Meten van vluchtige en niet-vluchtige antischimmelactiviteit van Biocontrol-producten

Summary

We beschrijven een aangepaste methode op basis van agar die is ontworpen om de antischimmeleffecten van plantaardige producten te kwantificeren. Zowel volatiele als niet-volatiele bijdragen aan de antischimmelactiviteit kunnen via dit protocol worden beoordeeld. Bovendien kan de werkzaamheid tegen schimmels worden gemeten in belangrijke ontwikkelingsstadia in één experimentele opstelling.

Abstract

Het beschreven protocol is gebaseerd op een plug-transfer techniek die nauwkeurige bepaling van micro-organismenhoeveelheden en hun ontwikkelingsstadia mogelijk maakt. Een bepaald aantal sporen wordt verspreid op een agarplaat. Deze agarplaat wordt gedurende een bepaalde periode geïncubeerd om de schimmels in staat te stellen het verwachte ontwikkelingsstadium te bereiken, behalve voor sporen waar incubatie niet vereist is. Agarpluggen bedekt met sporen, hyphae of mycelium worden vervolgens teruggetrokken en overgebracht naar agarmedia die de antischimmelverbinding bevatten die moet worden getest, hetzij op afstand van de schimmels, hetzij in contact. Deze methode is van toepassing op het testen van zowel vloeibare extracten als vaste monsters (poeders). Het is bijzonder geschikt voor het kwantificeren van de relatieve bijdragen van vluchtige en niet-vluchtige agentia in bioactieve mengsels en voor het bepalen van hun effecten, met name op sporen, vroege hyphae en mycelium.

De methode is zeer relevant voor de karakterisering van de antischimmelactiviteit van biocontroleproducten, met name plantaardige producten. Voor de behandeling van planten kunnen de resultaten inderdaad worden gebruikt om de keuze van de toepassingswijze te begeleiden en om de triggerdrempels vast te stellen.

Introduction

Wereldwijde verliezen van groenten en fruit kunnen oplopen tot 50% van productie¹ en zijn voornamelijk het gevolg van voedselbederf veroorzaakt door schimmelbederf in het veld of tijdens opslag na de oogst^2,3, ondanks de uitgebreide werkgelegenheid van synthetische fungiciden sinds het midden van de twintigste eeuw⁴. Het gebruik van deze stoffen wordt heroverwogen omdat het ernstige gevaren voor het milieu en de gezondheid met zich mee brengt. Aangezien de schadelijke gevolgen van het gebruik ervan in ecosystemen zichtbaar zijn en het bewijs van mogelijke gevolgen voor de gezondheid zich heeft opgehoopt^5,6, worden nieuwe alternatieven voor oude profylactische strategieën ontwikkeld voor pre – en post-harvest behandelingen^7,8,9. Vandaar dat de uitdaging waar we voor staan tweeledig is. Nieuwe fungicide strategieën moeten ten eerste de werkzaamheid van voedselbescherming tegen fytopathogenen handhaven en tegelijkertijd bijdragen tot een drastische vermindering van de ecologische voetafdruk van landbouwpraktijken. Om dit ambitieuze doel te bereiken, worden strategieën voorgesteld die zijn geïnspireerd op de natuurlijke afweer die in planten is geëvolueerd, aangezien meer dan 1000 plantensoorten zijn gemarkeerd vanwege hun antimicrobiële eigenschappen⁸. Planten die bijvoorbeeld natuurlijke fungiciden hebben ontwikkeld om fytopathogenen te bestrijden, zijn een nieuwe bron bij het verkennen van de ontwikkeling van nieuwe biocontroleproducten². Etherische oliën zijn vlaggenschipmoleculen van dit type. Bijvoorbeeld, Origanum essentiële olie beschermt tomatenplanten tegen grijze schimmel in kassen ¹⁰ en Solidago canadensis L. en cassia essentiële oliën zijn aangetoond dat het bewaren van nageoogst aardbeien tegen grijze schimmel schade^11,12. Deze voorbeelden illustreren dat biocontrole en met name plantaardige producten een oplossing vormen die biologische werkzaamheid en ecologische duurzaamheid combineert.

Planten zijn dus een belangrijke bron van moleculen die van potentieel belang zijn voor de gewasbeschermingsindustrie. Er is echter slechts een handvol plantaardige producten voorgesteld om als biocontroleproducten te worden gebruikt, ook al worden zij algemeen erkend als veilig, niet-fytotoxisch en milieuvriendelijk². Er zijn enkele problemen waargenomen bij de omzetting van het laboratorium naar het veld , zoals een afname van de werkzaamheid na toepassing in vivo^2,9. Het wordt dus belangrijk om het vermogen van laboratoriumtests te verbeteren om de veldefficiëntie beter te voorspellen. In dit verband zijn antischimmeltestmethoden voor plantaardige producten nodig, zowel om hun antischimmeleffectiviteit te evalueren als om hun optimale gebruiksomstandigheden te definiëren. In het bijzonder zijn biocontroleproducten over het algemeen minder efficiënt dan chemische fungiciden, dus een beter begrip van hun werkingswijze is belangrijk voor het voorstellen van geschikte formuleringen, om de wijze van toepassing op gebieden te identificeren en om te bepalen welke ontwikkelingsfase van de ziekteverwekker kwetsbaar is voor het kandidaat-bioproduct.

Huidige benaderingen die antibacteriële en schimmelwerende activiteiten aanpakken, omvatten diffusiemethoden zoals agar-schijfdiffusie, verdunning, bioautografie en flowcytometrie¹³. De meeste van deze technieken, en meer in het bijzonder, de standaard antischimmelgevoeligheidstests – agarschijfdiffusie en verdunningstests – zijn goed aangepast voor het evalueren van de antimicrobiële activiteit van oplosbare verbindingen op bacteriële en schimmelsporen in vloeibare suspensuspensus¹⁴. Deze methoden zijn echter over het algemeen niet geschikt voor het testen van vaste verbindingen zoals gedroogd plantenpoeder of voor het kwantificeren van antischimmelactiviteit tijdens de groei van mycelium, omdat ze sporenverdunning of sporenverspreiding op agarplaten en/of verdunning van antischimmelverbindingen vereisen¹³. In de met voedsel vergiftigde methode worden agarplaten met het antischimmelmiddel ingeënt met een schijf met een diameter van 5-7 mm die is bemonsterd uit een 7-daagse oude schimmelcultuur zonder rekening te houden met de precieze hoeveelheid starten van mycelium. Na incubatie wordt de antischimmelactiviteit bepaald als een percentage van de radiale groeiremming^17,18,19. Met deze aanpak kunnen we de antischimmelactiviteit op myceliale groei evalueren. De agarverdunningsmethode wordt daarentegen uitgevoerd om de antischimmelactiviteit te bepalen op sporen die direct zijn ingeënt op het oppervlak van de agarplaat die de antischimmelverbindingen bevat^13,20,21. Deze twee benaderingen geven complementaire resultaten op antischimmelactiviteit. Dit zijn echter twee onafhankelijke technieken die parallel worden gebruikt en die geen nauwkeurige vergelijking naast elkaar bieden van de relatieve werkzaamheid van antischimmelverbindingen op sporen en mycelium^17,20,22 omdat de hoeveelheid beginnend schimmelmateriaal verschilt in de twee benaderingen. Bovendien is de antischimmelactiviteit van een plantaardig product vaak het gevolg van de combinatie van antischimmelmoleculen die door planten worden gesynthetiseerd om ziekteverwekkers onder ogen te zien. Deze moleculen omvatten eiwitten, peptiden^23,24, en metabolieten met een grote chemische diversiteit en behorend tot verschillende klassen moleculen zoals polyfenolen, terpenen, alcaloïden²⁵, glucosinolaten⁸, en organosulfurverbindingen²⁶. Sommige van deze moleculen zijn vluchtig of worden vluchtig tijdens een aanval van ziekteverwekkers²⁷. Deze middelen zijn meestal slecht in water oplosbare en hoge dampdrukverbindingen die moeten worden teruggewonnen door waterdestillatie als essentiële oliën, waarvan sommige antimicrobiële activiteiten goed zijn vastgesteld²⁸. Dampfase gemedieerde gevoeligheidstesten zijn ontwikkeld om de antimicrobiële activiteit van vluchtige stoffen na verdamping en migratie via de dampfase te meten²⁹. Deze methoden zijn gebaseerd op de introductie van antischimmelverbindingen op afstand van de microbiële cultuur^{29,30,31,32,33}. In de veelgebruikte dampfase agartest worden essentiële oliën op een papierschijf afgezet en in het midden van de deksel van de Petrischaal geplaatst op afstand van de bacteriële of schimmelspoorsuspensie, die wordt verspreid op agarmedium. De diameter van de zone van groeiremming wordt vervolgens op dezelfde manier gemeten als voor de agar-schijfdiffusiemethode^20,24. Er zijn andere benaderingen ontwikkeld om kwantitatieve meting te bieden van de dampfase antischimmelgevoeligheid van etherische oliën, afgeleid van de bouillonverdunningsmethode waaruit een remmende dampfase gemedieerde antimicrobiële activiteit werd berekend³², of afgeleid van agar-disk diffusietesten³¹. Deze methoden zijn over het algemeen specifiek voor dampfaseactiviteitsstudies en niet geschikt voor contactremmingstesten. Dit sluit de bepaling uit van de relatieve bijdrage van vluchtige en niet-vluchtige agentia aan de antischimmelactiviteit van een complex bioactief mengsel.

De kwantitatieve methode die we hebben ontwikkeld is bedoeld om het antischimmeleffect van gedroogd plantenpoeder te meten op gecontroleerde hoeveelheden sporen en gekweekt mycelium afgezet op het oppervlak van een agarmedium om de luchtgroei van fytopathogenen te reproduceren tijdens infectie van planten¹⁵ en een onderling verbonden myceliaal netwerk¹⁶. De aanpak is een aangepaste experimentele opstelling op basis van de agarverdunnings- en voedselvergifmethoden die in dezelfde experimentele opstelling ook een zij-aan-zij kwantificering van de bijdrage van zowel vluchtige als niet-vluchtige antischimmelmetabolieten mogelijk maakt. In deze studie is de methode vergeleken met de activiteit van drie goed gekarakteriseerde antischimmelpreparaten.

Protocol

1. Inocula voorbereiding Leg voorafgaand aan het experiment 5 μL Trichoderma spp. SBT10-2018 sporen bewaard bij 4 °C op aardappel dextrose agar medium (PDA) en gedurende 4 dagen incuberen bij 30°C met regelmatige blootstelling aan licht ter bevordering van conidiavorming42 (Figuur 1, paneel A).OPMERKING: Trichoderma spp. SBT10-2018 is geïsoleerd van hout en wordt gebruikt als model in deze studie voor zijn snelle groei en gemak van …

Representative Results

Om het vermogen van de kwantitatieve methode om de werkingswijze van verschillende soorten antischimmelverbindingen te discrimineren te evalueren, vergeleken we de werkzaamheid van drie bekende antischimmelmiddelen. Carbendazim is een niet-vluchtig synthetisch fungicide dat op grote schaal is gebruikt om een breed scala aan schimmelziekten in planten te bestrijden39,40. Thymus vulgaris etherische olie is grotendeels beschreven voor zijn antibacteriële e…

Discussion

De hier gepresenteerde aanpak maakt de evaluatie van antischimmeleigenschappen van minimaal verwerkte plantaardige producten mogelijk. In dit protocol wordt homogene verdeling van sporen op het agaroppervlak bereikt met behulp van 2 mm glazen kralen. Deze stap vereist hanteringsvaardigheden om de kralen goed te verdelen en reproduceerbare resultaten te verkrijgen, waardoor uiteindelijk de vergelijking van antischimmeleffecten in verschillende stadia van schimmelgroei mogelijk is. We ontdekten dat 5 mm glasparels of overm…

Materials

Autoclave-vacuclav 24B+	Melag
Carbendazim	Sigma	378674-100G
Distilled water
Eppendorf tubes	Sarstedt	72.706	1.5 mL
Falcons tubes	Sarstedt	547254	50 mL
Five millimeters diameter stainless steel tube	retail store		/
Food dehydrator	Sancusto		six trays
Garlic powder	Organic shop
Glass beads	CLOUP	65020	2 mm
Hemocytometer counting cell	Jeulin	713442	/
Incubator	Memmert	UM400	30 °C
Knife mill	Bosch	TSM6A013B
Manual cell counter	Labbox	HCNT-001-001	/
Measuring ruler	retail store
Microbiological safety cabinets	FASTER		FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2
Micropipette	Mettler-Toledo	17014407	100 – 1000 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014411	20 – 200 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014412	2 – 20 µL
Petri dish	Sarstedt	82-1194500	55 mm
Petri dish	Sarstedt	82-1473	90 mm
Pipette Controllers-EASY 60	Labbox	EASY-P60-001	/
Potato Dextrose Agar	Sigma	70139-500G
Precision scale-RADWAG	Grosseron	B126698	AS220.R2-ML 220g/0.1mg
Rake	Sarstedt	86-1569001	/
Reverse microscope AE31E trinocular	Grosseron	M097917	/
Sterile graduated pipette	Sarstedt	1254001	10 mL
Thymus essential oil	Drugstore		Essential oil 100%
Tips 1000 µL	Sarstedt	70.762010
Tips 20 µL	Sarstedt	70.760012
Tips 200 µL	Sarstedt	70.760002
Tooth pick	retail store
Trichoderma spp strain			Strain of LRPIA laboratory
Tween-20	Sigma	P1379-250ML
Tween-80	Sigma	P1754-1L
Tweezers	Labbox	FORS-001-002	/