Misurazione dell'attività antifungina volatile e non volatile dei prodotti biocontrollo

Summary

Descriviamo un metodo modificato a base di agar progettato per quantificare gli effetti antifungini dei prodotti di origine vegetale. Sia i contributi volatili che i contributi non volatili all’attività antimicotica possono essere valutati attraverso questo protocollo. Inoltre, l’efficacia contro i funghi può essere misurata in fasi chiave di sviluppo in un’unica configurazione sperimentale.

Abstract

Il protocollo descritto si basa su una tecnica di trasferimento della spina che consente una determinazione accurata delle quantità di microrganismi e delle loro fasi di sviluppo. Un numero specificato di spore viene distribuito su una piastra di agar. Questa piastra di agar viene incubata per un periodo definito per consentire ai funghi di raggiungere lo stadio di sviluppo previsto, ad eccezione delle spore in cui non è richiesta l’incubazione. Le spine di agar coperte da spore, ife o micelio vengono successivamente ritirate e trasferite su supporti di agar contenenti il composto antimicotico da testare sia posizionate a distanza dai funghi che a contatto. Questo metodo è applicabile per testare sia estratti liquidi che campioni solidi (polveri). È particolarmente adatto per quantificare i contributi relativi degli agenti volatili e non volatili nelle miscele bioattive e per determinarne gli effetti, in particolare sulle spore, sull’iphae precoce e sul micelio.

Il metodo è molto rilevante per la caratterizzazione dell’attività antimicotica dei prodotti di biocontrollo, in particolare dei prodotti di origine vegetale. Infatti, per il trattamento dell’impianto, i risultati possono essere utilizzati per guidare la scelta delle modalità di applicazione e stabilire le soglie di innesco.

Introduction

Le perdite globali di frutta e verdura possono raggiungere fino al 50% della^{produzione 1} e derivare principalmente dal decadimento alimentare causato dal deterioramento dei funghi sul campo o durante lo stoccaggio post-raccolta^2,3,nonostante l’ampia occupazione di fungicidi sintetici dalla metà del XX secolo⁴. L’uso di queste sostanze viene riconsiderato in quanto rappresenta gravi rischi per l’ambiente e la salute. Poiché le conseguenze dannose del loro uso si stanno mostrando in tutti gli ecosistemi e le prove di potenziali impatti sulla salute si^{sono accumulate 5,6}, si stanno sviluppando nuove alternative alle vecchie strategie profilattiche per i trattamenti pre e post-raccolta^7,8,9. Quindi la sfida che dobbiamo affrontare è duplice. Le nuove strategie fungicide devono, in primo luogo, mantenere i livelli di efficacia della protezione alimentare contro i fitopatogeni e, in secondo luogo, contribuire in secondo luogo a ridurre drasticamente l’impronta ambientale delle pratiche agricole. Per raggiungere questo ambizioso obiettivo, vengono proposte strategie ispirate alle difese naturali evolute nelle piante poiché sono state evidenziate più di 1000 specie di piante per le loro proprietà antimicrobiche⁸. Ad esempio, le piante che hanno sviluppato fungicidi naturali per combattere i fitopatogeni sono una nuova risorsa per esplorare lo sviluppo di nuovi prodotti di biocontrollo². Gli oli essenziali sono molecole di punta di questo tipo. Ad esempio, l’olio essenziale di Origanum protegge le piante di pomodoro dalla muffa grigia nelle serre ¹⁰ e gli oli essenziali Solidago canadensis L. e cassia hanno dimostrato di preservare le fragole post-raccolte dai danni della muffa^{grigia 11,12}. Questi esempi dimostrano che il biocontrollo e in particolare i prodotti di origine vegetale rappresentano una soluzione che combina efficacia biologica e sostenibilità ambientale.

Pertanto, le piante sono un’importante risorsa di molecole di potenziale interesse per l’industria della protezione delle colture. Tuttavia, solo una manciata di prodotti vegetali è stata proposta per essere utilizzata come prodotti di biocontrollo, anche se sono generalmente riconosciuti come sicuri, non fitotossici ed^{eco-compatibili 2}. Sono state osservate alcune difficoltà nella trasposizione dal laboratorio al campo, come l’efficacia che diminuisce una volta applicata in vivo^2,9. Pertanto, diventa importante migliorare la capacità dei test di laboratorio di prevedere meglio l’efficacia sul campo. In questo contesto, i metodi di prova antimicotici per i prodotti di origine vegetale sono necessari sia per valutarne l’efficacia antimicotico sia per definire le loro condizioni ottimali per l’uso. In particolare, i prodotti di biocontrollo sono generalmente meno efficienti dei fungicidi chimici, quindi una migliore comprensione del loro modo di agire è importante per proporre formulazioni adeguate, identificare le modalità di applicazione nei campi e definire quale stadio di sviluppo dell’agente patogeno è vulnerabile al bioproduttore candidato.

Gli attuali approcci che affrontano le attività antibatteriche e antifungine includono metodi di diffusione come la diffusione del disco di agar, la diluizione, la bioautografia e la citometria del flusso¹³. La maggior parte di queste tecniche, e più specificamente, i test standard di suscettibilità antifungina – test di diffusione e diluizione agar-disk – sono ben adattati per valutare l’attività antimicrobica dei composti solubili sulle spore batteriche e fungine nelle sospensioni liquide¹⁴. Tuttavia, questi metodi non sono generalmente adatti per testare composti solidi come la polvere vegetale essiccata o per quantificare l’attività antifungina durante la crescita del micelio in quanto richiedono la diluizione delle spore o la diffusione di spore su piastre di agar e / o diluizione di composti antifungini¹³. Nel metodo avvelenato dal cibo, le piastre di agar contenenti l’agente antimicotico vengono inoculate con un disco di 5-7 mm di diametro campionato da una coltura di funghi vecchia di 7 giorni senza considerare la quantità precisa di micelio iniziale. Dopo l’incubazione, l’attività antimicotica è determinata come percentuale di inibizione della crescita radiale^17,18,19. Con questo approccio possiamo valutare l’attività antimicotica sulla crescita miceliale. Al contrario, il metodo di diluizione dell’agar viene eseguito per determinare l’attività antimicotica sulle spore direttamente inoculate sulla superficie della piastra di agar contenente i composti antifungini^13,20,21. Questi due approcci danno risultati complementari sull’attività antimicotica. Tuttavia queste sono due tecniche indipendenti utilizzate in parallelo che non forniscono un confronto accurato fianco a fianco dell’efficacia relativa dei composti antifungini su spore e micelio^17,20,22 poiché la quantità di materiale fungino iniziale differisce nei due approcci. Inoltre, l’attività antimicotica di un prodotto di origine vegetale è spesso il risultato della combinazione di molecole antifungine sintetizzati dalle piante per affrontare agenti patogeni. Queste molecole comprendono proteine, peptidi^23,24, e metaboliti con un’ampia diversità chimica e appartenenti a diverse classi di molecole come polifenoli, terpeni, alcaloidi²⁵, glucosinolati⁸, e composti organosolfuri²⁶. Alcune di queste molecole sono volatili o diventano volatili durante l’attacco patogeno²⁷. Questi agenti sono spesso scarsamente solubili in acqua e composti ad alta pressione di vapore che devono essere recuperati attraverso la distillazione dell’acqua come oli essenziali, alcune delle cui attività antimicrobiche sono state ben consolidate²⁸. Sono stati sviluppati saggi di suscettibilità mediati in fase di vapore per misurare l’attività antimicrobica dei composti volatili dopo l’evaporazione e la migrazione attraverso la fase di vapore²⁹. Questi metodi si basano sull’introduzione di composti antifungini a distanza dalla coltura microbica^{29,30,31,32,33}. Nel saggio di agar in fase di vapore comunemente usato, gli oli essenziali vengono depositati su un disco di carta e posizionati al centro della copertura della piastra di Petri a distanza dalla sospensione batterica o fungina della spora, che viene diffusa su un mezzo agar. Il diametro della zona di inibizione della crescita viene quindi misurato allo stesso modo del metodo di diffusione agar-disco^20,24. Altri approcci sono stati sviluppati per fornire una misurazione quantitativa della suscettibilità antifungina in fase di vapore degli oli essenziali, derivata dal metodo di diluizione del brodo da cui è stata calcolata un’attività antimicrobica mediata in fase di vapore inibitoria³², o derivati da saggi di diffusione agar-disk³¹. Questi metodi sono generalmente specifici per gli studi di attività in fase di vapore e non appropriati ai saggi di inibizione del contatto. Ciò impedisce la determinazione del contributo relativo degli agenti volatili e non volatili all’attività antimicotica di una miscela bioattiva complessa.

Il metodo quantitativo che abbiamo sviluppato mira a misurare l’effetto antimicotico della polvere vegetale essiccata su quantità controllate di spore e micelio coltivato depositato sulla superficie di un mezzo agar per riprodurre la crescita aerea dei fitopatogeni durante l’infezione^{delle piante 15 e} una rete miceliale interconnessa¹⁶. L’approccio è una configurazione sperimentale modificata basata sui metodi di diluizione dell’agar e avvelenati dagli alimenti che consente anche, nella stessa configurazione sperimentale, la quantificazione affiancata del contributo di metaboliti antifungini volatili e non volatili. In questo studio, il metodo è stato confrontato con l’attività di tre preparati antifungini ben caratterizzati.

Protocol

1. Preparazione dell’inocula Prima dell’esperimento, posare 5 μL di Trichoderma spp. Le spore SBT10-2018 conservate a 4 °C su mezzo agar destrosio di patate (PDA) e incubano per 4 giorni a 30°C con esposizione regolare alla luce per favorire la formazione di conidia42 (Figura 1,pannello A).NOTA: Trichoderma spp. SBT10-2018 è stato isolato dal legno ed è utilizzato come modello in questo studio per la sua rapida crescita e facilità…

Representative Results

Per valutare la capacità del metodo quantitativo di discriminare le modalità di azione di diversi tipi di composti antifungini, abbiamo confrontato l’efficacia di tre noti agenti antifungini. Carbendazim è un fungicida sintetico non volatile che è stato ampiamente utilizzato per controllare una vasta gamma di malattie fungine nellepiante 39,40. L’olio essenziale di thymus vulgaris è stato in gran parte descritto per la sua attività antibatterica e …

Discussion

L’approccio qui presentato consente la valutazione delle proprietà antifungine dei prodotti di origine vegetale minimamente lavorati. In questo protocollo, la distribuzione omogenea delle spore sulla superficie dell’agar si ottiene utilizzando perline di vetro da 2 mm. Questo passaggio richiede capacità di movimentazione per distribuire correttamente le perline e ottenere risultati riproducibili, consentendo in ultima analisi il confronto di effetti antifungini in diverse fasi della crescita fungina. Abbiamo scoperto c…

Materials

Autoclave-vacuclav 24B+	Melag
Carbendazim	Sigma	378674-100G
Distilled water
Eppendorf tubes	Sarstedt	72.706	1.5 mL
Falcons tubes	Sarstedt	547254	50 mL
Five millimeters diameter stainless steel tube	retail store		/
Food dehydrator	Sancusto		six trays
Garlic powder	Organic shop
Glass beads	CLOUP	65020	2 mm
Hemocytometer counting cell	Jeulin	713442	/
Incubator	Memmert	UM400	30 °C
Knife mill	Bosch	TSM6A013B
Manual cell counter	Labbox	HCNT-001-001	/
Measuring ruler	retail store
Microbiological safety cabinets	FASTER		FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2
Micropipette	Mettler-Toledo	17014407	100 – 1000 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014411	20 – 200 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014412	2 – 20 µL
Petri dish	Sarstedt	82-1194500	55 mm
Petri dish	Sarstedt	82-1473	90 mm
Pipette Controllers-EASY 60	Labbox	EASY-P60-001	/
Potato Dextrose Agar	Sigma	70139-500G
Precision scale-RADWAG	Grosseron	B126698	AS220.R2-ML 220g/0.1mg
Rake	Sarstedt	86-1569001	/
Reverse microscope AE31E trinocular	Grosseron	M097917	/
Sterile graduated pipette	Sarstedt	1254001	10 mL
Thymus essential oil	Drugstore		Essential oil 100%
Tips 1000 µL	Sarstedt	70.762010
Tips 20 µL	Sarstedt	70.760012
Tips 200 µL	Sarstedt	70.760002
Tooth pick	retail store
Trichoderma spp strain			Strain of LRPIA laboratory
Tween-20	Sigma	P1379-250ML
Tween-80	Sigma	P1754-1L
Tweezers	Labbox	FORS-001-002	/