Summary
Diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi ile karakterizasyonu, implantlara karşı immün yanıt paterninin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu makale, diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrik analizi için boyanması için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.
Abstract
Laboratuvarda yetiştirilen bir doku veya tıbbi bir cihazın bir bireye implante edilmesinin başarısı, alıcı konağın bağışıklık tepkisine bağlıdır. Bir implantı yabancı bir cisim olarak kabul etmek, düşmanca ve düzensiz bir bağışıklık tepkisi implantın reddedilmesine neden olabilirken, düzenlenmiş bir yanıt ve homeostazın yeniden kazanılması, kabulüne yol açabilir. İn vivo veya ex vivo ortamlarda diseke edilen implantların mikro ortamlarının analiz edilmesi, sonuçta yeni nesil biyomateryallerin geliştirilmesine yardımcı olabilecek bağışıklık tepkisi modelinin anlaşılmasına yardımcı olabilir. Akış sitometrisi, bağışıklık hücrelerini ve alt kümelerini hücre yüzey belirteçlerine göre karakterize etmek için iyi bilinen bir tekniktir. Bu derlemede, diseke edilmiş implant dokusundan tek tip hücre süspansiyonlarının izolasyonu için manuel küp küp doğrama, enzimatik sindirim ve bir hücre süzgecinden filtrasyona dayalı bir protokol açıklanmaktadır. Ayrıca, bu izole edilmiş hücreleri akış sitometrisi ile karakterize etmek ve ölçmek için ilk sitometre ayarları için adımlarla birlikte çok renkli bir akış sitometrisi boyama protokolü açıklanmıştır.
Introduction
Tıp alanındaki gelişmeler, hasarlı dokunun işlevini veya yeniden büyümesini desteklemek için implante edilen malzemelerin sıklıkla kullanılmasına yol açmıştır 1,2. Bunlar arasında kalp pilleri, rekonstrüktif kozmetik implantlar ve kemik kırığı fiksasyonu için kullanılan ortopedik plakalar gibi cihazlar bulunur 3,4. Ancak bu implantları yapmak için kullanılan materyaller ve implante edildikleri yerler bu implantların başarısını belirlemede önemli rol oynamaktadır 5,6,7. Yabancı cisimler olarak, bu implantlar konakçıdan reddedilmeye veya toleransa yol açabilecek bir bağışıklık tepkisi oluşturabilir8. Bu faktör, implantasyondan sonra istenen bağışıklık tepkisini çekebilecek materyaller üretmek için biyomateryal araştırmalarını yönlendirmiştir 9,10,11,12.
Bağışıklık tepkisi, hasarlı bir doku veya organın değiştirilmesi için bir laboratuvarda bir doku veya organın bir biyomateryal iskeleti (iskele) etrafında büyütüldüğü rejeneratif tıp alanında temel bir gerekliliktir13,14,15,16. Rejeneratif tıpta amaç, her biri bağışıklık tepkileri tarafından büyük ölçüde modüle edilebilen hücreler, sinyaller ve iskeleler kullanarak eksik veya hasarlı dokuyu değiştirmektir17. Ayrıca, immün yanıt eksikliği istendiğinde bile, çok nadiren istenen düzenleyici bir profilin varlığından ziyade immün aktivitenin yokluğudur18. Akış sitometrisi gibi teknikler, implant cihazlarını kaplamak veya doku mühendisliği için iskele geliştirmek için kullanılan çeşitli biyomalzemelere karşı bağışıklık tepkisi modelini karakterize etmede önemli bir rol oynayabilir19.
Bu bilgi, sonuçta, bağışıklık sistemi tarafından iyi tolere edilebilen implantlar için biyomateryallerin geliştirilmesine veya doku mühendisliğinde yapıcı bir rol oynayabilecek iskelelerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Akış sitometrisi ile analiz için numunelerin uygun şekilde hazırlanması, floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması yoluyla immün karakterizasyonda yanlış sonuçlardan kaçınmak için önemli bir adımdır20,21. Bu nedenle, bu derleme, hücrelerin iskele dokusundan izolasyonu, hücre süspansiyonunun boyanması ve akım sitometrisi ile analizi için kullanılabilecek ayrıntılı bir metodoloji sunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Şekil 1 , akış sitometrisi protokolüne genel bir bakış sunar.
1) Reaktif hazırlama
- Enzimleri seyreltmek ve doku kültürü için ortam hazırlayın.
- 500 mL RPMI ortamına 5 mL 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) tampon çözeltisi ekleyin ve iyice çalkalayın. Ortamı daha fazla kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
- Enzim çözeltisinin hacmini hesaplayın.
NOT: Enzim çözeltisinin hacmi, 6 oyuklu plakalarda doğranmış dokuyu sindirmek için gerekli olacak enzimleri (kollajenaz ve DNaz I) içeren ortamın hacmidir; Numune sayısına bağlıdır.- Gerekli hacmi hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın:
(Sindirilecek numune sayısı) × 10 mM HEPES tamponu ile 5 mL serumsuz RPMI
NOT: Örneğin, 0.1 ila 0.3 g disseke dalak için, enzim çözeltisini hazırlamak için 5 mL ortam kullanın. Bu yazıda tarif edilen enzimatik sindirim protokolü, esas olarak beyin, böbrek, deri, karaciğer, akciğerler, dalak, kaslar ve ayrıca sentetik malzemelerden veya hücre dışı matriks proteinlerinden yapılmış deri altı implantların etrafındaki kapsülleri içeren farelerden diseke edilen yumuşak dokular (0.1 ila 1 g arasında değişen) içindir. Sert kıkırdaklı dokuların sindirilmesi, yalnızca optimizasyonla tespit edilebilen farklı koşullar ve hacimlerde sindirim enzimleri gerektirebilir. - Enzim çözeltisi için ihtiyacım olan kollajenaz ve DNaz miktarını hesaplayın.
NOT: Bu protokolde 0.25 mg/mL kollajenaz ve 0.2 mg/mL DNaz I kullanılmıştır. Kollajenaz ve DNaz için gerekli çalışma konsantrasyonları, farklı doku tipleri için değişebilir19.
- Gerekli hacmi hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın:
- 999 μL fosfat tamponlu saline (PBS) 1 μL canlılık boyası ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek 1:1000 canlılık boya çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi girdaplayın. Çözeltiyi daha fazla kullanılana kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın.
- 100 mL PBS'ye 1 g sığır serum albümini (BSA) ekleyerek boyama tamponunu hazırlayın ve BSA tamamen eriyene kadar çözeltiyi vorteksleyin. Çözeltiyi daha fazla kullanılana kadar 4 °C'de saklayın.
2) Enzimatik sindirim plakalarının ayarlanması
- Her kuyucukta 70 μm hücre süzgeci bulunan 6 oyuklu bir plaka oluşturun. Her bir oyuğa adım 1.1.1'den 3 mL hazırlanan ortam ekleyin ve buz üzerinde inkübe edin.
- Hesaplanan kollajenaz ve DNaz I miktarını süspanse etmek için kalan ortamı (2 mL/kuyu) 37 °C'de bir inkübatörde veya su banyosunda saklayın (adım 1.2.2).
3) Hücrelerin izolasyonu
- Kesilen implantları/dokuyu plakalara yerleştirin ve makas kullanarak ince ince doğrayın. Alternatif olarak, bir doku ayrıştırıcı veya el tipi homojenizatör kullanarak mekanik bir parçalama yöntemi kullanın. Çok sayıda lökosit nedeniyle, her çalışmada boyama kontrolü olarak kullanmak için dalağı inceleyin.
NOT: Bazı materyaller daha yüksek fibroz seviyelerine neden olduğundan, bu protokol hem yüksek fibrotik hem de minimal fibrotik materyaller için geçerlidir. Bununla birlikte, her işleme yöntemi, boyamadan önce sindirimden sonra hem hücre verimi hem de canlılık açısından değerlendirilmelidir. Diseksiyon sırasında periferik kan kontaminasyonundan kaçının. - 37 ° C'ye ısıtılmış kalan RPMI'ye (2 mL) kollajenaz ve DNaz I (adım 1.2.2'de hesaplanan hacim) ekleyin. Her oyuğa 2 mL tam enzim çözeltisi ekleyin.
- Plakaları 37 °C ve 100 rpm'de 45 dakika inkübe edilmiş bir çalkalayıcıya yerleştirin.
NOT: Uygun ısı transferini engelleyebileceğinden plakaları istiflerken dikkatli olun. - Bu arada 1000 μL'lik bir ucun ucundan makasla 3-4 mm doğrayarak süspansiyon dağıtma ucu hazırlayın. İnkübasyondan sonra, doğranmış ucu kullanarak iyice karıştırmak için süspansiyonu kuyucuklarda yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre süzgecini 50 mL'lik konik bir tüpün üstüne yerleştirin ve sindirilmiş çözeltiyi hücre süzgecinden geçirin.
NOT: 70 μm hücre süzgeci, hücreleri aljinat gibi implante edilmiş biyomateryalden ayırmak için yeterlidir. Daha fazla saflık gerekiyorsa, zenginleştirilmiş bir lökosit popülasyonu elde etmek için yoğunluk gradyan ayrımı gibi işlemleri kullanın. - Kuyucukları 1x PBS solüsyonu ile durulayın ve durulama hacmini süzgeçten aktarın, ardından tüpteki hacim 50 mL'ye ulaşana kadar süzgecin yıkamalarını 1x PBS solüsyonu ile ekleyin.
NOT: Sindirimin viskozitesinde herhangi bir artışı önlemek ve santrifüjleme sırasında hücre peletlenmesine izin vermek için 1x PBS oda sıcaklığında olmalıdır. - Tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, peleti bozmadan serolojik bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice aspire edin. Peleti 1000 μL 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL tripan mavisi ile karıştırın ve süspansiyonu, otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak için sayma odası slaytlarına veya mikroskop altında geleneksel yöntemle saymak için bir hemositometreye yükleyin. Alternatif olarak, akış sitometrisi hücre sayma boncukları kullanın.
4) Akış sitometrisi için boyama
- 2 numune, floresan eksi bir (FMO) kontrolleri, kompanzasyon kontrolleri ve tamamen lekeli dalak numune kontrolü ile 14 renkli bir deney için örnek bir plaka düzeni için Şekil 45'ye bakın. Toplam hücre sayısını tahmin ettikten sonra, her numune için 1 × 10 6 hücreyi ve her kompanzasyon ve FMO kontrolü için 0,5 × 106 hücreyi boyamak için gereken hücre süspansiyonunun hacmini hesaplayın. Hücre süspansiyonunun gerekli hacmini V-tabanlı 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına dağıtın ve hacmi 1x PBS ile 100 μL'ye çıkarın.
NOT: Örnek olarak, adım 3.6'da elde edilen 1000 μL hücre süspansiyonu 40 × 10 6 hücre içeriyorsa, 1 × 10 6 hücre için 1000/40 × 106 = 25 μL hücre süspansiyonu gerekecektir. - Plakayı 300 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve daha sonra 100 μL 1:1000 canlılık boyası çözeltisi ile canlılığı belirlemek için numune kuyucuklarında ve bir dengeleme kontrol kuyusunda hücreleri yeniden süspanse edin (bkz.
- Diğer kompanzasyon kuyularının yanı sıra FMO ve boyanmamış kuyulardaki hücreler için, bunları 100 μL 1x PBS ile yeniden süspanse edin.
- Hücreleri karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
- Bu arada, numuneyi ve FMO kontrollerini boyamak için bir yüzey antikor kokteyli hazırlayın: numune başına 50 μL veya FMO. Antikor kokteyli örneği için Tablo 1'e bakınız.
- İnkübasyondan sonra, her bir oyuğa 100 μl 1x PBS ekleyin, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da döndürün.
- Süpernatanı aspire edin ve 200 μL boyama tamponunda (1x PBS +% 1 BSA) yeniden süspanse edin; 300 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin ve 50 μL 1x PBS ile kompanzasyon, FMO ve boyanmamış kuyucuklardaki hücreleri yeniden süspanse edin. İlgili numune kuyucuklarına ve FMO kuyucuklarına 50 μL antikor kokteyli ekleyin. İlgili antikorları farklı kompanzasyon kuyularına ekleyin.
- Plakayı karanlıkta 4 °C'de 45 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her bir oyuğa 150 μL boyama tamponu ekleyin ve hücre süspansiyonunu 300 ° C'de 5 dakika boyunca 4 × g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin, hücreleri 200 μL boyama tamponu ile yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.
- Numuneleri fiksasyon olmadan analiz ediyorsanız, bunları 200 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin ve sitometre kurulumu ve numune analizi ile ilgili bölüm 6'ya geçin. Hücreleri sabitliyorsanız, yıkadıktan sonra süpernatanı aspire edin ve% 4 paraformaldehit gibi 100 μL bir fiksatif ekleyin. Hücre içi belirteçler için boyama yapıyorsanız, hücre içi boyama ile ilgili bölüm 5'e geçin ve hücreleri sabitleyin ve geçirgen hale getirin (bkz. Hücreleri karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
NOT: Fiksasyon, bazı floroforların floresan yoğunluğunu etkileyebileceğinden, her paneli hem fiksasyonlu hem de fiksasyonsuz olarak değerlendirin. - İnkübasyondan sonra, 100 μL 1x PBS ekleyin, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin, 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.
- Hücreleri 200 μL boyama tamponunda tekrar süspanse edin ve akış sitometrik analizinden önce 4 ° C'de saklayın.
5) Hücre içi boyama
- Hücre içi belirteçler için fiksasyon ve geçirgenlik için adım 4.11'den devam ederek, 100 μL uygun tampon ekleyin. Hücreleri 350 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peletleri 200 μL fiksatif-geçirgen ajan çözeltisinde yeniden süspanse edin; hücreleri 350 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peletleri uygun tamponda seyreltilmiş hücre içi antikorlarla yeniden süspanse edin.
NOT: Antikor tipleri ve dilüsyonları hedef hücrelere bağlı olacaktır. Örneğin, yaygın bir hücre içi belirteç, düzenleyici T hücreleri için sıklıkla 1:100 seyreltmede kullanılan çatal başlı kutu P3'tür. - Hücre süspansiyonunu karanlıkta 4 °C'de 45 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, 150 μL uygun tampon ekleyin ve süspansiyonu 350 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 200 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Akış sitometrik analizi için hücreleri 200 μL boyama tamponunda aspire edin ve yeniden süspanse edin.
6) Sitometre ve kompanzasyon kurulumu
- Numuneleri çalıştırmadan hemen önce, hücre bazlı kompanzasyon yerine boncuk bazlı kompanzasyon kullanılıyorsa, kompanzasyon boncukları hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Her florokrom konjuge antikor için ayrı mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin ve her tüpe 100 μL 1x PBS ve ardından bir tam damla anti-fare negatif kontrol kompanzasyon boncuğu ve bir damla pozitif kontrol kompanzasyon boncuğu ekleyin. Her ayrı tüpe 1 μL uygun antikor ekleyin. Vorteks yapın ve satın almadan önce 5 dakika inkübe edin.
NOT: BUV737 gibi bazı boyalar boncuklara bağlanamadığından, hücre tabanlı bir kontrol kullanın.
- Her florokrom konjuge antikor için ayrı mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin ve her tüpe 100 μL 1x PBS ve ardından bir tam damla anti-fare negatif kontrol kompanzasyon boncuğu ve bir damla pozitif kontrol kompanzasyon boncuğu ekleyin. Her ayrı tüpe 1 μL uygun antikor ekleyin. Vorteks yapın ve satın almadan önce 5 dakika inkübe edin.
- Sitometre kurulumunu izleme boncuklarıyla çalıştırarak her deneyden önce akış sitometresini kalibre edin ve her deney için akış sitometresi ayarlarını koruyun.
- Numuneyi analiz etmeden önce, hücre popülasyonu grafiğin ortasına düşecek ve ölçek dışı olmayacak şekilde bir yan saçılma (SSC) ve ileri dağılım (FSC) grafiğindeki hücre popülasyonunu ayarlamak için boyanmamış bir numune çalıştırarak akış sitometresini ayarlayın.
- Hiçbir olayın her kanalın logaritmik ölçeğinin dışına çıkmadığından emin olmak için FSC ve SSC voltajlarını ve her kanal için ayarlamak üzere lekeli örneği kısa bir süre çalıştırın. Her kompanzasyon kontrolü için 5.000 olay kaydedin, ardından pozitif ve negatif popülasyonların geçitlenmesi izleyin. Ücret matrisini hesaplayın ve ardından ilgili popülasyonlar için en az 1.000 olay toplayarak örnekleri çalıştırın.
NOT: Otomatik ücretlendirme aşırı veya eksik ücretlendirmeye eğilimli olabileceğinden, daha büyük renkli panellerdeki dengeleme doğrulanmalıdır. Aşırı veya eksik telafi belirtilerini izlemek için her parametrenin grafiği diğer tüm parametrelere göre grafiklendirilmeli ve her tek renkli kontrol değerlendirilmelidir. Daha büyük renkli deneylerin karmaşık telafisi, bir işbirlikçinin veya kapsamlı akış sitometrisi deneyimine sahip bir çekirdek tesisin yardımıyla gerçekleştirilmelidir. Spektral sitometreler gibi daha yeni akış sitometreleri, tek başına standart kompanzasyona kıyasla daha temiz bir floresan örtüşme ayrımı sağlayabilen, spektral karıştırma olarak bilinen bir işlem yoluyla bir floroforun tam spektrumunu kullanır22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İmmün analiz için akış sitometrisi panellerinin geliştirilmesi süreci genellikle sonuçların mevcut verilerle ve alandaki literatürle karşılaştırılmasına dayanır. Popülasyonların akış sitometrisinde nasıl bulunabileceğinin bilinmesi, verilerin doğru yorumlanması için kritik öneme sahiptir. Ne olursa olsun, popülasyonlar ve hücre tipleri farklı dokularda farklı görünebilir, bu nedenle bazı değişkenlikler beklenebilir. İyi tanımlanmış kontrol dokuları bağlamında, bu tür boyama optimizasyonu, iyi araştırılmış hücre tiplerine sahip bilinen dokulara karşı değerlendirilebilir. Şekil 3 , kontrol faresi dokusu üzerindeki 14 renkli bir FACS'nin sonuçlarını göstermektedir. Bu durumda, dalak boyanan tüm belirteçleri tanımlamak ve boyamanın teknik olarak işlevsel olduğunu göstermek için kullanıldı. Bu noktadan itibaren, bilinmeyen koşullarda test yapmak, florofor seçiminden emin olmak ve farklı doku kaynakları için protokolü optimize etmek daha kolay hale geldi. Şekil 3 ayrıca bir murin dalağından izole edilen farklı hücre tiplerinin popülasyonlarını göstermektedir19.
Burada, Ly6G + nötrofiller gibi birkaç belirgin popülasyon ve farklı monosit sınıflarında Ly6C'nin farklı ekspresyon seviyeleri gözlemlenebilir. CD11chiMHCII + dendritik hücreler, makrofajları ve nötrofiller ve monositler gibi diğer miyeloid soy hücrelerini ekarte etmek için CD11b'ye karşı kapılandığında kolayca görülüyordu. CD206 + CD86 + dendritik hücrelerin bir alt kümesi, bu CD11c + popülasyonuna odaklanarak bulunabilir. CD86 ve CD206, fenotip miyeloid hücrelere daha M1 benzeri (CD86hi) ve daha M2 benzeri (CD206hi) polarizasyon durumunda olarak dahil edildi. F4/80, çeşitli makrofaj popülasyonlarında yaygın olarak gözlenebilen bir ekspresyon gradyanı gösterdi. Siglec-F, büyük olasılıkla sırasıyla bir makrofaj alt kümesine ve eozinofillere karşılık gelen F4/80+ ve F4/80- olmak üzere iki popülasyonda mevcuttu. Hücre tiplerinin bu tanımlamaları yapılabilse de, farklı belirteçleri ifade eden hücrelerin daha ikili bir sınıflandırmanın aksine işlevsel bir şekilde görülmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Makrofaj olarak kabul edilen şeyin dalakta ve bir implantın etrafındaki yabancı cisim kapsülünde farklılık gösterebileceğinin kabul edilmesi önemlidir ve sonuçların olası yanlış yorumlanmasını önler.
Şekil 1: Akış sitometrisi boyama protokolüne genel bakış. Hazırlık, ilgilenilen dokunun diseksiyonunu ve ardından 1) manuel küp küp doğrama, 2) enzimatik sindirim, 3) hücre süzme ve yıkama ve 4) floresan etiketli antikorlarla boyamayı ve ardından akış sitometrik analizini içerir. İllüstrasyon Biorender ile yapılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Akış sitometrisi boyama için bir plaka düzeni örneği. Bu düzen numuneleri, floresan eksi bir (FMO) kontrollerini, kompanzasyon kontrollerini ve bir kontrol dokusu numunesini (dalak) içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kontrol faresi dokusu üzerinde 14 renkli FACS boyamanın temsili sonuçları. Fare dalağı hücrelerinin miyeloid hücre fenotiplemesi, veri gösterimi için el kapısı ve otomatik t-stokastik komşu gömme (t-SNE) kümeleme algoritması örnekleri ile. Bu figür Sadtler ve Elisseeff19'dan yeniden üretilmiştir. Kısaltmalar: FACS = floresanla aktive edilen hücre sıralaması; SSC = yan saçılma; CD = farklılaşma kümesi; PE = fikoeritrin; CCR = CC kemokin reseptör tipi; MHC = majör doku uyumluluk kompleksi; PerCP = peridinin klorofil protein kompleksi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Reaktif/Antikor | numune başına μL |
| CD86 BUV395 | 0.25 |
| CD45 BUV737 | 0.5 |
| CD8a BV421 | 0.25 |
| Ly6g BV510 | 0.125 |
| Siglec F BV605 | 0.25 |
| MHCII BV786 | 0.25 |
| Ly6c AF488 | 0.125 |
| CD11c PerCP / CY5.5 | 0.2 |
| CD206 PE | 0.2 |
| CD197 PE / Göz Kamaştırıcı594 | 0.125 |
| F4/80 PE/Cy7 | 0.25 |
| CD200R3 APC | 0.25 |
| CD11b AF700 | 0.25 |
| Fc Bloğu | 1 |
| BD Brilliant Leke Tamponu Plus | 10 |
| 1 adet PBS | 35.975 |
| Toplam Hacim: | 50 μL |
Tablo 1: Yüzey antikor kokteyli örneği. Fare dokusunun miyeloid fenotiplemesi için örnek bir antikor kokteyli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu derleme, tek tip bir hücre süspansiyonu elde etmek için biyomateryal implantlardan hücreleri izole etmek için ayrıntılı bir metodolojiyi açıklamaktadır. Ek olarak, çok renkli akış sitometrisi için hücre süspansiyonunun boyanması için ayrıntılı bir protokol ve optimum sonuçlar için bir akış sitometresi yapılandırma adımları sağlanmıştır. Hücre izolasyon yöntemleri, dokudaki hücre dışı matrisi ayrıştırmak ve tek tek hücreleri dokudan serbest bırakmak için hücre-hücre bağlantılarını bozmak için genellikle manuel doku diseksiyonunu ve ardından proteolitik enzimlerle enzimatik sindirimi kullanan birden fazla adımı içerebilir. Sindirimden sonra, kalan kalıntıları gidermek ve tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için hücre süzme gibi daha ileri işlemlere ihtiyaç vardır. Yüksek düzeyde kalıntı veya diğer hücre tiplerine (tümörler gibi) sahip bazı numuneler, yoğunluk ayırma ortamı23 kullanılarak daha kapsamlı temizlik gerektirebilir. Uygun numune temizliği olmadan, enkaz veya ilgilenilen popülasyonları gizleyen diğer hücre popülasyonları nedeniyle veriler çarpıtılabilir. Aşırı kalıntı ayrıca sitometre sıvılarının tamamen veya kısmen tıkanmasına neden olabilir.
İmmün hücrelerin karakterizasyonu, bir hücre sitospin preparatı üzerinde diferansiyel hücre sayımı gerçekleştirerek ışık mikroskobu gibi diğer yöntemlerle de gerçekleştirilebilirken, akış sitometrisi, hücre yüzey belirteçlerine dayalı olarak hücrelerin daha doğru bir karakterizasyonunu sağlar. Ek olarak, akış sitometrisi verileri, süspansiyondaki milyonlarca hücreyi karakterize edebildikleri ve ölçebildikleri için daha hassastır ve yalnızca 400 hücreye dayalı manuel diferansiyel sayımdan çok daha hızlı bir şekilde farklı hücre alt kümelerinin doğru tahminlerini sağlayabilir24. Bu yazıda gösterilen sonuçlar, sitometre konfigürasyonuna bağlı olarak uyarma ve emisyon spektrumlarını ve teorik örtüşmeyi karşılaştırmak için birden fazla çevrimiçi aracın kullanılmasıyla yapılan antikor seçimi ile yinelemeli bir panel tasarımına dayanmaktadır. Daha büyük renk deneyleri tasarlarken, antijen bolluğunu, florofor parlaklığını ve spektral örtüşmeyi tam olarak göz önünde bulundurmak için daha küçük bir renk paneline eklemek yerine temiz bir sayfadan başlamak en iyisidir.
Spesifik bağışıklık hücrelerinin farklı alt kümelerini analiz eden çalışmalar, akış sitometrisi gerçekleştirmek için yeterli sayıda genel hücre gerektirir, çünkü daha az sayıda hücreye sahip olmak, hücre sıralaması veya doğru tahminler elde ederek izolasyonlarında önemli bir zorluk oluşturabilir. Bu zorluk, nötrofiller gibi spesifik bağışıklık hücrelerini daha kısa sürelerde ve sınırlı yıkama ile izole etmek ve zenginleştirmek için manyetik boncuklar kullanılarak aşılabilir25. Akciğerler gibi organların dokularından izole edilen hücreler, hücre süspansiyonunu "yapışkan" hale getirebilen ve akış sitometrisi26,27 sırasında artan sayıda çift olaya neden olabilen önemli miktarda mukus içerebilir. Boyama tamponuna 2 mM etilendiamin tetraasetik asit gibi şelatlama maddelerinin eklenmesi, bu tür numunelerde hücrelerin toplanmasını önleyebilir.
Ek olarak, hücrelerin artan bir tampon hacminde askıya alınması, hücre-hücre etkileşimlerini azaltarak çift oluşumunu da sınırlayabilir. Boyama prosedürleri, her farklı doku, boyama protokolü, akış sitometresi ve antikor paneli için iyice optimize edilmelidir. Bazı floroforlar fiksatiflere karşı daha duyarlı olabilir, bazı hücre tipleri farklı hücre izolasyon ve işleme yöntemlerine daha duyarlıdır ve birçok hücre tipi farklı dokularda ve farklı konumlarda farklı davranır. Uygun hazırlık ve özenli analiz ile akış sitometrisi, iskele ve biyomateryal bağışıklık mikro ortamını karakterize etmek için ayrıntılı bir hücresel ve protein düzeyinde analiz sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma kısmen, Ulusal Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik Enstitüsü de dahil olmak üzere NIH'nin Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Feragatname: NIH, yetkilileri ve çalışanları herhangi bir şirketi, ürünü veya hizmeti önermez veya onaylamaz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
References
- Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
- Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules. Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).
- Rolfe, B., et al. The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering. Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. Eberli, D., et al. , IntechOpen. (2011).
- Erdem, S., Gür, M., Kaman, M. O. Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions. Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).
- Kang, C. -W., Fang, F. -Z. State of the art of bioimplants manufacturing: part I. Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).
- Sadtler, K., et al. Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds. Biomaterials. 192, 405-415 (2019).
- Sadtler, K., et al. Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040 (2016).
- Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A.
- Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling. Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).
- Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
- Zhang, L., et al. Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction. Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).
- Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction. Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).
- Tan, H., Marra, K. G. Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications. Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).
- Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials. Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).
- Sadtler, K., et al. Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells. Science. 352 (6283), 366-370 (2016).
- Gower, R. M., et al. Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression. Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).
- Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).
- Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A.
- Sadtler, K., Elisseeff, J. H. Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials. Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , Wiley. (2003).
- Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.27 (2013).
- Wolf, M. T., et al. A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy. Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).
- Kahng, J., et al. Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts. Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).
- Sionov, R. V., et al. Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties. Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).
- Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
- Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).
