슘 5.88g. PuW(pH 7.0) | |
| Trypsin EDTA 용액 B(0.25%), EDTA(0.05%) | Biological Industries | 03-052-1B | |
| USB 케이블(B형 남성-A형 남성) | N/A | N/A | |
| Zeiss LSM 880 컨포칼 현미경 | Carl Zeiss AG | 2811000417 | |
| ZEN 2.3 SP1 FP3(검정색) | Carl Zeiss AG | 릴리스 버전 14.0.0.0 |
참고문헌
- Bleuel, J., Zaucke, V., Bruggemann, G. P., Niehoff, A. Effects of cyclic tensile strain on chondrocyte metabolism: a systematic review. PLoS ONE. 10, 0119816(2015).
- Pennisi, C. P., Olesen, C. G., de Zee, M., Rasmussen, J., Zachar, V. Uniaxial cycli....
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