Summary
Isolering av celler från dissekerade implantat och deras karakterisering genom flödescytometri kan avsevärt bidra till att förstå mönstret av immunsvar mot implantat. Denna artikel beskriver en exakt metod för isolering av celler från dissekerade implantat och deras färgning för flödescytometrisk analys.
Abstract
Framgången med att implantera laboratorieodlad vävnad eller en medicinteknisk produkt i en individ är beroende av immunsvaret hos den mottagande värden. Om man betraktar ett implantat som en främmande kropp kan ett fientligt och oreglerat immunsvar leda till att implantatet avvisas, medan ett reglerat svar och återfående av homeostas kan leda till att det accepteras. Att analysera mikromiljöerna hos implantat som dissekerats under in vivo- eller ex vivo-miljöer kan hjälpa till att förstå mönstret för immunsvar, vilket i slutändan kan hjälpa till att utveckla nya generationer av biomaterial. Flödescytometri är en välkänd teknik för att karakterisera immunceller och deras undergrupper baserat på deras cellytemarkörer. Denna granskning beskriver ett protokoll baserat på manuell tärning, enzymatisk matsmältning och filtrering genom en cellsil för isolering av enhetliga cellsuspensioner från dissekerad implantatvävnad. Vidare har ett flerfärgat flödescytometrifärgningsprotokoll förklarats, tillsammans med steg för initiala cytometerinställningar för att karakterisera och kvantifiera dessa isolerade celler genom flödescytometri.
Introduction
Framsteg inom det medicinska området har lett till frekvent användning av implanterade material för att stödja funktionen eller återväxten av skadad vävnad 1,2. Dessa inkluderar enheter som pacemakers, rekonstruktiva kosmetiska implantat och ortopediska plattor som används för fixering av benfrakturer 3,4. Materialen som används för att tillverka dessa implantat och de platser där de implanteras spelar dock viktiga roller för att avgöra framgången för dessa implantat 5,6,7. Som främmande kroppar kan dessa implantat generera ett immunsvar från värden som antingen kan leda till avstötning eller tolerans8. Denna faktor har drivit biomaterialforskningen för att generera material som kan attrahera det önskade immunsvaret efter implantation 9,10,11,12.
Immunsvaret är ett väsentligt krav inom regenerativ medicin, där en vävnad eller ett organ odlas runt ett skelett av biomaterial (byggnadsställning) i ett laboratorium för ersättning av en skadad vävnad eller ett skadat organ13,14,15,16. Inom regenerativ medicin är målet att ersätta saknad eller skadad vävnad genom användning av celler, signaler och byggnadsställningar, som var och en i hög grad kan moduleras av immunsvar. Dessutom, även när en brist på immunsvar är önskvärd, är det mycket sällan en frånvaro av immunaktivitet snarare än närvaron av en regulatorisk profil som är önskvärd18. Tekniker som flödescytometri kan spela en viktig roll för att karakterisera mönstret för immunsvar mot olika biomaterial som används för att belägga implantat eller för att utveckla strukturer för vävnadsteknik19.
Denna information kommer i sin tur i slutändan att hjälpa till att utveckla biomaterial för implantat som kan tolereras väl av immunsystemet eller att utveckla strukturer som kan spela en konstruktiv roll i vävnadsteknik. Korrekt förberedelse av prover för analys med flödescytometri är ett viktigt steg för att undvika felaktiga resultat i immunkarakterisering via fluorescensaktiverad cellsortering20,21. Därför presenterar denna översikt en detaljerad metodik som kan användas för isolering av celler från byggnadsställningsvävnad, färgning av cellsuspensionen och analys genom flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Figur 1 ger en överview av flödescytometriprotokollet.
1) Beredning av reagens
- Bered media för utspädning av enzymer och för vävnadsodling.
- Tillsätt 5 ml buffertlösning av 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) till 500 ml RPMI-medium och skaka väl. Förvara mediet vid 4 °C tills du använder det igen.
- Beräkna enzymlösningens volym.
OBS: Volymen av enzymlösningen är volymen av mediet som innehåller enzymerna (kollagenas och DNas I) som kommer att behövas för att smälta tärnad vävnad i 6-brunnsplattor; Det beror på antalet prover.- Använd följande ekvation för att beräkna den volym som krävs:
(Antal prover som ska rötas) × 5 ml serumfri RPMI med 10 mM HEPES-buffert
OBS: Till exempelample, för 0.1 till 0.3 g dissekerad mjälte, använd 5 ml medium för att bereda enzymlösningen. Det enzymatiska matsmältningsprotokollet som beskrivs i detta manuskript är främst för mjuka vävnader (från 0,1 till 1 g) dissekerade från möss som inkluderar hjärna, njure, hud, lever, lungor, mjälte, muskler, samt kapslar runt subkutana implantat gjorda av syntetiska material eller extracellulära matrixproteiner. Att smälta hårda broskvävnader kan kräva olika förhållanden och volymer av matsmältningsenzymer, vilket endast kan fastställas genom optimering. - Beräkna mängden kollagenas och DNas som jag behövde för enzymlösningen.
OBS: I detta protokoll användes 0,25 mg/ml kollagenas och 0,2 mg/ml DNas I. De arbetskoncentrationer som krävs för kollagenas och DNas kan variera för olika typer av vävnader19.
- Använd följande ekvation för att beräkna den volym som krävs:
- Bered en 1:1000 viabilitetsfärglösning genom att tillsätta 1 μL viabilitetsfärgämne (se Materialtabell) till 999 μL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och virvla lösningen. Förvara lösningen mörkt vid 4 °C tills vidare användning.
- Bered färgningsbufferten genom att tillsätta 1 g bovint serumalbumin (BSA) till 100 ml PBS och virvla lösningen tills BSA är helt upplöst. Förvara lösningen vid 4 °C tills vidare användning.
2) Uppsättning av enzymatiska rötningsplattor
- Sätt upp en 6-hålsplatta med 70 μm cellsilar i varje brunn. Tillsätt 3 ml av det beredda mediet från steg 1.1.1 i varje brunn och inkubera på is.
- Förvara resterande medier (2 ml/brunn) i en inkubator eller ett vattenbad vid 37 °C för att suspendera den beräknade mängden kollagenas och DNas I (steg 1.2.2).
3) Isolering av celler
- Placera de dissekerade implantaten/vävnaden i plattor och tärna fint med en sax. Alternativt kan du använda en mekanisk störningsmetod med hjälp av en vävnadsdissociator eller handhållen homogenisator. På grund av det höga antalet leukocyter, dissekera mjälten för att använda som färgningskontroll i varje körning.
OBS: Eftersom vissa material inducerar högre nivåer av fibros, är detta protokoll tillämpligt för både mycket fibrotiska och minimalt fibrotiska material. Varje bearbetningsmetod bör dock utvärderas med avseende på både cellutbyte och livskraft efter matsmältning före färgning. Undvik perifer blodkontaminering under dissektion. - Tillsätt kollagenas och DNas I (volym beräknad i steg 1.2.2) till återstående varvtal (2 ml) som har värmts upp till 37 °C. Tillsätt 2 ml av den kompletta enzymlösningen till varje brunn.
- Placera plattorna i en inkuberad skakapparat i 45 minuter vid 37 °C och 100 varv per minut.
OBS: Var försiktig när du staplar plattor eftersom detta kan hämma korrekt värmeöverföring. - Under tiden förbereder du en upphängningsdispenseringsspets genom att hugga 3-4 mm från änden av en 1000 μL spets med en sax. Efter inkubationen, pipettera suspensionen i brunnarna upp och ner för att blanda den ordentligt med den hackade spetsen. Placera cellsilen på toppen av ett 50 ml koniskt rör och för den upplösta lösningen genom cellsilen.
OBS: Cellsilen på 70 μm är tillräcklig för att separera celler från implanterat biomaterial, såsom alginat. Om större renhet krävs, använd processer som densitetsgradientseparation för att få en berikad population av leukocyter. - Skölj brunnarna med 1x PBS-lösning och överför sköljvolymen genom silen, följt av att tillsätta silens tvättar med 1x PBS-lösning tills volymen i röret når 50 ml.
OBS: 1x PBS måste vara vid rumstemperatur för att förhindra ökning av viskositeten i rötan och för att tillåta cellpelletering under centrifugering. - Centrifugera röret vid 300 × g i 5 minuter i rumstemperatur. Efter centrifugeringen aspirerar supernatanten försiktigt med en serologisk pipett utan att störa pelleten. Återsuspendera pelleten i 1000 μL 1x PBS och överför suspensionen till ett mikrocentrifugrör.
- Blanda 10 μl av cellsuspensionen med 10 μl trypanblått och fyll suspensionen på räknekammarglas för att räkna celler med hjälp av en automatisk cellräknare eller på en hemocytometer för att räkna med konventionell metod i mikroskop. Alternativt kan du använda cellräkningspärlor med flödescytometri.
4) Färgning för flödescytometri
- Se figur 2 för ett exempel på plattlayout för ett experiment med 14 färger med 45 prover, fluorescens minus en (FMO) kontroller, kompensationskontroller och en helt färgad mjältprovkontroll. Efter att ha uppskattat det totala antalet celler, beräkna volymen av cellsuspensionen som krävs för färgning av 1 × 10 6 celler för varje prov och 0,5 × 106 celler för varje kompensation och FMO-kontroll. Fördela erforderlig volym av cellsuspensionen i brunnarna på en V-bottenplatta med 96 brunnar och fyll på volymen till 100 μL med 1x PBS.
OBS: Som ett exempel, om 1000 μL cellsuspension erhållen vid steg 3.6 innehåller 40 × 10 6 celler, kommer för 1 × 10 6 celler, 1000/40 × 106 = 25 μL cellsuspension att krävas. - Centrifugera plattan vid 300 × g i 5 minuter vid 4 °C, aspirera supernatanten och återsuspendera sedan cellerna i provbrunnarna och i en kompensationskontrollbrunn för att bestämma viabiliteten, med 100 μL av en 1:1000-lösning av viabilitetsfärgämnet (se materialtabell).
- För celler i de andra kompensationsbrunnarna samt FMO och ofärgade brunnar, återsuspendera dem med 100 μL 1x PBS.
- Inkubera cellerna i mörker i 30 minuter vid 4 °C.
- Under tiden bereds en ytantikroppscocktail för färgning av provet och FMO-kontroller: 50 μL per prov eller FMO. Se tabell 1 för ett exempel på antikroppscocktailen.
- Efter inkubationen tillsätts 100 μl 1x PBS till varje brunn, centrifugera ned vid 300 × g i 5 minuter vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera i 200 μL färgningsbuffert (1x PBS + 1% BSA); centrifugera vid 300 × g i 5 minuter vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i kompensations-, FMO- och ofärgade brunnar med 50 μL 1x PBS. Tillsätt 50 μl av antikroppscocktailen till respektive provbrunn och FMO-brunn. Tillsätt respektive antikroppar till de olika kompensationsbrunnarna.
- Inkubera plattan i 45 minuter i mörker vid 4 °C. Efter inkubationen tillsätts 150 μl färgningsbuffert i varje brunn och cellsuspensionen centrifugeras vid 300 × g i 5 minuter vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten, återsuspendera cellerna med 200 μl färgningsbuffert och centrifugera cellsuspensionen vid 300 × g i 5 minuter vid 4 °C.
- Om du analyserar prover utan fixering, suspendera dem igen i 200 μL färgningsbuffert och fortsätt till avsnitt 6 om cytometerinställning och provanalys. Om du fixerar cellerna, aspirera supernatanten efter tvätt och tillsätt 100 μL av ett fixeringsmedel såsom 4 % paraformaldehyd. Om färgning för intracellulära markörer, fortsätt till avsnitt 5 om intracellulär färgning och fixera och permeabilisera cellerna (se materialförteckning). Inkubera cellerna i 20 minuter i mörker vid 4 °C.
OBS: Eftersom fixering kan påverka fluorescensintensiteten hos vissa fluoroforer, utvärdera varje panel både med och utan fixering. - Efter inkubationen tillsätts 100 μl 1x PBS, följt av centrifugering vid 300 × g i 5 minuter vid 4 °C. Aspirera supernatanten, återsuspendera i 1x PBS och centrifugera vid 300 × g i 5 minuter vid 4 °C.
- Blanda cellerna på nytt i 200 μl färgningsbuffert och förvara vid 4 °C före flödescytometrisk analys.
5) Intracellulär färgning
- Fortsätt från steg 4.11 för fixering och permeabilisering för intracellulära markörer, tillsätt 100 μL av lämplig buffert. Centrifugera cellerna vid 350 × g i 5 minuter vid 4 °C. Aspirera supernatanten och suspendera pelletsen på nytt i 200 μl av lösningen med fixeringspermeabiliseringsmedel. Centrifugera cellerna vid 350 × g i 5 minuter vid 4 °C. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelletsen med intracellulära antikroppar utspädda i lämplig buffert.
OBS: Antikroppstyper och utspädningar beror på målcellerna. Till exempel är en vanlig intracellulär markör gaffelhuvud P3 för regulatoriska T-celler, som ofta används vid en utspädning på 1:100. - Inkubera cellsuspensionen i mörker i 45 minuter vid 4 °C. Efter inkubationen tillsätts 150 μl lämplig buffert och suspensionen centrifugeras vid 350 × g i 5 minuter vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten och suspendera cellerna på nytt i 200 μl färgningsbuffert följt av centrifugering vid 300 × g i 5 minuter vid 4 °C. Aspirera och suspendera cellerna i 200 μL färgningsbuffert för flödescytometrisk analys.
6) Cytometer och kompensationsinställning
- Omedelbart innan du kör proverna, förbered kompensationspärlor (se materialtabell) om du använder pärlbaserad kompensation i motsats till cellbaserad kompensation.
- Märk separata mikrocentrifugrör för varje fluorokromkonjugerad antikropp och tillsätt 100 μl 1x PBS följt av en hel droppe negativ kontrollkompensationskula mot möss och en droppe positiv kontrollkompensationskula till varje rör. Tillsätt 1 μl av lämplig antikropp till varje separat rör. Virvla och inkubera i 5 minuter före förvärvet.
OBS: Eftersom vissa färgämnen, som BUV737, inte kan bindas till pärlor, använd en cellbaserad kontroll.
- Märk separata mikrocentrifugrör för varje fluorokromkonjugerad antikropp och tillsätt 100 μl 1x PBS följt av en hel droppe negativ kontrollkompensationskula mot möss och en droppe positiv kontrollkompensationskula till varje rör. Tillsätt 1 μl av lämplig antikropp till varje separat rör. Virvla och inkubera i 5 minuter före förvärvet.
- Kalibrera flödescytometern före varje experiment genom att köra cytometerinställningen med spårningspärlorna och behåll flödescytometerinställningarna för varje experiment.
- Innan du analyserar provet, justera flödescytometern genom att köra ett ofärgat prov för att justera cellpopulationen på ett sidospridningsdiagram (SSC) kontra framåtspridningsdiagram (FSC) så att cellpopulationen faller i mitten av diagrammet och inte är utanför skalan.
- Kör det färgade provet kort för att justera spänningarna för FSC och SSC och för varje kanal för att säkerställa att inga händelser faller utanför den logaritmiska skalan för varje kanal. Registrera 5 000 händelser för varje kompensationskontroll, följt av grind av positiva och negativa populationer. Beräkna kompensationsmatrisen och kör sedan urvalen och samla in minst 1 000 händelser för de populationer som är av intresse.
OBS: Kompensation på större färgpaneler bör verifieras, eftersom automatisk kompensation kan vara benägen till över- eller underkompensation. Varje parameter bör plottas mot alla andra parametrar för att övervaka tecken på över- eller underkompensation, och varje enfärgad kontroll bör utvärderas. Komplex kompensation av experiment med större färger bör utföras med hjälp av en samarbetspartner eller en kärnfacilitet med omfattande erfarenhet av flödescytometri. Nyare typer av flödescytometrar, t.ex. spektrala cytometrar, använder hela spektrumet av en fluorofor genom en process som kallas spektral avblandning, vilket kan ge en renare distinktion av fluorescerande överlappning jämfört med enbart standardkompensation22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Processen för utveckling av flödescytometripaneler för immunanalys bygger ofta på jämförelse av resultat med befintliga data och litteraturen inom området. Kunskap om hur populationer kan uppträda i flödescytometri är avgörande för korrekt tolkning av data. Oavsett vilket kan populationer och celltyper se olika ut i olika vävnader, så en viss variabilitet kan förväntas. I samband med väldefinierade kontrollvävnader kan sådan färgningsoptimering utvärderas mot känd vävnad som har väl undersökta celltyper. Figur 3 visar resultaten av en 14-färgs FACS på kontrollmusvävnad. I det här fallet användes mjälten för att identifiera alla markörer som färgades för, och för att visa att färgningen var tekniskt funktionell. Från och med nu blev det lättare att testa under okända förhållanden, vara säker på valet av fluorofor och optimera protokollet för olika vävnadskällor. Figur 3 visar också populationer av olika celltyper isolerade från en murin mjälte19.
Här kunde flera tydliga populationer, såsom Ly6G+ neutrofiler, och olika uttrycksnivåer av Ly6C på olika monocytklasser observeras. CD11chiMHCII+ dendritiska celler var tydligt när de styrdes mot CD11b för att utesluta makrofager och andra myeloida linjeceller såsom neutrofiler och monocyter. En delmängd av CD206+CD86+ dendritiska celler kunde hittas genom att fokusera på denna CD11c+-population. CD86 och CD206 inkluderades i fenotypen myeloida celler som i ett mer M1-liknande (CD86hi) jämfört med i ett mer M2-liknande (CD206hi) polarisationstillstånd. F4/80 visade en gradient av uttryck som är vanligt förekommande i olika makrofagpopulationer. Siglec-F förekom i två populationer, F4/80+ och F4/80-, vilket troligen motsvarade en undergrupp av makrofager respektive eosinofiler. Även om dessa beteckningar av celltyper kan göras, är det viktigt att notera att celler som uttrycker olika markörer bör ses på ett funktionellt sätt i motsats till en mer binär klassificering. Att erkänna att vad som anses vara en makrofag kan skilja sig åt i mjälten och den främmande kroppskapseln runt ett implantat är viktigt och undviker potentiella feltolkningar av resultaten.
Figur 1: Översikt över flödescytometrifärgningsprotokollet. Förberedelsen inkluderar dissektion av den aktuella vävnaden följt av 1) manuell tärning, 2) enzymatisk nedbrytning, 3) cellsilning och tvättning, och 4) färgning med fluorescerande märkta antikroppar följt av flödescytometrisk analys. Illustrationen är gjord med Biorender. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Exempel på en plattlayout för färgning av flödescytometri. Denna layout inkluderar proverna, fluorescens minus en (FMO) kontroller, kompensationskontroller och en kontrollvävnad sample (mjälte). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa resultat från 14-färgs FACS-färgning på kontrollmusvävnad. Myeloid cellfenotypning av murina mjältceller med exempel på hand-gating och automatiserad t-stokastisk granninbäddning (t-SNE) klustringsalgoritm för datavisning. Denna figur har återgetts från Sadtler och Elisseeff19. Förkortningar: FACS = fluorescensaktiverad cellsortering; SSC = sidospridning; CD = kluster av differentiering; PE = fykoerytrin; CCR = C-C kemokinreceptortyp; MHC = större histokompatibilitetskomplex; PerCP = peridininklorofyllproteinkomplex. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Reagens/antikropp | μL per prov |
| CD86 BUV395 | 0.25 |
| CD45 BUV737 | 0.5 |
| CD8a BV421 | 0.25 |
| Ly6g BV510 | 0.125 |
| Siglec F BV605 | 0.25 |
| MHCII BV786 | 0.25 |
| Ly6c AF488 | 0.125 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | 0.2 |
| CD206 PE | 0.2 |
| CD197 PE/Dazzle594 | 0.125 |
| F4/80 PE/Cy7 | 0.25 |
| CD200R3 APC | 0.25 |
| CD11b AF700 | 0.25 |
| Fc-blocket | 1 |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | 10 |
| 1x PBS | 35.975 |
| Total volym: | 50 μL |
Tabell 1: Exempel på ytantikroppscocktail. Ett exempel på en antikroppscocktail för myeloid fenotypning av musvävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna översikt beskriver en detaljerad metod för att isolera celler från biomaterialimplantat för att erhålla en enhetlig cellsuspension. Dessutom har ett detaljerat protokoll tillhandahållits för färgning av cellsuspensionen för flerfärgad flödescytometri, tillsammans med stegen för att konfigurera en flödescytometer för optimala resultat. Cellisoleringsmetoder kan involvera flera steg, ofta med manuell vävnadsdissektion följt av enzymatisk nedbrytning med proteolytiska enzymer för att dissociera den extracellulära matrisen i vävnaden och störa cell-cell-korsningarna för att frigöra enskilda celler från vävnaden. Efter matsmältningen behövs ytterligare bearbetning, såsom cellsilning, för att avlägsna kvarvarande skräp och säkerställa en encellssuspension. Vissa prover som har höga halter av skräp eller andra celltyper (t.ex. tumörer) kan kräva mer grundlig rengöring genom användning av densitetsseparationsmedia23. Utan ordentlig provtagning kan data förvrängas på grund av skräp eller andra cellpopulationer som skymmer de populationer som är av intresse. Överflödigt skräp kan också leda till fullständig eller partiell igensättning av cytometerfluidiken.
Medan karakteriseringen av immunceller också kan utföras med andra metoder, såsom ljusmikroskopi, genom att utföra ett differentiellt cellantal på ett cellcytospinpreparat, ger flödescytometri en mer exakt karakterisering av cellerna baserat på cellytemarkörer. Dessutom är flödescytometridata mer exakta eftersom de kan karakterisera och kvantifiera miljontals celler i suspension och kan ge exakta uppskattningar av distinkta cellundergrupper mycket snabbare än manuell differentialräkning baserad på endast 400 celler24. Resultaten som visas i denna artikel bygger på en iterativ paneldesign med antikroppsselektion gjord genom användning av flera onlineverktyg för att jämföra excitations- och emissionsspektra och teoretisk överlappning beroende på cytometerkonfigurationen. När man utformar större färgexperiment är det bäst att börja från noll, i motsats till att lägga till en mindre färgpanel, för att fullt ut ta hänsyn till antigenöverflöd, fluoroforljusstyrka och spektral överlappning.
Studier som analyserar distinkta undergrupper av specifika immunceller kräver tillräckligt många totala celler för att utföra flödescytometri, eftersom ett mindre antal celler kan utgöra en betydande utmaning i deras isolering genom cellsortering eller erhållande av korrekta uppskattningar. Denna utmaning kan övervinnas genom att använda magnetiska pärlor för att isolera och berika specifika immunceller, såsom neutrofiler, under kortare perioder och med begränsad tvätt25. Isolerade celler från vävnader i organ som lungor kan innehålla betydande mängder slem, vilket kan göra cellsuspensionen "klibbig" och resultera i ett ökat antal dubbletthändelser under flödescytometri26,27. Tillsats av kelatbildare såsom 2 mM etylendiamintetraättiksyra till färgningsbufferten kan förhindra aggregering av celler i sådana prover.
Dessutom kan suspenderande av celler i en ökad volym av buffert också begränsa dubblettskapandet genom att minska cell-cellinteraktioner. Färgningsprocedurer bör optimeras noggrant för varje vävnad, färgningsprotokoll, flödescytometer och antikroppspanel. Vissa fluoroforer kan vara känsligare för fixeringsmedel, vissa celltyper är mer känsliga för olika cellisolerings- och bearbetningsmetoder, och många celltyper beter sig olika i olika vävnader och på olika platser. Med korrekt förberedelse och noggrann analys kan flödescytometri ge en detaljerad analys på cell- och proteinnivå för att karakterisera ställningen och biomaterialets immunmikromiljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes delvis av NIH:s intramurala forskningsprogram, inklusive National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering. Ansvarsfriskrivning: NIH, dess tjänstemän och anställda rekommenderar eller stöder inte något företag, produkt eller tjänst.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
References
- Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
- Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules. Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).
- Rolfe, B., et al. The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering. Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. Eberli, D., et al. , IntechOpen. (2011).
- Erdem, S., Gür, M., Kaman, M. O. Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions. Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).
- Kang, C. -W., Fang, F. -Z. State of the art of bioimplants manufacturing: part I. Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).
- Sadtler, K., et al. Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds. Biomaterials. 192, 405-415 (2019).
- Sadtler, K., et al. Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040 (2016).
- Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A.
- Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling. Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).
- Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
- Zhang, L., et al. Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction. Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).
- Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction. Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).
- Tan, H., Marra, K. G. Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications. Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).
- Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials. Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).
- Sadtler, K., et al. Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells. Science. 352 (6283), 366-370 (2016).
- Gower, R. M., et al. Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression. Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).
- Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).
- Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A.
- Sadtler, K., Elisseeff, J. H. Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials. Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , Wiley. (2003).
- Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.27 (2013).
- Wolf, M. T., et al. A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy. Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).
- Kahng, J., et al. Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts. Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).
- Sionov, R. V., et al. Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties. Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).
- Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
- Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).
