Medindo atividade antifúngica volátil e não volátil de produtos de biocontrole

Summary

Descrevemos um método modificado à base de ágar projetado para quantificar os efeitos antifúngicos de produtos derivados de plantas. Tanto contribuições voláteis quanto não voláteis para a atividade antifúngica podem ser avaliadas através deste protocolo. Além disso, a eficácia contra fungos pode ser medida em estágios-chave de desenvolvimento em uma única configuração experimental.

Abstract

O protocolo descrito baseia-se em uma técnica de transferência de plug-plug que permite a determinação precisa das quantidades de microrganismos e seus estágios de desenvolvimento. Um número especificado de esporos estão espalhados em uma placa de ágar. Esta placa de ágar é incubada por um período definido para permitir que os fungos atinjam o estágio de desenvolvimento esperado, exceto para esporos onde a incubação não é necessária. Os plugues ágar cobertos por esporos, hifas ou micélio são retirados e transferidos para a mídia ágar contendo o composto antifúngico a ser testado a uma distância dos fungos ou em contato. Este método é aplicável para testar tanto extratos líquidos quanto amostras sólidas (pós). É particularmente adequado para quantificar as contribuições relativas de agentes voláteis e não voláteis em misturas bioativas e para determinar seus efeitos, especificamente sobre esporos, higiais precoces e micélio.

O método é altamente relevante para a caracterização da atividade antifúngica de produtos de biocontrole, notadamente produtos derivados de plantas. De fato, para o tratamento da estação, os resultados podem ser usados para orientar a escolha do modo de aplicação e estabelecer os limiares de gatilho.

Introduction

As perdas globais de frutas e hortaliças podem atingir até 50% da produção¹ e resultar principalmente da decadência alimentar causada pela deterioração de fungos no campo ou durante o armazenamento pós-colheita^2,3, apesar do amplo emprego de fungicidas sintéticas desde meados do século^{XX 4}. O uso dessas substâncias está sendo reconsiderado, pois representa sérios riscos ambientais e à saúde. Como as consequências nocivas de seu uso estão aparecendo em todos os ecossistemas e evidências de potenciais impactos à saúde acumularam^5,6, novas alternativas às velhas estratégias profiláticas estão sendo desenvolvidas para tratamentos pré e pós-colheita^7,8,9. Por isso, o desafio que enfrentamos é duplo. Novas estratégias fungicidas devem, em primeiro lugar, manter os níveis de eficácia da proteção alimentar contra fitopatógenos e, em segundo lugar, contribuir para reduzir drasticamente a pegada ambiental das práticas agrícolas. Para cumprir esse objetivo ambicioso, estratégias inspiradas nas defesas naturais evoluídas nas plantas estão sendo propostas, pois mais de 1000 espécies de plantas foram destacadas por suas propriedades antimicrobianas⁸. Por exemplo, plantas que desenvolveram fungicidas naturais para combater fitopatógenos são um novo recurso na exploração do desenvolvimento de novos produtos de biocontrole². Óleos essenciais são moléculas emblemáticas desse tipo. Por exemplo, o óleo essencial origanum protege as plantas de tomate contra o molde cinza nas estufas ¹⁰ e solidago canadensis L. e óleos essenciais cássia têm sido mostrados para preservar morangos pós-colhidos de danos de moldes cinzentos^11,12. Esses exemplos ilustram que o biocontrole e, notadamente, os produtos derivados das plantas representam uma solução que combina eficácia biológica e sustentabilidade ambiental.

Assim, as plantas são um importante recurso de moléculas de potencial interesse para a indústria de proteção de culturas. No entanto, apenas um punhado de produtos vegetais foram propostos para serem usados como produtos de biocontrole, embora sejam geralmente reconhecidos como seguros, não fitóxicos e ecológicos². Algumas dificuldades na transposição do laboratório para o campo têm sido observadas, como a eficácia diminuindo uma vez aplicada in vivo^2,9. Assim, torna-se importante melhorar a capacidade dos testes de laboratório para melhor prever a eficácia do campo. Neste contexto, métodos de teste antifúngicos para produtos derivados de plantas são necessários tanto para avaliar sua eficácia antifúngica quanto para definir suas condições ideais de uso. Especificamente, os produtos de biocontrole são geralmente menos eficientes do que fungicidas químicos, por isso uma melhor compreensão de seu modo de ação é importante para propor formulações adequadas, identificar o modo de aplicação nos campos e definir qual estágio de desenvolvimento do patógeno é vulnerável ao bioproduto candidato.

As abordagens atuais que abordam atividades antibacterianas e antifúngicas incluem métodos de difusão, como difusão de disco de ágar, diluição, bioautografia e citometria de fluxo¹³. A maioria dessas técnicas, e mais especificamente, os testes padrão de suscetibilidade antifúngicos – ensaios de difusão e diluição de ágar-disco – são bem adaptados para avaliar a atividade antimicrobiana de compostos solúveis em esporos bacterianos e fúngicos em suspensões líquidas¹⁴. No entanto, esses métodos geralmente não são adequados para testar compostos sólidos, como pó vegetal seco ou para quantificar a atividade antifúngica durante o crescimento do micélio, pois requerem diluição de esporos ou esporos espalhados em placas de ágar e/ou diluição de compostos antifúngicos¹³. No método envenenado por alimentos, as placas de ágar contendo o agente antifúngico são inoculadas com um disco de 5-7 mm de diâmetro amostrado de uma cultura de fungos de 7 dias de idade sem considerar a quantidade precisa de micélio inicial. Após a incubação, a atividade antifúngica é determinada como um por cento da inibição do crescimento radial^17,18,19. Com essa abordagem podemos avaliar a atividade antifúngica no crescimento micelial. Em contraste, o método de diluição de ágar é realizado para determinar a atividade antifúngica em esporos diretamente inoculados na superfície da placa de ágar contendo os compostos antifúngicos^13,20,21. Essas duas abordagens dão resultados complementares sobre a atividade antifúngica. No entanto, estas são duas técnicas independentes usadas em paralelo que não fornecem comparação lado a lado precisa da eficácia relativa dos compostos antifúngicos em esporos e micélio^17,20,22 como a quantidade de material fúngico inicial difere nas duas abordagens. Além disso, a atividade antifúngica de um produto derivado de plantas muitas vezes resulta da combinação de moléculas antifúngicas sintetizadas pelas plantas para enfrentar patógenos. Essas moléculas abrangem proteínas, peptídeos^23,24, e metabólitos com ampla diversidade química e pertencentes a diferentes classes de moléculas como polifenóis, terpenos, alcaloïds²⁵, glucosinolas⁸, e compostos organosulfur²⁶. Algumas dessas moléculas são voláteis ou se tornam voláteis durante o ataque de patógenos²⁷. Esses agentes são, na maioria das vezes, compostos solúveis em água e alta pressão de vapor que devem ser recuperados através da destilação da água como óleos essenciais, alguns dos quais atividades antimicrobianas foram bem estabelecidas²⁸. Ensaios de suscetibilidade mediados em fase de vapor foram desenvolvidos para medir a atividade antimicrobiana de compostos voláteis após a evaporação e migração através da fase de vapor²⁹. Esses métodos baseiam-se na introdução de compostos antifúngicos à distância da cultura microbiana^{29,30,31,32,33}. No ensaio ágar comumente usado em fase de vapor, óleos essenciais são depositados em um disco de papel e colocados no centro da tampa da placa de Petri à distância da suspensão de esporos bacterianos ou fúngicos, que é espalhada no meio ágar. O diâmetro da zona de inibição do crescimento é então medido da mesma forma que para o método de difusão do disco de ágar^20,24. Outras abordagens foram desenvolvidas para fornecer a medição quantitativa da suscetibilidade antifúngica da fase vapor de óleos essenciais, derivadas do método de diluição do caldo do qual foi calculada uma atividade antimicrobiana mediada por vapor inibitório³², ou derivado de ensaios de difusão de ágar-disco³¹. Esses métodos são geralmente específicos para estudos de atividade em fase de vapor e não são apropriados para ensaios de inibição de contato. Isso exclui a determinação da contribuição relativa de agentes voláteis e não voláteis para a atividade antifúngica de uma complexa mistura bioativa.

O método quantitativo que desenvolvemos visa medir o efeito antifúngico do pó de plantas secas em quantidades controladas de esporos e micélio cultivado depositado na superfície de um meio de ágar para reproduzir o crescimento aéreo de fitopatógenos durante a infecção das plantas^15, bem como uma rede mycelial interconectada¹⁶. A abordagem é uma configuração experimental modificada baseada nos métodos de diluição de ágar e alimentos envenenados que também permite, na mesma configuração experimental, quantificação lado a lado da contribuição de metabólitos antifúngicos voláteis e não voláteis. Neste estudo, o método foi avaliado em relação à atividade de três preparações antifúngicas bem caracterizadas.

Protocol

1. Preparação de inócula Antes do experimento, estava 5 μL de Trichoderma spp. Os esporos SBT10-2018 armazenados a 4 °C no natural de ágar médio (PDA) e incubam por 4 dias a 30°C com exposição regular à luz para promover a formação conidia42 (Figura 1, painel A).NOTA: Trichoderma spp. O SBT10-2018 foi isolado da madeira e é usado como modelo neste estudo para seu rápido crescimento e facilidade de recuperação de esporos…

Representative Results

Para avaliar a capacidade do método quantitativo de discriminar o modo de ação de diferentes tipos de compostos antifúngicos, comparamos a eficácia de três agentes antifúngicos conhecidos. Carbendazim é um fungicida sintético não volátil que tem sido amplamente utilizado para controlar uma ampla gama de doenças fúngicas nas plantas39,40. O óleo essencial de timo vulgar foi descrito em grande parte por sua atividade antibacteriana e antifún…

Discussion

A abordagem aqui apresentada permite a avaliação de propriedades antifúngicas de produtos minimamente processados derivados de plantas. Neste protocolo, a distribuição homogênea dos esporos na superfície do ágar é alcançada utilizando contas de vidro de 2 mm. Esta etapa requer habilidades de manuseio para distribuir corretamente as contas e obter resultados reprodutíveis, permitindo, em última análise, a comparação de efeitos antifúngicos em diferentes estágios de crescimento fúngico. Descobrimos que co…

Materials

Autoclave-vacuclav 24B+	Melag
Carbendazim	Sigma	378674-100G
Distilled water
Eppendorf tubes	Sarstedt	72.706	1.5 mL
Falcons tubes	Sarstedt	547254	50 mL
Five millimeters diameter stainless steel tube	retail store		/
Food dehydrator	Sancusto		six trays
Garlic powder	Organic shop
Glass beads	CLOUP	65020	2 mm
Hemocytometer counting cell	Jeulin	713442	/
Incubator	Memmert	UM400	30 °C
Knife mill	Bosch	TSM6A013B
Manual cell counter	Labbox	HCNT-001-001	/
Measuring ruler	retail store
Microbiological safety cabinets	FASTER		FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2
Micropipette	Mettler-Toledo	17014407	100 – 1000 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014411	20 – 200 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014412	2 – 20 µL
Petri dish	Sarstedt	82-1194500	55 mm
Petri dish	Sarstedt	82-1473	90 mm
Pipette Controllers-EASY 60	Labbox	EASY-P60-001	/
Potato Dextrose Agar	Sigma	70139-500G
Precision scale-RADWAG	Grosseron	B126698	AS220.R2-ML 220g/0.1mg
Rake	Sarstedt	86-1569001	/
Reverse microscope AE31E trinocular	Grosseron	M097917	/
Sterile graduated pipette	Sarstedt	1254001	10 mL
Thymus essential oil	Drugstore		Essential oil 100%
Tips 1000 µL	Sarstedt	70.762010
Tips 20 µL	Sarstedt	70.760012
Tips 200 µL	Sarstedt	70.760002
Tooth pick	retail store
Trichoderma spp strain			Strain of LRPIA laboratory
Tween-20	Sigma	P1379-250ML
Tween-80	Sigma	P1754-1L
Tweezers	Labbox	FORS-001-002	/