Un metodo minimamente invasivo per l'instillazione intratracheale di farmaci nei roditori neonatali per il trattamento delle malattie polmonari

Summary

Questa tecnica di instillare farmaci direttamente nella trachea dei roditori neonatali è importante per studiare l’impatto di farmaci o biologici somministrati localmente sulle malattie polmonari neonatali. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato anche per indurre lesioni polmonari in modelli animali.

Abstract

Il trattamento del roditore neonatale con farmaci instillati direttamente nella trachea potrebbe servire come strumento prezioso per studiare l’impatto di un farmaco somministrato localmente. Questo ha un impatto traslazionale diretto perché tensioattivi e farmaci vengono somministrati localmente nei polmoni. Sebbene la letteratura abbia molte pubblicazioni che descrivono l’intubazione transorale minimamente invasiva di topi e ratti adulti in esperimenti terapeutici, questo approccio nei cuccioli di ratto neonatale è carente. Le piccole dimensioni della regione orotracheale / faringe nei cuccioli rendono difficile la visualizzazione del lume laringeo (corde vocali), contribuendo al tasso di successo variabile della somministrazione intratracheale del farmaco. Con la presente dimostriamo un’efficace intubazione orale del cucciolo di ratto neonatale – una tecnica non traumatica e minimamente invasiva, in modo che possa essere utilizzata per la somministrazione seriale di farmaci. Abbiamo usato un otoscopio operativo con un sistema di illuminazione e una lente d’ingrandimento per visualizzare l’apertura tracheale dei neonati di ratto. Il farmaco viene quindi instillato utilizzando una siringa da 1 mL collegata a una punta della pipetta. L’accuratezza del metodo di consegna è stata dimostrata utilizzando la somministrazione di colorante blu Evans. Questo metodo è facile da addestrare e potrebbe servire come un modo efficace per instillare farmaci nella trachea. Questo metodo potrebbe anche essere utilizzato per la somministrazione di inoculo o agenti per simulare le condizioni di malattia negli animali e, inoltre, per strategie di trattamento basate su cellule per varie malattie polmonari.

Introduction

I neonati nati prematuramente hanno polmoni poco sviluppati che richiedono molte terapie interventistiche come la ventilazione a lungo termine. Questi interventi pongono i neonati sopravvissuti ad alto rischio di sequele^{successive 1}. I modelli animali sperimentali servono come strumento importante per simulare varie condizioni di malattia, studiare la patobiologia delle malattie e valutare gli interventi terapeutici. Anche se è disponibile una vasta gamma di modelli animali da topi, ratti e conigli ad agnelli e maiali pretermine, topi e ratti sono i più utilizzati.

Il vantaggio principale dell’utilizzo di topi e ratti è il periodo di gestazione relativamente breve e il costo ridotto. Sono anche facilmente reperibili, facili da mantenere in ambienti indenni da malattie, geneticamente omogenei e hanno relativamente meno preoccupazione etica ^2,3. Un altro grande vantaggio del modello di roditore è che alla nascita il cucciolo neonatale si trova in fase canalicolare tardiva / sacculare precoce dello sviluppo polmonare, che è morfologicamente equivalente al polmone di un neonato umano pretermine di 24 settimane che sviluppa la displasia broncopolmonare⁴. Inoltre, poiché il loro sviluppo polmonare progredisce rapidamente verso il completamento entro le prime 4 settimane di vita, è possibile studiare la maturazione polmonare post-natale in un lasso di tempo ragionevole⁴. Nonostante questi vantaggi, le piccole dimensioni dei topi e dei cuccioli di ratto sono fonte di preoccupazione per vari interventi, che costringono la maggior parte dei ricercatori a utilizzare animali adulti piuttosto che cuccioli⁵. I polmoni neonatali sono in una fase di sviluppo e la risposta di un neonato a un agente di incitamento differisce da quella di un adulto. Ciò rende appropriato l’uso di modelli animali neonatali per studiare le condizioni della malattia neonatale umana.

Esistono diversi metodi per somministrare farmaci / agenti biologici al polmone. Ciò include l’instillazione intranasale ^6,7 o intratracheale ^8,9,10 e l’inalazione di aerosol ^11,12. Ogni approccio ha le sue sfide tecniche, i suoi vantaggi e i suoi limiti¹³. La via intratracheale di somministrazione degli agenti terapeutici è preferita per studiare l’impatto terapeutico diretto nell’organo bypassando gli effetti sistemici. Questa via potrebbe anche essere utilizzata per studiare la patologia polmonare causata da agenti incitanti. Ci sono sia tecniche invasive che minimamente invasive per farlo ed è facile da eseguire negli adulti. Tuttavia, nei cuccioli, a causa delle piccole dimensioni dell’animale, ci sono sfide tecniche associate al processo di intubazione. Il presente studio presenta un metodo di instillazione intratracheale (ITI) semplice, coerente e non chirurgico nei cuccioli di ratto che potrebbe essere utilizzato per studiare l’efficacia di vari interventi terapeutici neonatali e per generare modelli animali che simulano le malattie respiratorie neonatali.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (protocollo # 2020-0035) presso la Case Western Reserve University. Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida NIH per la cura e l’uso di animali da laboratorio. 1. Animali Ottenere commercialmente ratti Sprague Dawley gravidi. Mantenere gli animali in una struttura veterinaria riconosciuta con ciclo luce-buio di 14 ore / 10 ore e umidità relativa del 45…

Representative Results

L’instillazione del blu di Evans ha rivelato una distribuzione multifocale del colorante che coinvolge tutti i lobi polmonari (Figura 4A,B). Il nostro risultato, come mostrato nella Figura 4, dimostra l’efficacia della distribuzione a tutti i lobi. La foto viene scattata immediatamente dopo l’ITI del colorante nella trachea. L’efficacia al 100% è stata raggiunta instillando il colorante nella trachea seguita dalla sua diffusione in tutti i lobi…

Discussion

L’instillazione intratracheale è un metodo eccellente che offre diversi vantaggi rispetto ai metodi esistenti per gli interventi sulle malattie respiratorie e lo sviluppo di modelli di malattia. È un metodo rapido e con esperienza, può essere eseguito con una velocità media di 2-3 minuti per animale. Le considerazioni chiave per un’intubazione di successo sono la corretta sedazione dell’animale, il suo corretto posizionamento, in particolare la testa, così come l’accurata profondità di posizionamento / dimensione d…

Materials

Evans Blue dye	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	314-13-6	Confirmation of drug administration into lungs
Ketamine Hydrochloride	Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA	Dispensed from Animal care facility	For sedation
Operating Otoscope	Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA	21770- 3.5V	For visualization of vocal cords
Otoscope Rechargeable Handle	Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA	71050-C
Pipette tip (Gel loading)	Fisherbrand	02-707-139	Administering the drug
Platform for restraining (inclined plane)	Animal care facility	Dispensed from Animal care facility	Wired roof of mice cage can be used
3M Micropore Surgical White Paper (sticking tape)	3M, St. Paul, MN, USA	1530-2
Luer Lock SyringeSyringes (1 ml)	BD Franklin Lakes, NJ , USA	NBD2515	Administering the drug
Xylazine	Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA		For sedation