Måling av flyktig og ikke-flyktig antifungal aktivitet av biokontrollprodukter

Summary

Vi beskriver en modifisert agarbasert metode designet for å kvantifisere de antifungale effektene av planteavledede produkter. Både flyktige og ikke-flyktige bidrag til antifungal aktivitet kan vurderes gjennom denne protokollen. I tillegg kan effekt mot sopp måles ved viktige utviklingsstadier i et enkelt eksperimentelt oppsett.

Abstract

Protokollen som er beskrevet er basert på en plug-transfer-teknikk som tillater nøyaktig bestemmelse av mikroorganismemengder og deres utviklingsstadier. Et bestemt antall sporer er spredt på en agarplate. Denne agarplaten inkuberes i en definert periode slik at soppene kan nå det forventede utviklingsstadiet, bortsett fra sporer der inkubasjon ikke er nødvendig. Agarplugger dekket av sporer, hyphae eller mycelium blir deretter trukket tilbake og overført til agarmedier som inneholder den antifungale forbindelsen som skal testes enten plassert i avstand fra soppene eller i kontakt. Denne metoden gjelder for å teste både væskeekstrakter og faste prøver (pulver). Det er spesielt godt egnet for å kvantifisere de relative bidragene fra flyktige og ikke-flyktige midler i bioaktive blandinger og for å bestemme deres effekter, spesielt på sporer, tidlig hyphae og mycelium.

Metoden er svært relevant for karakterisering av antifungal aktivitet av biokontrollprodukter, spesielt planteavledede produkter. Faktisk, for plantebehandling, kan resultatene brukes til å veilede valg av applikasjonsmåte og for å etablere utløserterskler.

Introduction

Globale tap av frukt og grønnsaker kan nå opptil 50% av produksjonen¹ og resultere hovedsakelig av matråte forårsaket av soppsvinn i felt eller under lagring etter høsting^2,3, til tross for den omfattende sysselsettingen av syntetiske soppdrepende midler siden midten av det tjuende århundre⁴. Bruken av disse stoffene blir revurdert siden det representerer alvorlige miljø- og helsefarer. Ettersom de skadelige konsekvensene av deres bruk vises gjennom økosystemer og bevis på potensielle helsepåvirkninger har akkumulert^5,6, utvikles nye alternativer til gamle profylaktiske strategier for pre- og post-harvest behandlinger^7,8,9. Derfor er utfordringen vi står overfor todelt. Nye soppdrepende strategier må for det første opprettholde nivåene av effekt av matbeskyttelse mot fytopatomer og samtidig bidra til å dramatisk redusere miljøavtrykket i landbrukspraksis. For å oppfylle dette ambisiøse målet foreslås strategier inspirert av det naturlige forsvaret utviklet i planter, da mer enn 1000 plantearter har blitt fremhevet for sine antimikrobielle egenskaper⁸. For eksempel er planter som har utviklet naturlige soppdrepende midler for å bekjempe fytopatoogener en ny ressurs for å utforske utviklingen av nye biokontrollprodukter². Eteriske oljer er flaggskipmolekyler av denne typen. For eksempel beskytter Origanum essensiell olje tomatplanter mot grå mugg i ^{drivhusene 10} og Solidago canadensis L. og cassia essensielle oljer har vist seg å bevare posthøstet jordbær fra grå muggskade^11,12. Disse eksemplene illustrerer at biokontroll og spesielt planteavledede produkter representerer en løsning som kombinerer biologisk effekt og miljømessig bærekraft.

Dermed er planter en viktig ressurs for molekyler av potensiell interesse for avlingsbeskyttelsesindustrien. Imidlertid er det bare foreslått en håndfull planteprodukter som skal brukes som biokontrollprodukter, selv om de generelt er anerkjent som trygge, ikke-fytotoksiske og miljøvennlige². Noen vanskeligheter i transposisjonen fra laboratoriet til feltet har blitt observert, for eksempel effekten avtar når den er påført in vivo^2,9. Dermed blir det viktig å forbedre evnen til laboratorietester for bedre å forutsi felteffektivitet. I denne sammenhengen er antifungale testmetoder for planteavledede produkter nødvendig både for å evaluere deres antifungale effekt og for å definere deres optimale bruksbetingelser. Spesielt er biokontrollprodukter generelt mindre effektive enn kjemiske soppdrepende midler, så en bedre forståelse av deres virkningsmåte er viktig for å foreslå egnede formuleringer, for å identifisere anvendelsesmodus i felt, og for å definere hvilket utviklingsstadium av patogenet som er sårbart for kandidatens bioprodukt.

Aktuelle tilnærminger til antibakterielle og antifungale aktiviteter inkluderer diffusjonsmetoder som agar-disk diffusjon, fortynning, bioautografi og strømningscytometri¹³. De fleste av disse teknikkene, og mer spesifikt, standard antifungal følsomhetstesting – agar-disk diffusjon og fortynningsanalyser – er godt tilpasset for evaluering av antimikrobiell aktivitet av løselige forbindelser på bakterielle og soppsporer i flytende suspensjoner.¹⁴. Imidlertid er disse metodene generelt ikke egnet for testing av faste forbindelser som tørket plantepulver eller for å kvantifisere antifungal aktivitet under myceliumvekst, da de krever sporefortynning eller sporespredning på agarplater og / eller fortynning av antifungale forbindelser.¹³. I den matforgiftede metoden er agarplater som inneholder antifungalmiddelet inokulert med en 5-7 mm diameter disk samplet fra en 7-dagers gammel soppkultur uten å vurdere den nøyaktige mengden startende mycelium. Etter inkubasjon bestemmes den antifungale aktiviteten som en prosentandel av radial vekstinhibering^17,18,19. Med denne tilnærmingen kan vi evaluere antifungal aktivitet på mycelial vekst. Til sammenligning utføres agarfortynningsmetoden for å bestemme antifungal aktivitet på sporer som er direkte inokulert på overflaten av agarplaten som inneholder de antifungale forbindelsene.^13,20,21. Disse to tilnærmingene gir komplementære resultater på antifungal aktivitet. Dette er imidlertid to uavhengige teknikker som brukes parallelt som ikke gir nøyaktig sammenligning side om side av den relative effekten av antifungale forbindelser på sporer og mycelium.^17,20,22 ettersom mengden startsvampmateriale er forskjellig i de to tilnærmingene. Videre er den antifungale aktiviteten til et planteavledet produkt ofte et resultat av kombinasjonen av antifungale molekyler syntetisert av planter for å møte patogener. Disse molekylene omfatter proteiner, peptider^23,24, og metabolitter som har et bredt kjemisk mangfold og tilhører ulike klasser av molekyler som polyfenoler, terpener, alcaloïds²⁵, glukosinolater⁸, og organosulfurforbindelser²⁶. Noen av disse molekylene er flyktige eller blir flyktige under patogenangrep²⁷. Disse midlene er oftest dårlig vannløselige og høye damptrykkforbindelser som må utvinnes gjennom vanndestillasjon som essensielle oljer, hvorav noen av deres antimikrobielle aktiviteter er godt etablert.²⁸. Dampfasemediert følsomhetsanalyser er utviklet for å måle den antimikrobielle aktiviteten til flyktige forbindelser etter fordampning og migrasjon via dampfasen²⁹. Disse metodene er basert på innføring av antifungale forbindelser i avstand fra den mikrobielle kulturen.^{29,30,31,32,33}. I den ofte brukte dampfase-agaranalysen blir essensielle oljer avsatt på en papirdisk og plassert i midten av dekselet på Petri-parabolen i avstand fra bakteriell eller soppsporfjæring, som er spredt på agarmedium. Diameteren på sonen for vekstinhibering måles deretter på samme måte som for agar-disk diffusjonsmetoden^20,24. Andre tilnærminger er utviklet for å gi kvantitativ måling av dampfase antifungal følsomhet av essensielle oljer, avledet fra buljong-fortynningsmetoden hvorfra en hemmende dampfasemediert antimikrobiell aktivitet ble beregnet fra³², eller avledet fra agar-disk diffusjonsanalyser³¹. Disse metodene er generelt spesifikke for dampfaseaktivitetsstudier og ikke egnet for kontaktinhiberingsanalyser. Dette utelukker bestemmelse av det relative bidraget av flyktige og ikke-flyktige midler til antifungal aktivitet av en kompleks bioaktiv blanding.

Den kvantitative metoden vi har utviklet tar sikte på å måle den antifungale effekten av tørket plantepulver på kontrollerte mengder sporer og dyrket mycelium avsatt på overflaten av et agarmedium for å reprodusere luftveksten av fytopatogene under infeksjon av planter¹⁵ samt et sammenkoblet mycelialnettverk¹⁶. Tilnærmingen er et modifisert eksperimentelt oppsett basert på agarfortynning og matforgiftede metoder som også tillater, i samme eksperimentelle oppsett, side-ved-side kvantifisering av bidraget fra både flyktige og ikke-flyktige antifungale metabolitter. I denne studien har metoden blitt benchmarked mot aktiviteten til tre godt karakteriserte antifungale preparater.

Protocol

1. Inocula forberedelse Før eksperimentet lå 5 μL trichoderma spp. SBT10-2018-sporer lagret ved 4 °C på potetdekstrose agarmedium (PDA) og inkuberes i 4 dager ved 30 °C med regelmessig lyseksponering for å fremme conidiaformasjon42 (figur 1, panel A).MERK: Trichoderma spp. SBT10-2018 er isolert fra tre og brukes som modell i denne studien for rask vekst og enkel spore utvinning. Denne stammen er bevart av vårt laboratorium….

Representative Results

For å evaluere den kvantitative metodens evne til å diskriminere virkningsmåten til forskjellige typer antifungale forbindelser, sammenlignet vi effekten av tre kjente antifungale midler. Carbendazim er et ikke-flyktig syntetisk soppdrepende som har blitt mye brukt til å kontrollere et bredt spekter av soppsykdommer i planter39,40. Thymus vulgaris essensiell olje har i stor grad blitt beskrevet for sin antibakterielle og antifungale aktivitet og bruk…

Discussion

Tilnærmingen som presenteres her tillater evaluering av antifungale egenskaper til minimalt bearbeidede planteavledede produkter. I denne protokollen oppnås homogen fordeling av sporer på agaroverflaten ved hjelp av 2 mm glassperler. Dette trinnet krever håndtering av ferdigheter for å distribuere perlene riktig og for å oppnå reproduserbare resultater, og til slutt tillate sammenligning av antifungale effekter på forskjellige stadier av soppvekst. Vi fant ut at 5 mm glassperler eller overdreven rotasjon mens hom…

Materials

Autoclave-vacuclav 24B+	Melag
Carbendazim	Sigma	378674-100G
Distilled water
Eppendorf tubes	Sarstedt	72.706	1.5 mL
Falcons tubes	Sarstedt	547254	50 mL
Five millimeters diameter stainless steel tube	retail store		/
Food dehydrator	Sancusto		six trays
Garlic powder	Organic shop
Glass beads	CLOUP	65020	2 mm
Hemocytometer counting cell	Jeulin	713442	/
Incubator	Memmert	UM400	30 °C
Knife mill	Bosch	TSM6A013B
Manual cell counter	Labbox	HCNT-001-001	/
Measuring ruler	retail store
Microbiological safety cabinets	FASTER		FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2
Micropipette	Mettler-Toledo	17014407	100 – 1000 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014411	20 – 200 µL
Micropipette	Mettler-Toledo	17014412	2 – 20 µL
Petri dish	Sarstedt	82-1194500	55 mm
Petri dish	Sarstedt	82-1473	90 mm
Pipette Controllers-EASY 60	Labbox	EASY-P60-001	/
Potato Dextrose Agar	Sigma	70139-500G
Precision scale-RADWAG	Grosseron	B126698	AS220.R2-ML 220g/0.1mg
Rake	Sarstedt	86-1569001	/
Reverse microscope AE31E trinocular	Grosseron	M097917	/
Sterile graduated pipette	Sarstedt	1254001	10 mL
Thymus essential oil	Drugstore		Essential oil 100%
Tips 1000 µL	Sarstedt	70.762010
Tips 20 µL	Sarstedt	70.760012
Tips 200 µL	Sarstedt	70.760002
Tooth pick	retail store
Trichoderma spp strain			Strain of LRPIA laboratory
Tween-20	Sigma	P1379-250ML
Tween-80	Sigma	P1754-1L
Tweezers	Labbox	FORS-001-002	/