Summary

Mesure de l’activité antifongique volatile et non volatile des produits de lutte biologique

Published: December 05, 2020
doi:

Summary

Nous décrivons une méthode modifiée à base d’agar conçue pour quantifier les effets antifongiques des produits dérivés des plantes. Les contributions volatiles et non volatiles à l’activité antifongique peuvent être évaluées par ce protocole. En outre, l’efficacité contre les champignons peut être mesurée à des stades clés de développement dans une seule configuration expérimentale.

Abstract

Le protocole décrit est basé sur une technique de plug-transfer qui permet une détermination précise des quantités de micro-organismes et de leurs stades de développement. Un certain nombre de spores sont réparties sur une plaque d’agar. Cette plaque d’agar est incubée pendant une période définie pour permettre aux champignons d’atteindre le stade de développement prévu, à l’exception des spores où l’incubation n’est pas nécessaire. Les bouchons d’agar couverts de spores, d’hyphes ou de mycélium sont ensuite retirés et transférés sur des supports d’agar contenant le composé antifongique à tester soit à une distance des champignons, soit en contact. Cette méthode est applicable pour tester à la fois les extraits liquides et les échantillons solides (poudres). Il est particulièrement bien adapté pour quantifier les contributions relatives des agents volatils et non volatils dans les mélanges bioactifs et pour déterminer leurs effets, spécifiquement sur les spores, les hyphes précoces et le mycélium.

La méthode est très pertinente pour la caractérisation de l’activité antifongique des produits de lutte biologique, notamment les produits dérivés des plantes. En effet, pour le traitement des plantes, les résultats peuvent être utilisés pour guider le choix du mode d’application et pour établir les seuils de déclenchement.

Introduction

Les pertes mondiales de fruits et légumes peuvent atteindre jusqu’à 50 % de la production1 et résulter principalement de la décomposition des aliments causée par la détérioration des champignons sur le terrain ou pendant le stockage post-récolte2,3, malgré l’emploi important de fongicides synthétiques depuis le milieu du XXe siècle4. L’utilisation de ces substances est réexaminée puisqu’elle représente de graves risques pour l’environnement et la santé. Comme les conséquences néfastes de leur utilisation se manifestent dans tous les écosystèmes et que des preuves d’impacts potentiels sur la santése sont accumulées 5,6, de nouvelles alternatives aux anciennes stratégies prophylactiques sont en cours d’élaboration pour les traitements pré et post-récolte7,8,9. Par conséquent, le défi auquel nous sommes confrontés est double. Les nouvelles stratégies fongicides doivent, premièrement, maintenir les niveaux d’efficacité de la protection alimentaire contre les phytopathogènes et, en même temps, contribuer, deuxièmement, à réduire considérablement l’empreinte environnementale des pratiques agricoles. Pour atteindre cet objectif ambitieux, des stratégies inspirées par les défenses naturelles évoluées dans les plantes sont proposées car plus de 1000 espèces végétales ont été mises en évidence pour leurs propriétés antimicrobiennes8. Par exemple, les plantes qui ont développé des fongicides naturels pour lutter contre les phytopathogènes sont une ressource nouvelle dans l’exploration du développement de nouveaux produits de lutte biologique2. Les huiles essentielles sont des molécules phares de ce type. Par exemple, l’huile essentielle d’Origanum protège les plants de tomates contre la moisissure grise dans les serres 10 et solidago canadensis L. et cassia huiles essentielles ont été montrés pour préserver les fraises post-récolte de dommages moulegris 11,12. Ces exemples illustrent que le biocontrôle et notamment les produits dérivés des plantes représentent une solution qui combine efficacité biologique et durabilité environnementale.

Ainsi, les plantes sont une ressource importante de molécules d’intérêt potentiel pour l’industrie de la protection des cultures. Toutefois, seule une poignée de produits végétaux ont été proposés pour être utilisés comme produits de lutte biologique, même s’ils sont généralement reconnus comme sûrs, non phytotoxiques et respectueux del’environnement 2. Certaines difficultés dans la transposition du laboratoire au champ ont été observées, comme la diminution de l’efficacité une fois appliquée in vivo2,9. Ainsi, il devient important d’améliorer la capacité des tests de laboratoire à mieux prédire l’efficacité sur le terrain. Dans ce contexte, des méthodes d’essai antifongiques pour les produits dérivés des plantes sont nécessaires à la fois pour évaluer leur efficacité antifongique et pour définir leurs conditions optimales d’utilisation. Plus précisément, les produits de lutte biologique sont généralement moins efficaces que les fongicides chimiques, de sorte qu’une meilleure compréhension de leur mode d’action est importante pour proposer des formulations appropriées, pour identifier le mode d’application dans les champs et pour définir quel stade de développement de l’agent pathogène est vulnérable au bioproduit candidat.

Les approches actuelles portant sur les activités antibactériennes et antifongiques comprennent des méthodes de diffusion telles que la diffusion du disque d’agar, la dilution, la bioautographie et la cytométrie des flux.13. La plupart de ces techniques, et plus particulièrement, les tests de susceptibilité antifongique standard – analyse de diffusion et de dilution du disque d’agar – sont bien adaptés pour évaluer l’activité antimicrobienne des composés solubles sur les spores bactériennes et fongiques dans les suspensions liquides.14. Toutefois, ces méthodes ne conviennent généralement pas aux essais de composés solides tels que la poudre de plantes séchées ou à quantifier l’activité antifongique pendant la croissance du mycélium, car elles nécessitent une dilution des spores ou une propagation des spores sur les plaques d’agar et/ou une dilution des composés antifongiques.13. Dans la méthode empoisonnée par la nourriture, les plaques d’agar contenant l’agent antifongique sont inoculées avec un disque de 5-7 mm de diamètre échantillonné à partir d’une culture de champignons de 7 jours sans tenir compte de la quantité précise de mycélium de départ. Après incubation, l’activité antifongique est déterminée comme un pourcentage d’inhibition de la croissance radiale17,18,19. Avec cette approche, nous pouvons évaluer l’activité antifongique sur la croissance mycéliale. En revanche, la méthode de dilution de l’agar est effectuée pour déterminer l’activité antifongique sur les spores directement inoculées à la surface de la plaque d’agar contenant les composés antifongiques13,20,21. Ces deux approches donnent des résultats complémentaires sur l’activité antifongique. Toutefois, il s’agit de deux techniques indépendantes utilisées en parallèle qui ne permettent pas de comparer côte à côte avec précision l’efficacité relative des composés antifongiques sur les spores et le mycélium.17,20,22 comme la quantité de matériel fongique de départ diffère dans les deux approches. En outre, l’activité antifongique d’un produit dérivé des plantes résulte souvent de la combinaison de molécules antifongiques synthétisées par les plantes pour faire face à des agents pathogènes. Ces molécules englobent les protéines, les peptides23,24, et les métabolites ayant une grande diversité chimique et appartenant à différentes classes de molécules telles que les polyphénols, terpènes, alcaloïdes25, glucosinolates8, et les composés organosulfurés26. Certaines de ces molécules sont volatiles ou deviennent volatiles lors d’une attaque d’agents pathogènes27. Ces agents sont le plus souvent des composés solubles dans l’eau et à haute pression de vapeur qui doivent être récupérés par distillation de l’eau sous forme d’huiles essentielles, dont certaines activités antimicrobiennes ont été bien établies.28. Des essais de susceptibilité 2métras par phase de vapeur ont été mis au point pour mesurer l’activité antimicrobienne des composés volatils après l’évaporation et la migration par la phase de vapeur29. Ces méthodes sont basées sur l’introduction de composés antifongiques à distance de la culture microbienne29,30,31,32,33. Dans l’analyse couramment utilisée de l’agar en phase de vapeur, les huiles essentielles sont déposées sur un disque de papier et placées au centre de la couverture de la boîte de Pétri à distance de la suspension bactérienne ou fongique des spores, qui se propage sur le milieu de l’agar. Le diamètre de la zone d’inhibition de croissance est ensuite mesuré de la même manière que pour la méthode de diffusion du disque d’agar20,24. D’autres approches ont été développées pour fournir une mesure quantitative de la susceptibilité antifongique de phase de vapeur des huiles essentielles, dérivée de la méthode de dilution du bouillon à partir de laquelle une activité antimicrobienne ment mentée en phase de vapeur inhibitrice a été calculée32, ou dérivé d’analyses de diffusion de disque d’agar31. Ces méthodes sont généralement spécifiques aux études d’activité en phase de vapeur et ne conviennent pas aux essais d’inhibition de contact. Cela empêche la détermination de la contribution relative d’agents volatils et non volatils à l’activité antifongique d’un mélange bioactif complexe.

La méthode quantitative que nous avons développée vise à mesurer l’effet antifongique de la poudre de plantes séchées sur des quantités contrôlées de spores et de mycélium cultivé déposé à la surface d’un milieu d’agar pour reproduire la croissance aérienne des phytopathogènes lors de l’infectiondes plantes 15 ainsi qu’un réseau mycélial interconnecté16. L’approche est une configuration expérimentale modifiée basée sur la dilution de l’agar et les méthodes empoisonnées par les aliments qui permet également, dans la même configuration expérimentale, la quantification côte à côte de la contribution des métabolites antifongiques volatils et non volatils. Dans cette étude, la méthode a été comparée à l’activité de trois préparations antifongiques bien caractérisées.

Protocol

1. Préparation d’Inocula Avant l’expérience, 5 μL de Trichoderma spp. Spores de SBT10-2018 stockées à 4 °C sur le milieu de l’agar dextrose de pomme de terre (PDA) et incuber pendant 4 jours à 30 °C avec exposition régulière à la lumière pour favoriser la formation de conidies42 (figure 1, panneau A).NOTE: Trichoderma spp. Le SBT10-2018 a été isolé du bois et est utilisé comme modèle dans cette étude pour sa croi…

Representative Results

Pour évaluer la capacité de la méthode quantitative à discriminer le mode d’action de différents types de composés antifongiques, nous avons comparé l’efficacité de trois agents antifongiques bien connus. Carbendazim est un fongicide synthétique non volatil qui a été largement utilisé pour contrôler un large éventail de maladies fongiques chez les plantes39,40. Thymus vulgaris huile essentielle a été largement décrit pour son activit…

Discussion

L’approche présentée ici permet d’évaluer les propriétés antifongiques des produits dérivés de plantes peu transformés. Dans ce protocole, la distribution homogène des spores à la surface de l’agar est obtenue à l’aide de perles de verre de 2 mm. Cette étape nécessite des compétences de manipulation pour distribuer correctement les perles et d’obtenir des résultats reproductibles, permettant finalement la comparaison des effets antifongiques à différents stades de la croissance fongique. Nous a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes très reconnaissants à Frank Yates pour ses précieux conseils. Ce travail a été soutenu par Sup’Biotech.

Materials

Autoclave-vacuclav 24B+ Melag
Carbendazim Sigma  378674-100G
Distilled water
Eppendorf tubes Sarstedt 72.706 1.5 mL
Falcons tubes Sarstedt 547254 50 mL
Five millimeters diameter stainless steel tube retail store /
Food dehydrator Sancusto six trays
Garlic powder Organic shop
Glass beads CLOUP 65020 Equation 1 2 mm
Hemocytometer counting cell Jeulin 713442 /
Incubator Memmert  UM400 30 °C
Knife mill Bosch TSM6A013B
Manual cell counter Labbox HCNT-001-001 /
Measuring ruler retail store
Microbiological safety cabinets FASTER FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2
Micropipette Mettler-Toledo 17014407 100 – 1000 µL
Micropipette Mettler-Toledo 17014411 20 – 200 µL
Micropipette Mettler-Toledo 17014412 2 – 20 µL
Petri dish Sarstedt 82-1194500 Equation 1 55 mm
Petri dish Sarstedt 82-1473  Equation 1 90 mm
Pipette Controllers-EASY 60 Labbox EASY-P60-001 /
Potato Dextrose Agar Sigma  70139-500G
Precision scale-RADWAG Grosseron B126698 AS220.R2-ML 220g/0.1mg 
Rake Sarstedt 86-1569001 /
Reverse microscope AE31E trinocular Grosseron M097917 /
Sterile graduated pipette Sarstedt 1254001 10 mL
Thymus essential oil Drugstore Essential oil 100%
Tips 1000 µL  Sarstedt 70.762010
Tips 20 µL  Sarstedt 70.760012
Tips 200 µL Sarstedt 70.760002
Tooth pick retail store
Trichoderma spp strain Strain of LRPIA laboratory
Tween-20  Sigma  P1379-250ML
Tween-80 Sigma  P1754-1L
Tweezers Labbox FORS-001-002 /

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Cite This Article
Gligorijevic, V., Benel, C., Gonzalez, P., Saint-Pol, A. Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products. J. Vis. Exp. (166), e61798, doi:10.3791/61798 (2020).

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