Измерение летучих и нестациональных противогрибковых действий продуктов биоконтроля

Summary

Мы описываем модифицированный метод на основе агара, предназначенный для количественной оценки противогрибкового воздействия растительных продуктов. С помощью этого протокола можно оценить как летучий, так и нестабильный вклад в противогрибковую активность. Кроме того, эффективность против грибов может быть измерена на ключевых стадиях развития в одной экспериментальной установке.

Abstract

Описанный протокол основан на методе передачи плагинов, который позволяет точно определить количество микроорганизмов и их стадии развития. Определенное количество спор распространяется на агар-пластину. Эта агарная пластина инкубируется в течение определенного периода, чтобы позволить грибам достичь ожидаемой стадии развития, за исключением спор, где инкубация не требуется. Агар пробки, покрытые спорами, гифа, или мицелий затем сняты и переданы на агар сми, содержащие противогрибковые соединения для тестирования либо размещены на расстоянии от грибов или в контакте. Этот метод применим для тестирования как жидких экстрактов, так и твердых образцов (порошков). Он особенно хорошо подходит для количественной оценки относительного вклада летучих и не летучих веществ в биологически активных смесях и для определения их воздействия, в частности на споры, раннюю гифе и мицелий.

Метод крайне актуален для характеристики противогрибковой активности продуктов биоконтроля, в частности продуктов растительного происхождения. Действительно, для обработки растений, результаты могут быть использованы для руководства выбор способа применения и установить триггерные пороги.

Introduction

Глобальные потери фруктов и овощей могут достигать до 50%^{производства 1 и в основном в результате распада продуктов} питания, вызванного порчу грибов в поле или во время^{послеуборочного хранения 2,3}, несмотря на обширную занятость синтетических фунгицидов с^{середины двадцатого века 4}. В настоящее время пересматривается вопрос об использовании этих веществ, поскольку оно представляет собой серьезную опасность для окружающей среды и здоровья. Как вредные последствия их использования появляются во всех экосистемах и доказательства потенциального воздействия на здоровье^{накопилось 5,6}, новые альтернативы старой профилактической стратегии разрабатываются для до- и после сбора урожая^{лечения 7,8,9}. Поэтому задача, с которой мы сталкиваемся, дыдная. Новые фунгицидные стратегии должны, во-первых, поддерживать уровень эффективности продовольственной защиты от фитопатогенов и, соответственно, способствовать значительному снижению воздействия сельскохозяйственной практики на окружающую среду. Для выполнения этой амбициозной цели, стратегии, вдохновленные естественной защиты развивались в растениях в настоящее время предлагается, как более 1000 видов растений были выделены для их противомикробных^{свойств 8}. Например, растения, которые разработали природные фунгициды для борьбы с фитопатогенами являются новым ресурсом в изучении разработки новых продуктов биоконтроля². Эфирные масла являются флагманскими молекулами этого типа. Например, эфирное масло Origanum защищает томатные растения от серой ^{плесени в теплицах 10} и Solidago canadensis L. и cassia эфирных масел было показано, чтобы сохранить пост-урожай клубники от повреждения серой^{плесени 11,12}. Эти примеры иллюстрируют, что биоконтроль и, в частности, растительные продукты представляют собой решение, которое сочетает в себе биологическую эффективность и экологическую устойчивость.

Таким образом, растения являются важным ресурсом молекул, представляющих потенциальный интерес для растениеводства. Однако только горстка растительных продуктов были предложены для использования в качестве продуктов биоконтроля, хотя они, как правило, признаются безопасными, нефитотоксические и экологически чистые². Некоторые трудности в транспозиции из лаборатории в поле наблюдались, такие как снижение эффективности после применения in vivo^2,9. Таким образом, становится важным улучшить способность лабораторных тестов лучше прогнозировать эффективность поля. В этом контексте методы противогрибкового тестирования растительных продуктов необходимы как для оценки их противогрибковой эффективности, так и для определения их оптимальных условий для использования. В частности, продукты биоконтроля, как правило, менее эффективны, чем химические фунгициды, поэтому лучшее понимание их способа действия важно для предложения подходящих формулировок, определения способа применения в полях и определения того, какая стадия развития патогена уязвима для биопродукта кандидата.

Современные подходы к борьбе с антибактериальной и противогрибковой деятельностью включают методы диффузии, такие как диффузия агар-диска, разбавление, биоаутография и цитометрия потока¹³. Большинство из этих методов, и более конкретно, стандартное тестирование противогрибковой восприимчивости – агар-диск диффузии и разбавления анализы – хорошо приспособлены для оценки антимикробной активности растворимых соединений на бактериальных и грибковых спор в жидких суспензиях¹⁴. Однако эти методы, как правило, не подходят для тестирования твердых соединений, таких как сушеный растительный порошок или количественной противогрибковой активности во время роста мицелия, поскольку они требуют разбавления спор или споры, распространяющиеся на агарных пластинах и/или разбавления противогрибковых соединений¹³. В пищевой отравленный метод, агар пластин, содержащих противогрибковое вещество прививаются с 5-7 мм диаметр диска взяты из 7-дневной культуры грибов без рассмотрения точного количества начала мицелия. После инкубации противогрибковая активность определяется как процент радиационно-роста ингибирования^17,18,19. При этом подходе мы можем оценить противогрибковую активность на мойцелиальный рост. В отличие от этого, метод разбавления агара выполняется для определения противогрибковой активности на спорах, непосредственно привитых на поверхности агарной пластины, содержащей противогрибковые соединения^13,20,21. Эти два подхода дают дополнительные результаты по противогрибковой активности. Однако это два независимых метода, используемых параллельно, которые не обеспечивают точного параллельного сравнения относительной эффективности противогрибковых соединений на споры и мицелий^17,20,22 как количество стартового грибкового материала отличается в двух подходах. Кроме того, противогрибковая активность растительного продукта часто является результатом сочетания противогрибковых молекул, синтезированных растениями, для борьбы с патогенными микроорганизмами. Эти молекулы включают белки, пептиды^23,24, и метаболиты, имеющие широкое химическое разнообразие и принадлежащие к различным классам молекул, таких как полифенолы, терпены, алькалоиды²⁵, глюкозинолаты⁸, и органосульфурные соединения²⁶. Некоторые из этих молекул летучих или становятся летучими во время патогенной атаки²⁷. Эти агенты чаще всего плохо водорастворимые и высокого давления пара соединений, которые должны быть восстановлены с помощью дистилляции воды в качестве эфирных масел, некоторые из которых антимикробной деятельности были хорошо установлены²⁸. Анализы опосредованности паровой фазы были разработаны для измерения антимикробной активности летучих соединений после испарения и миграции через фазу пара²⁹. Эти методы основаны на введении противогрибковых соединений на расстоянии от микробной культуры^{29,30,31,32,33}. В обычно используемых пара фазы агара анализ, эфирные масла откладываются на бумажном диске и помещается в центре крышки чашки Петри на расстоянии от бактериальных или грибковых спор подвески, которая распространяется на агар среды. Диаметр зоны ингибирования роста измеряется так же, как и метод диффузии агар-диска^20,24. Были разработаны другие подходы для количественного измерения противогрибковой восприимчивости эфирных масел к паровой фазе, полученной на основе метода разбавления бульона, из которого была рассчитана ингибирующая паровая фаза опосредованная противомикробная активность³², или полученных из агар-диск диффузии анализы³¹. Эти методы, как правило, специфичны для исследований паровой фазы активности и не подходят для анализа контактных ингибиции. Это исключает определение относительного вклада летучих и нестационатных веществ в противогрибковую активность сложной биоактивной смеси.

Количественный метод, который мы разработали, направлен на измерение противогрибкового эффекта сухого растительного порошка на контролируемые количества спор и выращенного мицелия, отложенного на поверхности агар-среды, чтобы воспроизвести воздушный рост фитопатогенов^{во время заражения растений 15,} а также взаимосвязанной мицелиальной^{сети 16}. Этот подход является модифицированной экспериментальной установкой, основанной на методах разбавления агара и пищевых отравленных продуктов, что также позволяет в той же экспериментальной установке количественно оценить вклад как летучих, так и нестационарных противогрибковых метаболитов. В этом исследовании метод был схвеирован с активностью трех хорошо охарактеризованных противогрибковых препаратов.

Protocol

1. Подготовка инойкулы До эксперимента, лежал 5 йл Триходерма spp. Споры SBT10-2018 хранятся при 4 градусах Цельсия на картофеле декстроза агар среды (PDA) и инкубировать в течение 4 дней при 30 градусов по Цельсию с регулярным воздействием света для содействия образованию конидии<sup class="x…

Representative Results

Чтобы оценить способность количественного метода различать способ действия различных видов противогрибковых соединений, мы сравнили эффективность трех известных противогрибковых препаратов. Карбендазим является не летучих синтетических фунгицидов, который широко используется дл?…

Discussion

Представленный здесь подход позволяет можно можно можно можно было бы можно можно было можно было можно можно было бы можно было можно можно было бы можно было можно получить для оценки противогрибковых свойств минимально обработанных растительных продуктов. В этом протоколе однород?…

Materials

Autoclave-vacuclav 24B+	Melag
Carbendazim	Sigma	378674-100G
Distilled water
Eppendorf tubes	Sarstedt	72.706	1.5 mL
Falcons tubes	Sarstedt	547254	50 mL
Five millimeters diameter stainless steel tube	retail store		/
Food dehydrator	Sancusto		six trays
Garlic powder	Organic shop
Glass beads	CLOUP	65020	2 mm
Hemocytometer counting cell	Jeulin	713442	/
Incubator	Memmert	UM400	30 °C
Knife mill	Bosch	TSM6A013B
Manual cell counter	Labbox	HCNT-001-001	/
Measuring ruler	retail store
Microbiological safety cabinets	FASTER		FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2
Micropipette	Mettler-Toledo	17014407	100 – 1000 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014411	20 – 200 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014412	2 – 20 µL
Petri dish	Sarstedt	82-1194500	55 mm
Petri dish	Sarstedt	82-1473	90 mm
Pipette Controllers-EASY 60	Labbox	EASY-P60-001	/
Potato Dextrose Agar	Sigma	70139-500G
Precision scale-RADWAG	Grosseron	B126698	AS220.R2-ML 220g/0.1mg
Rake	Sarstedt	86-1569001	/
Reverse microscope AE31E trinocular	Grosseron	M097917	/
Sterile graduated pipette	Sarstedt	1254001	10 mL
Thymus essential oil	Drugstore		Essential oil 100%
Tips 1000 µL	Sarstedt	70.762010
Tips 20 µL	Sarstedt	70.760012
Tips 200 µL	Sarstedt	70.760002
Tooth pick	retail store
Trichoderma spp strain			Strain of LRPIA laboratory
Tween-20	Sigma	P1379-250ML
Tween-80	Sigma	P1754-1L
Tweezers	Labbox	FORS-001-002	/