Måling af biocontrolprodukters flygtige og ikke-flygtige svampedræbende aktivitet

Summary

Vi beskriver en modificeret agarbaseret metode designet til at kvantificere de svampedræbende virkninger af plantebaserede produkter. Både volatile og ikke-volatile bidrag til svampeaktiviteten kan vurderes ved hjælp af denne protokol. Derudover kan effekten mod svampe måles på centrale udviklingsstadier i et enkelt eksperimentelt setup.

Abstract

Den beskrevne protokol er baseret på en plug-transfer-teknik, der giver mulighed for nøjagtig bestemmelse af mikroorganismemængder og deres udviklingsstadier. Et bestemt antal sporer spredes på en agarplade. Denne agarplade inkuberes i en bestemt periode, så svampene kan nå det forventede udviklingsstadium, undtagen sporer, hvor inkubation ikke er påkrævet. Agar stik dækket af sporer, hyphae, eller mycelium er næste trukket tilbage og overføres til agar medier, der indeholder svampedræbende forbindelse, der skal testes enten placeret i en afstand fra svampe eller i kontakt. Denne metode anvendes til test af både flydende ekstrakter og faste prøver (pulvere). Det er især velegnet til at kvantificere de relative bidrag fra flygtige og ikke-flygtige stoffer i bioaktive blandinger og til bestemmelse af deres virkninger, specielt på sporer, tidlig hyphae og mycelium.

Metoden er yderst relevant for karakteriseringen af biokontrolprodukters svampedræbende aktivitet, navnlig planteafledte produkter. Til plantebehandling kan resultaterne faktisk bruges til at vejlede valget af anvendelsesmåde og til at fastsætte udløsertærsklerne.

Introduction

Globale tab af frugt og grøntsager kan nå op til 50% af produktionen¹ og skyldes hovedsagelig mad henfald forårsaget af svampe fordærv i marken eller under post-høst opbevaring^2,3, på trods af den omfattende beskæftigelse af syntetiske fungicider siden midten af det tyvende århundrede⁴. Anvendelsen af disse stoffer tages op til fornyet overvejelse, da det udgør alvorlige miljø- og sundhedsrisici. Da de skadelige konsekvenser af deres anvendelse viser sig i hele økosystemerne , og der er indsamlet dokumentation for potentielle sundhedsmæssige virkninger^5,6, udvikles der nye alternativer til gamle profylaktiske strategier til behandling før og efter^{høsten 7,8,9}. Derfor er den udfordring, vi står over for, dobbelt. Nye svampedræbende strategier skal for det første opretholde niveauet for fødevaresikkerhed mod fytopatogener og samtidig bidrage til en drastisk reduktion af landbrugspraksissens miljømæssige fodaftryk. For at opfylde dette ambitiøse mål foreslås strategier inspireret af det naturlige forsvar udviklet i planter, da mere end 1000 plantearter er blevet fremhævet for deres antimikrobielle egenskaber⁸. For eksempel er planter, der har udviklet naturlige fungicider til bekæmpelse af fytopathogens, en ny ressource i at udforske udviklingen af nye biokontrolprodukter². Æteriske olier er flagskib molekyler af denne type. For eksempel beskytter Origanum æterisk olie tomatplanter mod grå skimmelsvamp i drivhuse ¹⁰ og Solidago canadensis L. og cassia æteriske olier har vist sig at bevare post-høstede jordbær fra grå skimmel skader^11,12. Disse eksempler illustrerer, at biokontrol og især plantebaserede produkter udgør en løsning, der kombinerer biologisk effektivitet og miljømæssig bæredygtighed.

Således er planter en vigtig ressource af molekyler af potentiel interesse for afgrødebeskyttelsesindustrien. Der er imidlertid kun foreslået en håndfuld planteprodukter, der skal anvendes som biokontrolprodukter, selv om de generelt anerkendes som sikre, ikke-fytotoksiske og miljøvenlige². Der er konstateret visse vanskeligheder i forbindelse med gennemførelsen fra laboratoriet til marken , f.eks^. Således bliver det vigtigt at forbedre muligheden for lab tests til bedre at forudsige felteffektivitet. I denne forbindelse er svampedræbende testmetoder for planteafledte produkter nødvendige både for at evaluere deres svampedræbende virkning og for at definere deres optimale anvendelsesbetingelser. Specifikt er biokontrolprodukter generelt mindre effektive end kemiske fungicider, så en bedre forståelse af deres virkningsmåde er vigtig for at foreslå passende formuleringer, identificere anvendelsesmåden på områder og definere, hvilken udviklingsstadium af patogenet der er sårbar over for kandidatbioproduktet.

De nuværende metoder til antibakterielle og svampedræbende aktiviteter omfatter diffusionsmetoder såsom diffusion af agardisketter, fortynding, bioautografi og flowcytometri¹³. De fleste af disse teknikker, og mere specifikt, standard antifungal modtagelighed test – agar-disk diffusion og fortynding assays – er velegnede til vurdering af antimikrobiel aktivitet opløselige forbindelser på bakterielle og svampesporer i flydende suspensioner¹⁴. Disse metoder er dog generelt ikke egnede til at teste faste forbindelser såsom tørret plantepulver eller til at kvantificere svampedræbende aktivitet under myceliumvækst, da de kræver sporefortynding eller sporespredning på agarplader og / eller fortynding af svampedræbende forbindelser¹³. I den fødevaregiftede metode podes agarplader, der indeholder svampedræbende middel, med en 5-7 mm diameter disk udtaget fra en 7-dages gammel svampekultur uden at overveje den nøjagtige mængde start mycelium. Efter inkubation bestemmes svampedræbende aktivitet som en procentdel af radialvæksthæmning^17,18,19. Med denne tilgang kan vi evaluere svampedræbende aktivitet på mycelial vækst. Derimod udføres agarfortyndingsmetoden for at bestemme svampedræbende aktivitet på sporer, der er direkte podet på overfladen af agarpladen, der indeholder svampedræbende forbindelser^13,20,21. Disse to tilgange giver komplementære resultater med antifungal aktivitet. Men disse er to uafhængige teknikker, der anvendes parallelt, som ikke giver nøjagtig side-by-side sammenligning af den relative effekt af svampedræbende forbindelser på sporer og mycelium^17,20,22 da mængden af startvalsemateriale varierer i de to tilgange. Desuden skyldes den svampedræbende aktivitet af et planteafledt produkt ofte kombinationen af svampedræbende molekyler syntetiseret af planter til ansigt patogener. Disse molekyler omfatter proteiner, peptider^23,24, og metabolitter med bred kemisk diversitet og tilhører forskellige klasser af molekyler såsom polyfenoler, terpener, alcaloïds²⁵, glucosinolater⁸, og organosulfurforbindelser²⁶. Nogle af disse molekyler er flygtige eller bliver flygtige under patogenangreb²⁷. Disse midler er oftest dårligt vandopløselige og højdamptryksforbindelser, der skal genvindes gennem vanddestillation som æteriske olier, hvoraf nogle antimikrobielle aktiviteter er veletablerede.²⁸. Dampfase medieret modtagelighed assays er blevet udviklet til at måle antimikrobiel aktivitet af flygtige forbindelser efter fordampning og migration via damp fase²⁹. Disse metoder er baseret på indførelsen af svampedræbende forbindelser i en afstand fra den mikrobielle kultur^{29,30,31,32,33}. I den almindeligt anvendte dampfase agaranalyse deponeres æteriske olier på en papirdisk og placeres i midten af dækslet af petriskålen i afstand fra bakteriel eller svampesporeaffjedring, som spredes på agar medium. Diameteren af væksthæmmende zone måles derefter på samme måde som for agar-disk diffusionsmetoden^20,24. Der er udviklet andre metoder til kvantitativ måling af æteriske oliers antifungale modtagelighed i dampfasen, der stammer fra bouillonfortyndingsmetoden, hvorfra der blev beregnet en hæmmende dampfasemedieret antimikrobiel aktivitet.³², eller fremstillet af diffusionsanalyser af agar-disk³¹. Disse metoder er generelt specifikke for dampfaseaktivitetsundersøgelser og ikke egnede til kontakthæmmende assays. Dette udelukker bestemmelse af det relative bidrag fra flygtige og ikke-flygtige stoffer til svampedræbende aktivitet i en kompleks bioaktiv blanding.

Den kvantitative metode, vi har udviklet, har til formål at måle den svampedræbende virkning af tørret plantepulver på kontrollerede mængder sporer og dyrket mycelium deponeret på overfladen af et agarmedium for at reproducere luftvæksten af fytopathogens under infektion af planter¹⁵ samt et sammenkoblet mycelialt netværk¹⁶. Tilgangen er en modificeret eksperimentel opsætning baseret på agarfortynding og fødevaregifte metoder, der også i samme eksperimentelle opsætning muliggør side om side kvantificering af bidraget fra både flygtige og ikke-flygtige svampedræbende metabolitter. I denne undersøgelse er metoden blevet benchmarket mod aktiviteten af tre velkaraktererede svampedræbende præparater.

Protocol

1. Podning af inocula Før forsøget lå 5 μL Trichoderma spp. SBT10-2018 sporer oplagret ved 4 °C på kartoffeldextrose agar medium (PDA) og inkuberes i 4 dage ved 30 °C med regelmæssig lyseksponering for at fremme conidiadannelse42 (Figur 1, panel A).BEMÆRK: Trichoderma spp. SBT10-2018 er blevet isoleret fra træ og bruges som model i denne undersøgelse for sin hurtige vækst og lette sporegenvinding. Denne stamme er bevaret af …

Representative Results

For at evaluere den kvantitative metodes evne til at diskriminere virkningsmåden for forskellige typer svampemidler, sammenlignede vi effekten af tre velkendte svampemidler. Carbendazim er et ikke-flygtigt syntetisk fungicid , som i vid udstrækning er blevet anvendt til at kontrollere en bred vifte af svampesygdomme i planter39,40. Thymus vulgaris æterisk olie er i vid udstrækning blevet beskrevet for sin antibakterielle og svampedræbende aktivitet …

Discussion

Den fremgangsmåde, der præsenteres her, giver mulighed for evaluering af svampedræbende egenskaber ved minimalt forarbejdede plantebaserede produkter. I denne protokol opnås homogen fordeling af sporer på agaroverfladen ved hjælp af 2 mm glasperler. Dette trin kræver håndtering færdigheder til korrekt at distribuere perler og for at opnå reproducerbare resultater, i sidste ende gør det muligt at sammenligne svampedræbende virkninger på forskellige stadier af svampevækst. Vi fandt ud af, at 5 mm glasperler e…

Materials

Autoclave-vacuclav 24B+	Melag
Carbendazim	Sigma	378674-100G
Distilled water
Eppendorf tubes	Sarstedt	72.706	1.5 mL
Falcons tubes	Sarstedt	547254	50 mL
Five millimeters diameter stainless steel tube	retail store		/
Food dehydrator	Sancusto		six trays
Garlic powder	Organic shop
Glass beads	CLOUP	65020	2 mm
Hemocytometer counting cell	Jeulin	713442	/
Incubator	Memmert	UM400	30 °C
Knife mill	Bosch	TSM6A013B
Manual cell counter	Labbox	HCNT-001-001	/
Measuring ruler	retail store
Microbiological safety cabinets	FASTER		FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2
Micropipette	Mettler-Toledo	17014407	100 – 1000 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014411	20 – 200 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014412	2 – 20 µL
Petri dish	Sarstedt	82-1194500	55 mm
Petri dish	Sarstedt	82-1473	90 mm
Pipette Controllers-EASY 60	Labbox	EASY-P60-001	/
Potato Dextrose Agar	Sigma	70139-500G
Precision scale-RADWAG	Grosseron	B126698	AS220.R2-ML 220g/0.1mg
Rake	Sarstedt	86-1569001	/
Reverse microscope AE31E trinocular	Grosseron	M097917	/
Sterile graduated pipette	Sarstedt	1254001	10 mL
Thymus essential oil	Drugstore		Essential oil 100%
Tips 1000 µL	Sarstedt	70.762010
Tips 20 µL	Sarstedt	70.760012
Tips 200 µL	Sarstedt	70.760002
Tooth pick	retail store
Trichoderma spp strain			Strain of LRPIA laboratory
Tween-20	Sigma	P1379-250ML
Tween-80	Sigma	P1754-1L
Tweezers	Labbox	FORS-001-002	/