قياس النشاط المتطاير وغير المتطاير المضاد للفطريات لمنتجات التحكم الحيوي
Summary
نحن نصف طريقة معدلة تعتمد على أجار مصممة لقياس الآثار المضادة للفطريات للمنتجات المشتقة من النباتات. يمكن تقييم المساهمات المتقلبة وغير المتقلبة في النشاط المضاد للفطريات من خلال هذا البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن قياس الفعالية ضد الفطريات في المراحل التنموية الرئيسية في إعداد تجريبي واحد.
Abstract
ويستند البروتوكول الموصوف على تقنية نقل المكونات التي تسمح بتحديد دقيق لكميات الكائنات الحية الدقيقة ومراحل نموها. وينتشر عدد محدد من الجراثيم على لوحة أجار. يتم احتضان هذه الصفيحة لفترة محددة للسماح للفطريات بالوصول إلى مرحلة النمو المتوقعة ، باستثناء الجراثيم التي لا يلزم حضانتها. يتم سحب المقابس أجار التي تغطيها الجراثيم، الهيجا، أو الميسيليوم المقبل ونقلها على وسائل الإعلام أجار التي تحتوي على مركب مضاد للفطريات لاختبارها إما وضعها على مسافة من الفطريات أو في اتصال. هذه الطريقة قابلة للتطبيق لاختبار كل من المستخلصات السائلة والعينات الصلبة (المساحيق). وهي مناسبة بشكل خاص لتحديد المساهمات النسبية للعوامل المتطايرة وغير المتطايرة في الخلائط النشطة بيولوجيا وتحديد آثارها ، وتحديدا على الجراثيم والهيجا المبكرة والميسيليوم.
هذه الطريقة ذات صلة كبيرة لتوصيف النشاط المضاد للفطريات من منتجات المكافحة الحيوية ، ولا سيما المنتجات المشتقة من النباتات. في الواقع، لمعالجة النبات، يمكن استخدام النتائج لتوجيه اختيار طريقة التطبيق وتحديد عتبات الزناد.
Introduction
يمكن أن تصل الخسائر العالمية من الفواكه والخضروات إلى 50٪ من الإنتاج1 وتنجم في الغالب عن تسوس الأغذية الناجم عن تلف الفطريات في الحقل أو أثناء تخزين ما بعد الحصاد2،3 ، علىالرغممن الاستخدام الواسع لمبيدات الفطريات الاصطناعية منذ منتصف القرن العشرين4. ويجري حاليا إعادة النظر في استخدام هذه المواد لأنها تمثل مخاطر بيئية وصحية خطيرة. كما تظهر العواقب الضارة لاستخدامها في جميع أنحاء النظم الإيكولوجية والأدلة على الآثار الصحية المحتملة قد تراكمت5،6، ويجري تطوير بدائل جديدة لاستراتيجيات وقائية قديمة لعلاج ما قبل وبعد الحصاد7،8،9. ومن هنا يأتي التحدي الذي نواجهه من شقين. ويجب أن تحافظ الاستراتيجيات الجديدة لمبيدات الفطريات، أولا، على مستويات فعالية حماية الأغذية من الأمراض النباتية، وأن تسهم، ثانيا، في الحد بشكل كبير من البصمة البيئية للممارسات الزراعية. ولتحقيق هذا الهدف الطموح، يجري اقتراح استراتيجيات مستوحاة من الدفاعات الطبيعية التي تطورت في النباتات حيث تم تسليط الضوء على أكثر من 1000 نوع من النباتات لخصائصها المضادة للميكروبات8. على سبيل المثال، النباتات التي طورت مبيدات الفطريات الطبيعية لمكافحة phytopathogens هي مورد جديد في استكشاف تطوير منتجات جديدة للتحكم البيولوجي2. الزيوت الأساسية هي الجزيئات الرئيسية من هذا النوع. على سبيل المثال، زيت الأوريجانوم الأساسي يحمي نباتات الطماطم ضد العفن الرمادي في الدفيئات 10 وقد ثبت سوليداغو canadensis L. والزيوت الأساسية كاسيا للحفاظ على الفراولة بعد حصادها من أضرار العفن الرمادي11،12. وتوضح هذه الأمثلة أن المكافحة البيولوجية، ولا سيما المنتجات المشتقة من النباتات، تمثل حلا يجمع بين الفعالية البيولوجية والاستدامة البيئية.
وبالتالي، فإن النباتات مورد مهم للجزيئات ذات الأهمية المحتملة لصناعة حماية المحاصيل. ومع ذلك فقد اقترح سوى عدد قليل من المنتجات النباتية لاستخدامها كمنتجات التحكم البيولوجي على الرغم من أنها معترف بها عموما على أنها آمنة وغير phytotoxic وصديقة للبيئة2. وقد لوحظت بعض الصعوبات في نقل من المختبر إلى الميدان، مثل انخفاض فعالية مرة واحدة تطبق في الجسم الحي2،9. وبالتالي، يصبح من المهم تحسين قدرة الاختبارات المعملية على التنبؤ بشكل أفضل بفعالية المجال. وفي هذا السياق، فإن طرق اختبار مضادات الفطريات للمنتجات المشتقة من النباتات ضرورية لتقييم فعاليتها المضادة للفطريات وتحديد ظروفها المثلى للاستخدام. وعلى وجه التحديد، فإن منتجات المكافحة البيولوجية أقل كفاءة عموما من مبيدات الفطريات الكيميائية، ولذلك فإن من المهم فهم طريقة عملها بشكل أفضل لاقتراح تركيبات مناسبة، وتحديد طريقة التطبيق في المجالات، وتحديد المرحلة التنموية للمسبب الممرض المعرضة للمنتج البيولوجي المرشح.
وتشمل النهج الحالية التي تعالج الأنشطة المضادة للبكتيريا والفطريات أساليب الانتشار مثل نشر قرص أغار، والتخفيف، والتصوير البيولوجي، وقياس التدفق الخلوي13. معظم هذه التقنيات ، وبشكل أكثر تحديدا ، فإن اختبار الحساسية القياسية المضادة للفطريات – نشر قرص أجار ومقايسات التخفيف – مكيفة بشكل جيد لتقييم النشاط المضاد للميكروبات للمركبات القابلة للذوبان على الجراثيم البكتيرية والفطرية في التعليق السائل14. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق ليست مناسبة بشكل عام لاختبار المركبات الصلبة مثل مسحوق النبات المجفف أو لتحديد النشاط المضاد للفطريات أثناء نمو الميسيليوم لأنها تتطلب تخفيف البوغ أو انتشار البوغ على لوحات أجار و / أو تخفيف المركبات المضادة للفطريات13. في طريقة تسمم الطعام ، يتم تلقيح لوحات أجار التي تحتوي على العامل المضاد للفطريات مع قرص قطره 5-7 ملم عينات من ثقافة الفطريات القديمة لمدة 7 أيام دون النظر في الكمية الدقيقة لبدء الميسيليوم. بعد الحضانة ، يتم تحديد النشاط المضاد للفطريات على أنه نسبة مئوية من تثبيط النمو الشعاعي17,18,19. مع هذا النهج يمكننا تقييم النشاط المضاد للفطريات على النمو mycelial. وعلى النقيض من ذلك ، يتم تنفيذ طريقة تخفيف أجار لتحديد النشاط المضاد للفطريات على الجراثيم التي تم تلقيحها مباشرة على سطح لوحة أجار التي تحتوي على المركبات المضادة للفطريات13,20,21. يعطي هذان النهجان نتائج تكميلية على النشاط المضاد للفطريات. ومع ذلك هذه هي اثنين من التقنيات المستقلة المستخدمة بالتوازي التي لا توفر مقارنة دقيقة جنبا إلى جنب من الفعالية النسبية للمركبات المضادة للفطريات على الجراثيم والفطريات17,20,22 كما تختلف كمية المواد الفطرية بدءا في النهجين. وعلاوة على ذلك، فإن النشاط المضاد للفطريات للمنتج المشتق من النبات غالبا ما ينتج عن الجمع بين الجزيئات المضادة للفطريات التي توليفها من قبل النباتات لمواجهة مسببات الأمراض. وتشمل هذه الجزيئات البروتينات والببتيدات23,24، ونواتج الأيض وجود التنوع الكيميائي واسعة والانتماء إلى فئات مختلفة من جزيئات مثل البوليفينول، تيربينس، alcaloïds25, الجلوكوزينولات8، ومركبات أورجانوسلفور26. بعض هذه الجزيئات متقلبة أو تصبح متقلبة أثناء هجوم مسببات الأمراض27. هذه العوامل هي في معظم الأحيان سيئة للذوبان في الماء وارتفاع مركبات الضغط بخار التي يتعين استردادها من خلال تقطير المياه والزيوت الأساسية، وبعضها قد ثبت جيدا أنشطتها المضادة للميكروبات28. تم تطوير اختبارات قابلية للتأثر بوساطة مرحلة البخار لقياس النشاط المضاد للميكروبات للمركبات المتطايرة بعد التبخر والهجرة عبر مرحلة البخار29. وتستند هذه الأساليب على إدخال المركبات المضادة للفطريات على مسافة من الثقافة الميكروبية29,30,31,32,33. في المقايسة agar مرحلة بخار شائعة الاستخدام، يتم إيداع الزيوت الأساسية على قرص ورقي ووضعها في وسط غطاء طبق بيتري على مسافة من تعليق بوغ البكتيرية أو الفطرية، والتي تنتشر على المتوسط أجار. ثم يقاس قطر منطقة تثبيط النمو بنفس الطريقة التي تقاس بها طريقة نشر القرص الأغار20,24. وقد تم تطوير نهج أخرى لتوفير قياس كمي للحساسية المضادة للفطريات في مرحلة البخار من الزيوت الأساسية ، المستمدة من طريقة تخفيف المرق التي تم من خلالها حساب نشاط مضاد للميكروبات بوساطة مثبطة على مرحلة البخار32، أو مشتقة من مقايسات نشر قرص أغار31. هذه الأساليب هي عموما محددة لدراسات النشاط مرحلة بخار وغير مناسبة لمقاايسات تثبيط الاتصال. وهذا يحول دون تحديد المساهمة النسبية للعوامل المتطايرة وغير المتطايرة في النشاط المضاد للفطريات لخليط نشط بيولوجيا معقد.
الطريقة الكمية التي طورناها تهدف إلى قياس التأثير المضاد للفطريات لمسحوق النبات المجفف على الكميات الخاضعة للرقابة من الجراثيم وزرع الميسيليوم المودع على سطح وسيط أجار لإعادة إنتاج النمو الجوي للنباتات النباتية أثناء عدوى النباتات15 وكذلك شبكة mycelial مترابطة16. النهج هو إعداد تجريبي معدل يستند إلى أساليب تخفيف أجار ومسمومة بالغذاء التي تسمح أيضا ، في نفس الإعداد التجريبي ، بالتقيم الكمي جنبا إلى جنب لمساهمة كل من الأيضات المضادة للفطريات المتطايرة وغير المتطايرة. في هذه الدراسة ، تم قياس الطريقة مقابل نشاط ثلاثة مستحضرات مضادة للفطريات تتميز بشكل جيد.
Protocol
Representative Results
Discussion
النهج المعروض هنا يسمح لتقييم الخصائص المضادة للفطريات من المنتجات المشتقة من النباتات المعالجة الحد الأدنى. في هذا البروتوكول ، يتم تحقيق توزيع متجانس للجراثيم على سطح أجار باستخدام حبات زجاجية عيار 2 مم. تتطلب هذه الخطوة مهارات التعامل مع توزيع الخرز بشكل صحيح والحصول على نتائج قابلة ل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون جدا لفرانك ييتس على نصيحته الثمينة. تم دعم هذا العمل من قبل سوب للتكنولوجيا الحيوية.
Materials
| Autoclave-vacuclav 24B+ | Melag | ||
| Carbendazim | Sigma | 378674-100G | |
| Distilled water | |||
| Eppendorf tubes | Sarstedt | 72.706 | 1.5 mL |
| Falcons tubes | Sarstedt | 547254 | 50 mL |
| Five millimeters diameter stainless steel tube | retail store | / | |
| Food dehydrator | Sancusto | six trays | |
| Garlic powder | Organic shop | ||
| Glass beads | CLOUP | 65020 |  2 mm |
| Hemocytometer counting cell | Jeulin | 713442 | / |
| Incubator | Memmert | UM400 | 30 °C |
| Knife mill | Bosch | TSM6A013B | |
| Manual cell counter | Labbox | HCNT-001-001 | / |
| Measuring ruler | retail store | ||
| Microbiological safety cabinets | FASTER | FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2 | |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014407 | 100 – 1000 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014411 | 20 – 200 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014412 | 2 – 20 µL |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1194500 | 55 mm |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1473 | 90 mm |
| Pipette Controllers-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
| Potato Dextrose Agar | Sigma | 70139-500G | |
| Precision scale-RADWAG | Grosseron | B126698 | AS220.R2-ML 220g/0.1mg |
| Rake | Sarstedt | 86-1569001 | / |
| Reverse microscope AE31E trinocular | Grosseron | M097917 | / |
| Sterile graduated pipette | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
| Thymus essential oil | Drugstore | Essential oil 100% | |
| Tips 1000 µL | Sarstedt | 70.762010 | |
| Tips 20 µL | Sarstedt | 70.760012 | |
| Tips 200 µL | Sarstedt | 70.760002 | |
| Tooth pick | retail store | ||
| Trichoderma spp strain | Strain of LRPIA laboratory | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379-250ML | |
| Tween-80 | Sigma | P1754-1L | |
| Tweezers | Labbox | FORS-001-002 | / |
References
- FAO. Global food losses and food waste – Extent, causes and prevention. FAO. , (2011).
- da Cruz Cabral, L., Fernández Pinto, V., Patriarca, A. Application of plant compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods. International Journal of Food Microbiology. 166 (1), 1-14 (2013).
- Romanazzi, G., Smilanick, J. L., Feliziani, E., Droby, S. Postharvest biology and technology integrated management of postharvest gray mold on fruit crops. Postharvest Biology and Technology. 113, (2016).
- Morton, V., Staub, T. A Short History of Fungicides. APSnet Feature Articles. (1755), 1-12 (2008).
- Brandhorst, T. T., Klein, B. S. Uncertainty surrounding the mechanism and safety of the post- harvest fungicide Fludioxonil. Food and Chemical Toxicology. 123, 561-565 (2019).
- Bénit, P., et al. Evolutionarily conserved susceptibility of the mitochondrial respiratory chain to SDHI pesticides and its consequence on the impact of SDHIs on human cultured cells. PLoS ONE. 14 (11), 1-20 (2019).
- Usall, J., Torres, R., Teixidó, N. Biological control of postharvest diseases on fruit: a suitable alternative. Current Opinion in Food Science. 11, 51-55 (2016).
- Tripathi, P., Dubey, N. K. Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables. Postharvest Biology and Technology. 32 (3), 235-245 (2004).
- Abbey, J. A., et al. Biofungicides as alternative to synthetic fungicide control of grey mould (Botrytis cinerea)-prospects and challenges. Biocontrol Science and Technology. 29 (3), 241-262 (2019).
- Soylu, E. M., Kurt, &. #. 3. 5. 0. ;., Soylu, S. In vitro and in vivo antifungal activities of the essential oils of various plants against tomato grey mould disease agent Botrytis cinerea. International Journal of Food Microbiology. 143 (3), 183-189 (2010).
- Liu, S., Shao, X., Wei, Y., Li, Y., Xu, F., Wang, H. Solidago canadensis L. essential oil vapor effectively inhibits botrytis cinerea growth and preserves postharvest quality of strawberry as a food model system. Frontiers in Microbiology. 7, 0 (2016).
- El-Mogy, M. M., Alsanius, B. W. Cassia oil for controlling plant and human pathogens on fresh strawberries. Food Control. 28 (1), 157-162 (2012).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Arikan, S. Current status of antifungal susceptibility testing methods. Medical Mycology. 45 (7), 569-587 (2007).
- Girmay, Z., Gorems, W., Birhanu, G., Zewdie, S. Growth and yield performance of Pleurotus ostreatus (Jacq. Fr.) Kumm (oyster mushroom) on different substrates. AMB Express. 6 (1), 87 (2016).
- Fischer, M. S., Glass, N. L. Communicate and fuse: how filamentous fungi establish and maintain an interconnected mycelial network. Frontiers in Microbiology. 10, 1-20 (2019).
- Mohana, D. C., Raveesha, K. A. Anti-fungal evaluation of some plant extracts against some plant pathogenic field and storage fungi. Journal of Agricultural Technology. 4 (1), 119-137 (2007).
- Balamurugan, S. In vitro activity of aurantifolia plant extracts against phytopathogenic fungi phaseolina. International Letters of Natural Sciences. 13, 70-74 (2014).
- Ameziane, N., et al. Antifungal activity of Moroccan plants against citrus fruit pathogens. Agronomy for sustainable development. 27 (3), 273-277 (2007).
- Rizi, K., Murdan, S., Danquah, C. A., Faull, J., Bhakta, S. Development of a rapid, reliable and quantitative method – “SPOTi” for testing antifungal efficacy. Journal of Microbiological Methods. 117, 36-40 (2015).
- Imhof, A., Balajee, S. A., Marr, K., Marr, K. New methods to assess susceptibilities of Aspergillus isolates to caspofungin. Microbiology. 41 (12), 5683-5688 (2003).
- Goussous, S. J., Abu el-Samen, F. M., Tahhan, R. A. Antifungal activity of several medicinal plants extracts against the early blight pathogen (Alternaria solani). Archives of Phytopathology and Plant Protection. 43 (17), 1745-1757 (2010).
- Ng, T. B. Antifungal proteins and peptides of leguminous and non-leguminous origins. Peptides. 25 (7), 1215-1222 (2004).
- Hu, Z., Zhang, H., Shi, K. Plant peptides in plant defense responses. Plant Signaling and Behavior. 13 (8), (2018).
- Iriti, M., Faoro, F. Chemical diversity and defence metabolism: How plants cope with pathogens and ozone pollution. International Journal of Molecular Sciences. 10 (8), 3371-3399 (2009).
- Lanzotti, V., Bonanomi, G., Scala, F. What makes Allium species effective against pathogenic microbes. Phytochemistry Reviews. 12 (4), 751-772 (2013).
- Kyung, K. H. Antimicrobial properties of allium species. Current Opinion in Biotechnology. 23 (2), 142-147 (2012).
- Hyldgaard, M., Mygind, T., Meyer, R. L. Essential oils in food preservation: mode of action, synergies, and interactions with food matrix components. Frontiers in microbiology. 3, 12 (2012).
- Bueno, J. Models of evaluation of antimicrobial activity of essential oils in vapour phase: a promising use in healthcare decontamination. Natural Volatiles & Essential Oils. 2 (2), 16-29 (2015).
- Doi, N. M., Sae-Eaw, A., Suppakul, P., Chompreeda, P. Assessment of synergistic effects on antimicrobial activity in vapour- and liquidphase of cinnamon and oregano essential oils against Staphylococcus aureus. International Food Research Journal. 26 (2), 459-467 (2019).
- Amat, S., Baines, D., Alexander, T. W. A vapour phase assay for evaluating the antimicrobial activities of essential oils against bovine respiratory bacterial pathogens. Letters in Applied Microbiology. 65 (6), 489-495 (2017).
- Feyaerts, A. F., et al. Essential oils and their components are a class of antifungals with potent vapour-phase-mediated anti-Candida activity. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Wang, T. H., Hsia, S. M., Wu, C. H., Ko, S. Y., Chen, M. Y., Shih, Y. H., Shieh, T. M., Chuang, L. C. Evaluation of the antibacterial potential of liquid and vapor phase phenolic essential oil compounds against oral microorganisms. PLoS ONE. 11 (9), 1-17 (2016).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Leadbeater, A. Recent developments and challenges in chemical disease control. Plant Protection Science. 51 (4), 163-169 (2015).
- Jin, C., Zeng, Z., Fu, Z., Jin, Y. Oral imazalil exposure induces gut microbiota dysbiosis and colonic inflammation in mice. Chemosphere. 160, 349-358 (2016).
- Kumar, R., Ghatak, A., Balodi, R., Bhagat, A. P. Decay mechanism of postharvest pathogens and their management using non-chemical and biological approaches. Journal of Postharvest Technology. 6 (1), 1-11 (2018).
- Talibi, I., Boubaker, H., Boudyach, E. H., Ait Ben Aoumar, A. Alternative methods for the control of postharvest citrus diseases. Journal of Applied Microbiology. 117 (1), 1-17 (2014).
- Arya, R., Sharma, R., Malhotra, M., Kumar, V., Sharma, A. K. Biodegradation Aspects of Carbendazim and Sulfosulfuron: Trends, Scope and Relevance. Current Medicinal Chemistry. 22 (9), 1147-1155 (2015).
- European Food Safety Authority. Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance carbendazim. EFSA Journal. 8 (5), 1-76 (2010).
- Sakkas, H., Papadopoulou, C. Antimicrobial activity of basil, oregano, and thyme essential oils. Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (3), 429-438 (2017).
- Steyaert, J. M., Weld, R. J., Mendoza-Mendoza, A., Stewart, A. Reproduction without sex: conidiation in the filamentous fungus Trichoderma. Microbiology. 156, 2887-2900 (2010).
- Leontiev, R., Hohaus, N., Jacob, C., Gruhlke, M. C. H., Slusarenko, A. J. A Comparison of the antibacterial and antifungal activities of thiosulfinate analogues of allicin. Scientific Reports. 8 (1), 1-19 (2018).
- Scorzoni, L., et al. The use of standard methodology for determination of antifungal activity of natural products against medical yeasts Candida sp and Cryptococcus sp. Brazilian Journal of Microbiology. 38 (3), 391-397 (2007).
