JoVE Journal > Engineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
공학

مفاعل حيوي متعدد العظة لتقييم القدرة الالتهابية والتجديدية للمواد الحيوية تحت التدفق والتمدد

Published: December 10, 2020
doi:
10.3791/61824
, , , , , , ,
1Department of Biomedical Engineering,Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems (ICMS),Eindhoven University of Technology

Summary

الهدف من هذا البروتوكول هو تنفيذ ثقافة مشتركة ديناميكية من الضامة البشرية و myofibroblasts في سقالات كهربائية أنبوبية للتحقيق في تجديد الأنسجة التي تحركها المواد ، وذلك باستخدام مفاعل حيوي يمكن من فصل إجهاد القص والتمدد الدوري.

Abstract

استخدام المواد الحيوية القابلة للتك00 للحث على التجديد مباشرة في الجسم هو استراتيجية جذابة من منظور تحويلي. هذه المواد تحفز استجابة التهابية عند الزرع ، وهو المحرك لإعادة امتصاص المواد اللاحقة وتجديد الأنسجة الجديدة. هذه الاستراتيجية، والمعروفة أيضا باسم هندسة الأنسجة في الموقع، يتم اتباعها للحصول على بدائل القلب والأوعية الدموية مثل ترقيع الأوعية الدموية المهندسة الأنسجة. يتم تحديد كل من العمليات الالتهابية والتجددية من خلال الإشارات الميكانيكية الحيوية المحلية على السقالة (أي إجهاد التمدد والقص). هنا، ونحن نصف بالتفصيل استخدام مفاعل حيوي وضعت خصيصا التي تمكن بشكل فريد من فصل تمتد والقص الإجهاد على سقالة أنبوبي. وهذا يسمح للتقييم المنهجي والموحد للقدرة الالتهابية والتجديدية للسقالات الأنبوبية تحت تأثير الأحمال الميكانيكية التي يتم التحكم فيها بشكل جيد ، والتي نظهرها على أساس تجربة ديناميكية للثقافة المشتركة باستخدام الضامة البشرية والخلايا العضلية. وتناقش بالتفصيل الخطوات العملية الرئيسية في هذا النهج – بناء وإنشاء المفاعل الحيوي، وإعداد السقالات وبذر الخلايا، وتطبيق وصيانة تدفق التمدد والقص، وحصاد العينات للتحليل.

Introduction

هندسة أنسجة القلب والأوعية الدموية (TE) ويجري السعي كخيار علاج بديل لأطراف القلب والأوعية الدموية المستخدمة حاليا دائمة (على سبيل المثال، ترقيع الأوعية الدموية، واستبدال صمام القلب)، والتي هي دون المستوى الأمثل لأفواج كبيرة من المرضى1،2،3،4. وتشمل التطبيقات المطلوبة كثيرا بعد ترقيع الأوعية الدموية المهندسة الأنسجة (TEVGs)5و6 وصمامات القلب (TEHVs)7،8. في معظم الأحيان، تستخدم منهجيات TE القلبية الوعائية المواد الحيوية القابلة لإعادة التكثير (سواء كانت طبيعية أو اصطناعية) التي تعمل سقالة مفيدة للأنسجة الجديدة التي سيتم تشكيلها. تشكيل نسيج جديد يمكن إما أن تكون هندسية تماما في المختبر، عن طريق بذر السقالة مع الخلايا وزراعة في مفاعل حيوي قبل زرع (في المختبر TE)9،10،11، أو مباشرة في الموقع، والتي يتم زرع السقالة الاصطناعية دون زرع قبل من أجل الحث على تشكيل أنسجة جديدة مباشرة في الجسم (في الموقع TE)12،13،14. لكل من المختبر وفي الموقع نهج TE القلب والأوعية الدموية، وتجديد وظيفي ناجح يعتمد بشكل مهيمن على كل من الاستجابة المناعية المضيف لبناء مزروع وتحميل الميكانيكا الحيوية المناسبة.

أهمية التحميل الميكانيكي الحيوي لTE القلب والأوعية الدموية هو معترف به جيدا15. في حالة زراعة القلب والأوعية الدموية ، تتعرض الخلايا التي تملأ السقالة لإجهادات التمدد الدوري والقص التي تنشأ نتيجة للبيئة الدموية. وقد ذكرت العديد من الدراسات تأثير تحفيزي من (دوري) تمتد على تشكيل مكونات مصفوفة, مثل الكولاجين16,17,18,19, الجليكوسامينوجليكان (GAGs)20, والإيلاستين21,22, من قبل أنواع مختلفة من الخلايا. على سبيل المثال، أثبت هوانغ وآخرون أن امتداد ثنائي ساكسيال رفع ترسب وتنظيم الكولاجين والإيلاستين في المختبر TEVGs باستخدام مفاعل حيوي الأوعية الدموية23. في حين أن التركيز يكمن عادة على التمدد كحمل مهيمن ، فإن هذه الدراسات غالبا ما تستخدم المفاعلات الحيوية التي تحركها التدفق والتي تتعرض فيها العينة أيضا لتدفق القص. على الرغم من أنه لا يعرف سوى القليل نسبيا عن التأثير المعزول لضغوط القص على تكوين الأنسجة والالتهاب في 3D ، إلا أن بعض البيانات متوفرة. على سبيل المثال، أظهر Hinderer et al. و Eoh وآخرون أن تدفق القص، بالإضافة إلى البنية الدقيقة للسقالة ثلاثية الأبعاد، كان مهما لتشكيل الإيلاستين الناضج بواسطة خلايا العضلات الملساء الوعائية البشرية في نظام نموذج المختبر24،25. وإجمالا، توضح هذه النتائج أهمية كل من التمدد الدوري والإجهاد القصي ل TE القلبي الوعائي.

محدد مهم آخر لنجاح أو فشل يزرع TE هو استجابة المضيف المناعية للكسب غير المشروع المزروعة26. وهذا مهم بشكل خاص لاستراتيجيات TE التي تحركها المواد في الموقع ، والتي تعتمد في الواقع على الاستجابة الالتهابية الحادة للسقالة لبدء العمليات اللاحقة لتدفق الخلايا وتشكيل الأنسجة الذاتية وإعادة عرض27. الماكروفاج هو البادئ الحاسم لتجديد الأنسجة الوظيفية، والتي أظهرتها دراسات متعددة28،29،30. مماثلة لتضميد الجروح، ويحكم تجديد الأنسجة من قبل إشارات الباراكورين بين الضامة والخلايا المنتجة للأنسجة مثل الخلايا الليفية والخلايا العضليةالليفية 31،32،33. بالإضافة إلى تنسيق ترسب الأنسجة الجديدة ، وتشارك الضامة في ارتشاف نشط من المواد سقالة الأجنبية34،35. على هذا النحو ، تم تحديد استجابة الضامة في المختبر للمواد الحيوية كمعلمة تنبؤية لنجاح الجسم الحي للغرسات36و37و38.

تعتمد استجابة الضامة على السقالة المزروعة على ميزات تصميم السقالات مثل تكوين المواد والبنية المجهرية35و39و40. بالإضافة إلى خصائص السقالة ، تتأثر استجابة الضامة إلى سقالة ومكائدها المتقاطعة مع الخلايا الميوفيبروبلاست أيضا بالأحمال الديناميكية الدموية. على سبيل المثال، تبين أن امتداد دوري هو المغير المهم للنمط الظاهري الضام41،42،43،44 وإفراز السيتوكينات43،44،45،46 في سقالات كهربائية ثلاثية الأبعاد. باستخدام نظام الثقافة المشتركة من الضامة وخلايا العضلات الملساء الوعائية، أظهر باتيستون وآخرون أن وجود الضامة أدى إلى زيادة مستويات الإيلاستين وGAGs وأن المستويات المعتدلة من الامتداد الدوري (1.07-1.10) حفزت ترسب الكولاجين I والإيلاستين47. في الأعمال السابقة، لقد أثبتنا أن الإجهاد القص هو محدد مهم للتجنيد monocyte في سقالات electrospun 3D48،49،وأن كلا من الإجهاد القص وتمتد دوري تؤثر على الإشارات الباراترين بين الخلايا الأحادية البشرية والخلايا النجمية mesenchymal50. أظهر فاهي وآخرون أن تدفق القص زاد من إفراز السيتوكينات المؤيدة للالتهابات بواسطة الخلايا الأحادية البشرية51.

إذا أخذنا معا، فإن الأدلة المذكورة أعلاه تظهر أن الفهم الكافي للأحمال الديناميكية الدموية والتحكم فيها أمر بالغ الأهمية ل TE القلب والأوعية الدموية، وأنه من المهم النظر في الاستجابة الالتهابية لتحقيق ذلك. وقد وصفت العديد من المفاعلات الحيوية سابقا للمزود في المختبر52،53،54،55،56،57،58 أو ex vivo59،60،61 ثقافة أنسجة القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك، تم تصميم جميع هذه الأنظمة لمحاكاة ظروف التحميل الهيمودية الفسيولوجية قدر الإمكان. في حين أن هذا هو قيمة للغاية لغرض خلق أنسجة القلب والأوعية الدموية في المختبر أو الحفاظ على الثقافات الجسم الحي السابق، مثل هذه النظم لا تسمح لدراسات منهجية في الآثار الفردية للإشارات الفردية. وذلك لأن تطبيق كل من التمدد الدوري والإجهاد القص في هذه المفاعلات الحيوية مدفوعة بنفس التدفق المضغوط ، الذي يربط بينهما في جوهره. في حين تم وصف النظم الدقيقة التي تسمح للتلاعب الميكانيكية متعددة جديلة دقيقة لركائز 2D62 أو 3D هيدروجيل الاجهزة63،64، مثل هذه الاجهزة لا تسمح لدمج السقالات 3D elastomeric المواد الحيوية.

هنا، نقدم تطبيق نظام المفاعل الحيوي أنبوبي التي تمكن بشكل فريد من فصل الإجهاد القص وتمتد دوري ويساعد على التحقيق ميكانيكيا آثارها الفردية والمجمعة. يسمح هذا النظام باختبار مجموعة واسعة من ترقيع الأوعية الدموية المهندسة للأنسجة (على سبيل المثال ، المنشأ الاصطناعي أو الطبيعي ، والهندسة المعمارية الدقيقة المختلفة ، والمساميات المختلفة). لفصل فعال تطبيق الإجهاد القص وتمتد، والمفاهيم الرئيسية التي يستخدمها المفاعل الحيوي هي (1) فصل السيطرة على الإجهاد القص وتمتد باستخدام أنظمة مضخة متميزة و (2) تحفيز السقالات بطريقة “من الداخل إلى الخارج” مع أبعاد مدفوعة حسابيا. يتم تطبيق التدفق على السطح الخارجي للسقالة الأنبوبية من خلال استخدام مضخة تدفق ، في حين يتم حث الامتداد المحيطي للسقالة عن طريق توسيع أنبوب السيليكون الذي يتم تركيب السقالة عليه من خلال استخدام مضخة إجهاد منفصلة. يتم اختيار أبعاد أنبوب السيليكون وأنبوب الزجاج الذي يحتوي على البناء بعناية والتحقق من صحتها باستخدام محاكاة ديناميات السوائل الحسابية ، لضمان أن إجهاد القص على السقالة (بسبب التدفق) والتمدد المحيطي (بسبب توسع الأنبوب) لا يؤثران بشكل كبير على بعضهما البعض. هذا التصميم من الداخل إلى الخارج له عدة مبررات عملية. إذا تم تطبيق التمدد بواسطة ضغط السائل الإنارة (على غرار التحميل الفسيولوجي) ، فإنه يتطلب بطبيعته تصميم العينة لتكون خالية من التسرب. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الضغط المطلوب لتمديد العينة سيتم تحديده بالكامل من خلال صلابة العينة ، والتي قد تختلف بين العينات وداخل عينة مع مرور الوقت ، مما يجعل من الصعب التحكم في الامتداد. هذا المفاعل الحيوي يتصاعد الكسب غير المشروع الأنسجة المهندسة حول أنبوب السيليكون ويسمح لتطبيق الإجهاد القص الجدار (WSS) على الجدار الخارجي للكسب غير المشروع ويضغط على الكسب غير المشروع من الداخل. وبهذه الطريقة ، يمكن ضمان ظروف تحميل متساوية بين العينات وداخل العينات مع مرور الوقت ، وعلاوة على ذلك ، يسمح للعينات بأن تكون متسربة ، كما هو شائع للسقالات الوعائية المسامية19. يهدف هذا المفاعل الحيوي من الداخل إلى الخارج على وجه التحديد لإجراء دراسات منهجية حول آثار القص و / أو التمدد ، بدلا من هندسة وعاء دموي يشبه الأم في المختبر ، والذي تكون أجهزة المفاعل الحيوي الوعائية التقليدية أكثر ملاءمة له. انظر الشكل 1ألف – باء للاطلاع على رسومات تصميم المفاعل الحيوي، والجدول 1 المقابل له للحصول على وصف وظيفي ومنطقي وراء المكونات الرئيسية للمضبر الحيوي.

ويتجلى استخدام المفاعل الحيوي على أساس سلسلة من الدراسات الحديثة من قبل مجموعتنا التي قمنا بالتحقيق في التأثيرات الفردية والمجمعة من إجهاد القص وتمتد دوري على الالتهاب وتشكيل الأنسجة في سقالات electrospun قابلة لإعادة التكهرب في الموقع أنسجة القلب والأوعية الدموية19،43،44. وتحقيقا لتلك الإنسان الضامة والخلايا الميوفيبرومية إما في أحادية أو في ثقافة مشتركة لمحاكاة مختلف مراحل سلسلة التجدد في الموقع. لقد أثبتنا أن إفراز السيتوكين بواسطة الضامة البشرية يتأثر بشكل واضح بكل من التمدد الدوري والإجهاد القصي ، مما يؤثر على ترسب المصفوفة وتنظيمها من قبل الخلايا العضلية البشرية في هذه السقالات ، سواء عن طريق إشارات الباراكورين والاتصال المباشر19،43،44. وتجدر الإشارة إلى أن هذه الدراسات كشفت أنه في حالة التطبيق المشترك للإجهاد القص وتمتد، والآثار على تشكيل الأنسجة والتهاب إما تهيمن عليها واحدة من اثنين من الأحمال، أو هناك آثار التآزر من كلا الأحمال. توضح هذه النتائج أهمية فصل كلا الحمولتين للحصول على فهم أفضل لمساهمة البيئة الميكانيكية في عمليات TE. ويمكن تطبيق هذا الفهم لتحسين منهجي المعلمات تصميم سقالة في أنظمة التحميل الحيوية ذات الصلة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن البيانات الآلية المستمدة من هذه البيئات التي تسيطر عليها سيطرة جيدة قد تكون بمثابة مدخلات للنماذج العددية التي يجري تطويرها للتنبؤ بمسار إعادة عرض الأنسجة في الموقع، كما ورد مؤخرا بالنسبة ل TEVGs65 أو TEHVs66،لزيادة تحسين القدرة التنبؤية.

Protocol

في الدراسات الموصوفة في هذا البروتوكول، تم استخدام الضامة البشرية الأولية المعزولة عن معاطف برتقالي الدم المحيطي والخلايا الميوفيبروبلاست البشرية المعزولة عن الوريد الشافيني بعد جراحة المرور الشرياني التاجي44. تم الحصول على المعاطف بافي من صحية، والمتطوعين مجهولي الهوية ا…

Representative Results

تم تطوير هذا المفاعل الحيوي لدراسة الآثار الفردية والمجمعة لإجهاد القص والتمدد الدوري على نمو الأنسجة الوعائية وإعادة عرضها في سقالات المواد الحيوية ثلاثية الأبعاد. تصميم المفاعل الحيوي يسمح لزراعة ما يصل إلى ثمانية بنيات الأوعية الدموية تحت ظروف التحميل المختلفة(الشكل 1A</stro…

Discussion

يسمح المفاعل الحيوي الموصوف هنا بإجراء تقييم منهجي لمساهمات التأثيرات الفردية والمجمعة لإجهاد القص والتمدد الدوري على الالتهاب وتجديد الأنسجة في السقالات القابلة للتكثير الأنبوبي. ويتيح هذا النهج أيضا إجراء مجموعة كبيرة ومتنوعة من التحليلات على البنى الوعائية، كما يتضح من قسم النتائج …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يتم دعم هذه الدراسة ماليا من قبل ZonMw كجزء من برنامج LSH 2Treat (436001003) ومؤسسة الكلى الهولندية (14a2d507). ن. أ. ك. تعترف بدعم مجلس البحوث الأوروبي (851960). ونعرب عن امتناننا لبرنامج الجاذبية “تجديد المواد المدفوعة”، الذي تموله المنظمة الهولندية للبحث العلمي (024.003.013).

Materials

advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM) Gibco 12491-015 cell culture medium for fibroblasts
Aqua Stabil Julabo 8940012 prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir
Bovine fibrinogen Sigma F8630 to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Bovine thrombin Sigma T4648 to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Centrifuge Eppendorf 5804 to spin down cells and conditioned medium
Clamp scissor – "kelly forceps" Almedic P-422 clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)
CO2 cell culture incubators Sanyo MCO-170AIC-PE for cell culturing
Compressed air reservoir Festo CRVZS-5 smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up
Custom Matlab script to calculate the maximum stretches Matlab R2017. The Mathworks, Natick, MA calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold
Data acquisition board National Instruments BNC-2090 data processing in between amplifier system and computer
Ethanol VWR VWRK4096-9005 to keep sterile working conditions
Fetal bovine calf serum (FBS) Greiner 758087 cell culture medium supplement; serum-supplement
Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)
Glass Pasteur pipet Assistant HE40567002 apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)
Glass tubes of the flow culture chamber Custon made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technology n.a. part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)
GlutaMax Gibco 35050061 cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up
High speed camera MotionScope M-5 to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
High speed camera lens – Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 – lens Nikon JAA616AB to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
Hose clip ibidi GmbH 10821 block medium flow (autoclave at step 1, step 7)
Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)
Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads ibidi GmbH 10902 set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.
Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped) Swann Morton 0301; 0933 to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material
LabVIEW Software National Instruments version 2018 to control the stretch applied to the scaffolds
Laminar flow biosafety cabinet with UV light Labconco 302310001 to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving
Large and small petri dishes Greiner 664-160 for sterile working conditions
L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C) Sigma A8960 cell culture medium supplement, important for collagen production
LED light cold source KL2500 Zeiss Schott AG to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch
Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps ibidi GmbH various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories) to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)
Measuring amplifier (PICAS) PEEKEL instruments B.V. n.a. to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView
Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders ibidi GmbH 10974 medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)
Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter Rubber BV 1805 to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing
Motion Studio Software Idtvision 2.15.00 to make the high speed time lapse images for stretch monitoring
Needle (19G) BD Microlance 301700 together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles
Needle driver Adson 2429218 to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)
Paper tissues Kleenex 38044001 for cleaning of the equipment with 70% ethanol
Parafilm Sigma P7793-1EA quick fix if leakage occurs
Penicillin/streptomycin (P/S) Lonza DE17-602E cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P4417-100TAB for storage and washing steps (autoclave at step 1)
Plastic containers (60 mL) with red screw caps Greiner 206202 to prepare the fibrinogen solution
Pneumatic cylinder Festo AEVC-20-10-I-P to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length) SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands n.a. produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details
Pressure conduit without holes (for static control) Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)
Pressure sensor and transducer BD TC-XX and P 10 EZ the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure
Proportional air pressure control valve and pressure sensor Festo MPPES-3-1/8-2-010, 159596 provides compressed air to the pneumatic actuated pump
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) Gibco A1049101 cell culture medium for monocyte/macrophage
Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL) Eppendorf 30120086 multiple applications (autoclave at step 1)
Sodium dodecyl sulfate solution 20% Sigma 5030 Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.  
Silicone O-rings Technirub 1250S to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)
Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness) Rubber BV 1805 to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)
Sterile tube (15 mL) Falcon 352095 multiple applications
Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle Ethicon, Johnson&Johnson EH7404H Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)
Syringe (24 mL) B. Braun Melsungen AG 2057932 to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber
Syringe filter (0.2 µm) Satorius 17597-K to filter the fibrinogen solution
T150 cell culture flask with filter cap Nunc 178983 to degas culture medium
T75 Cell culture flask with filter cap Nunc 156499 to culture static control samples
Teflon bellow Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Tray (stainless steel) PolarWare 15-248 for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)
Tweezers Wironit 4910 sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)
Ultrapure water Stakpure Omniapure UV 18200002 to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)
UV light Philips TUV 30W/G30 T8 for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chlupác, J., Filová, E., Bacáková, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiological Research. 58, 119-139 (2009).
  2. Huygens, S. A., et al. Bioprosthetic aortic valve replacement in elderly patients: Meta-analysis and microsimulation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 157 (6), 2189-2197 (2019).
  3. Huygens, S. A., et al. Contemporary outcomes after surgical aortic valve replacement with bioprostheses and allografts: a systematic review and meta-analysis. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (4), 605-616 (2016).
  4. Loh, S. A., et al. Mid- and long-term results of the treatment of infrainguinal arterial occlusive disease with precuffed expanded polytetrafluoroethylene grafts compared with vein grafts. Annals of Vascular Surgery. 27 (2), 208-217 (2013).
  5. Tara, S., et al. Vessel bioengineering. Circulation Journal. 78 (1), 12-19 (2014).
  6. Huang, A. H., Niklason, L. E. Engineering of arteries in vitro. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (11), 2103-2118 (2014).
  7. Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M., Baaijens, F. P. T. Can we grow valves inside the heart? Perspective on material-based in situ heart valve tissue engineering. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 54 (2018).
  8. Fioretta, E. S., et al. Next-generation tissue-engineered heart valves with repair, remodelling and regeneration capacity. Nature Reviews Cardiology. , (2020).
  9. Kirkton, R. D., et al. Bioengineered human acellular vessels recellularize and evolve into living blood vessels after human implantation. Science Translational Medicine. 11 (485), (2019).
  10. Gutowski, P., et al. Arterial reconstruction with human bioengineered acellular blood vessels in patients with peripheral arterial disease. Journal of Vascular Surgery. , (2020).
  11. Syedain, Z., et al. Tissue engineering of acellular vascular grafts capable of somatic growth in young lambs. Nature Communications. 7 (12951), 12951 (2016).
  12. Sugiura, T., et al. Tissue-engineered vascular grafts in children with congenital heart disease: intermediate term follow-up. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery. 30 (2), 175-179 (2018).
  13. Kluin, J., et al. In situ heart valve tissue engineering using a bioresorbable elastomeric implant – material design to 12 months follow-up in sheep. Biomaterials. 125, 101-117 (2017).
  14. Fioretta, E. S., et al. Differential leaflet remodeling of bone marrow cell pre-seeded versus nonseeded bioresorbable transcatheter pulmonary valve replacements. JACC. Basic to Translational Science. 5 (1), 15-31 (2020).
  15. Van Haaften, E. E., Bouten, C. V. C., Kurniawan, N. A. Vascular mechanobiology: towards control of. Cells. , 1-24 (2017).
  16. De Jonge, N., et al. Matrix production and organization by endothelial colony forming cells in mechanically strained engineered tissue constructs. PLoS ONE. 8 (9), 73161 (2013).
  17. Schmidt, J. B., Chen, K., Tranquillo, R. T. Effects of intermittent and incremental cyclic stretch on ERK signaling and collagen production in engineered tissue. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (1), 55-64 (2016).
  18. Luo, J., et al. Tissue-engineered vascular grafts with advanced mechanical strength from human iPSCs. Cell Stem Cell. 26 (2), 251-261 (2020).
  19. Van Haaften, E. E., et al. Decoupling the effect of shear stress and stretch on tissue growth and remodeling in a vascular graft. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (7), 418-429 (2018).
  20. Gupta, V., Tseng, H., Lawrence, B. D., Jane Grande-Allen, K. Effect of cyclic mechanical strain on glycosaminoglycan and proteoglycan synthesis by heart valve cells. Acta Biomaterialia. 5 (2), 531-540 (2009).
  21. Lin, S., Mequanint, K. Bioreactor-induced mesenchymal progenitor cell differentiation and elastic fiber assembly in engineered vascular tissues. Acta Biomaterialia. 59, 200-209 (2017).
  22. Venkataraman, L., Bashur, C. A., Ramamurthi, A. Impact of cyclic stretch on induced elastogenesis within collagenous conduits. Tissue Engineering. Part A. 20 (9-10), 1403-1415 (2014).
  23. Huang, A. H., et al. Biaxial stretch improves elastic fiber maturation, collagen arrangement, and mechanical properties in engineered arteries. Tissue Engineering Part C Methods. 22 (6), 524-533 (2016).
  24. Hinderer, S., et al. In vitro elastogenesis: instructing human vascular smooth muscle cells to generate an elastic fiber-containing extracellular matrix scaffold. Biomedical Materials. 10 (3), 034102 (2015).
  25. Eoh, J. H., et al. Enhanced elastin synthesis and maturation in human vascular smooth muscle tissue derived from induced-pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 52, 49-59 (2017).
  26. Smits, A. I. P. M., Bouten, C. V. C. Tissue engineering meets immunoengineering: Prospective on personalized in situ tissue engineering strategies. Current Opinion in Biomedical Engineering. 6, 17-26 (2018).
  27. Wissing, T. B., Bonito, V., Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M. Biomaterial-driven in situ cardiovascular tissue engineering-a multi-disciplinary perspective. npj Regenerative Medicine. 2 (1), 18 (2017).
  28. Hibino, N., et al. A critical role for macrophages in neovessel formation and the development of stenosis in tissue-engineered vascular grafts. The FASEB Journal. 25 (12), 4253-4263 (2011).
  29. Godwin, J. W., Pinto, A. R., Rosenthal, N. A. Macrophages are required for adult salamander limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9415-9420 (2013).
  30. Godwin, J. W., Debuque, R., Salimova, E., Rosenthal, N. A. Heart regeneration in the salamander relies on macrophage-mediated control of fibroblast activation and the extracellular landscape. npj Regenerative Medicine. 2 (1), 22 (2017).
  31. McBane, J. E., Cai, K., Labow, R. S., Santerre, J. P. Co-culturing monocytes with smooth muscle cells improves cell distribution within a degradable polyurethane scaffold and reduces inflammatory cytokines. Acta Biomaterialia. 8 (2), 488-501 (2012).
  32. Battiston, K. G., Ouyang, B., Labow, R. S., Simmons, C. A., Santerre, J. P. Monocyte/macrophage cytokine activity regulates vascular smooth muscle cell function within a degradable polyurethane scaffold. Acta Biomaterialia. 10 (3), 1146-1155 (2014).
  33. Ploeger, D. T., et al. Cell plasticity in wound healing: paracrine factors of M1/ M2 polarized macrophages influence the phenotypical state of dermal fibroblasts. Cell Communication and Signaling. 11 (1), 29 (2013).
  34. McBane, J. E., Santerre, J. P., Labow, R. S. The interaction between hydrolytic and oxidative pathways in macrophage-mediated polyurethane degradation. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 82 (4), 984-994 (2007).
  35. Wissing, T. B., et al. Macrophage-driven biomaterial degradation depends on scaffold microarchitecture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 87 (2019).
  36. Wolf, M. T., Vodovotz, Y., Tottey, S., Brown, B. N., Badylak, S. F. Predicting in vivo responses to biomaterials via combined in vitro and in silico analysis. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (2), 148-159 (2015).
  37. Grotenhuis, N., Bayon, Y., Lange, J. F., Van Osch, G. J. V. M., Bastiaansen-Jenniskens, Y. M. A culture model to analyze the acute biomaterial-dependent reaction of human primary macrophages. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 115-120 (2013).
  38. Jannasch, M., et al. A comparative multi-parametric in vitro model identifies the power of test conditions to predict the fibrotic tendency of a biomaterial. Scientific Reports. 7 (1), 1689 (2017).
  39. Wang, Z., et al. The effect of thick fibers and large pores of electrospun poly(ε-caprolactone) vascular grafts on macrophage polarization and arterial regeneration. Biomaterials. 35 (22), 5700-5710 (2014).
  40. McWhorter, F. Y., Davis, C. T., Liu, W. F. Physical and mechanical regulation of macrophage phenotype and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (7), 1303-1316 (2014).
  41. Ballotta, V., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Strain-dependent modulation of macrophage polarization within scaffolds. Biomaterials. 35 (18), 4919-4928 (2014).
  42. Dziki, J. L., et al. The effect of mechanical loading upon extracellular matrix bioscaffold-mediated skeletal muscle remodeling. Tissue Engineering. Part A. 24 (1-2), 34-46 (2018).
  43. Wissing, T. B., et al. Hemodynamic loads distinctively impact the secretory profile of biomaterial-activated macrophages – implications for in situ vascular tissue engineering. Biomaterials Science. 8 (1), 132-147 (2020).
  44. Van Haaften, E. E., Wissing, T. B., Kurniawan, N. A., Smits, A. I. P. M., Bouten, C. V. C. Human in vitro model mimicking material-driven vascular regeneration reveals how cyclic stretch and shear stress differentially modulate inflammation and matrix deposition. Advanced Biosystems. 4 (6), 1900249 (2020).
  45. Ballotta, V., Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Synergistic protein secretion by mesenchymal stromal cells seeded in 3D scaffolds and circulating leukocytes in physiological flow. Biomaterials. 35 (33), 9100-9113 (2014).
  46. Bonito, V., de Kort, B. J., Bouten, C. V. C., Smits, A. I. P. M. Cyclic strain affects macrophage cytokine secretion and extracellular matrix turnover in electrospun scaffolds. Tissue Engineering Part A. 25 (17-18), 1310-1325 (2019).
  47. Battiston, K. G., Labow, R. S., Simmons, C. A., Santerre, J. P. Immunomodulatory polymeric scaffold enhances extracellular matrix production in cell co-cultures under dynamic mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 24, 74-86 (2015).
  48. Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. A mesofluidics-based test platform for systematic development of scaffolds for in situ cardiovascular tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (6), 475-485 (2012).
  49. Smits, A. I. P. M., Ballotta, V., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. T. Shear flow affects selective monocyte recruitment into MCP-1-loaded scaffolds. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (11), 2176-2188 (2014).
  50. Ballotta, V., Smits, A. I. P. M., Driessen-Mol, A., Bouten, C. V. C., Baaijens, F. P. T. Synergistic protein secretion by mesenchymal stromal cells seeded in 3D scaffolds and circulating leukocytes in physiological flow. Biomaterials. 35 (33), 9100-9113 (2014).
  51. Fahy, N., Menzel, U., Alini, M., Stoddart, M. J. Shear and dynamic compression modulates the inflammatory phenotype of human monocytes in vitro. Frontiers in Immunology. 10, 383 (2019).
  52. Pennings, I., et al. Layer-specific cell differentiation in bi-layered vascular grafts under flow perfusion. Biofabrication. 12 (1), 015009 (2019).
  53. Wang, J., et al. Ex vivo blood vessel bioreactor for analysis of the biodegradation of magnesium stent models with and without vessel wall integration. Acta Biomater. 50, 546-555 (2017).
  54. Huang, A. H., et al. Design and use of a novel bioreactor for regeneration of biaxially stretched tissue-engineered vessels. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (8), 841-851 (2015).
  55. Huang, A. H., Niklason, L. E. Engineering biological-based vascular grafts using a pulsatile bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (52), e2646 (2011).
  56. Bono, N., et al. A Dual-mode bioreactor system for tissue engineered vascular models. Annals of Biomedical Engineering. 45 (6), 1496-1510 (2017).
  57. Wolf, F., et al. VascuTrainer: a mobile and disposable bioreactor system for the conditioning of tissue-engineered vascular grafts. Annals of Biomedical Engineering. 46 (4), 616-626 (2018).
  58. Ramaswamy, S., et al. A novel bioreactor for mechanobiological studies of engineered heart valve tissue formation under pulmonary arterial physiological flow conditions. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (12), 121009 (2014).
  59. Piola, M., et al. A compact and automated ex vivo vessel culture system for the pulsatile pressure conditioning of human saphenous veins. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (3), 204-215 (2016).
  60. Vanerio, N., Stijnen, M., de Mol, B. A. J. M., Kock, L. M. An innovative ex vivo vascular bioreactor as comprehensive tool to study the behavior of native blood vessels under physiologically relevant conditions. Journal of Engineering and Science in Medical Diagnostics and Therapy. 2 (4), (2019).
  61. Kural, M. H., Dai, G., Niklason, L. E., Gui, L. An ex vivo vessel injury model to study remodeling. Cell Transplantation. 27 (9), 1375-1389 (2018).
  62. Sinha, R., et al. A medium throughput device to study the effects of combinations of surface strains and fluid-flow shear stresses on cells. Lab on a Chip. 15 (2), 429-439 (2015).
  63. Beca, B. M., Sun, Y., Wong, E., Moraes, C., Simmons, C. A. Dynamic bioreactors with integrated microfabricated devices for mechanobiological screening. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 581-592 (2019).
  64. Liu, H., Usprech, J., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform with hydrogel arrays for 3D mechanical stimulation of cells. Acta Biomaterialia. 34, 113-124 (2016).
  65. Szafron, J. M., Ramachandra, A. B., Breuer, C. K., Marsden, A. L., Humphrey, J. D. Optimization of tissue-engineered vascular graft design using computational modeling. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 561-570 (2019).
  66. Emmert, M. Y., et al. Computational modeling guides tissue-engineered heart valve design for long-term in vivo performance in a translational sheep model. Science Translational Medicine. 10 (440), (2018).
  67. Mol, A., et al. Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications. Biomaterials. 26 (16), 3113-3121 (2005).
  68. van Kelle, M. A. J., et al. A Bioreactor to identify the driving mechanical stimuli of tissue growth and remodeling. Tissue Engineering Part C: Methods. 23 (6), (2017).
  69. van den Broek, C. N., et al. Medium with blood-analog mechanical properties for cardiovascular tissue culturing. Biorheology. 45 (6), 651-661 (2008).

Tags

BioreactorMulti-cueInflammatoryRegenerativeBiomaterialsFlowStretchHemodynamicsSheer StressCyclic StretchElectrospun ScaffoldSilicone TubingSuturePressure ConduitO-ringAdapter Bushing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Koch, S. E., van Haaften, E. E., Wissing, T. B., Cuypers, L. A. B., Bulsink, J. A., Bouten, C. V. C., Kurniawan, N. A., Smits, A. I. P. M. A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch. J. Vis. Exp. (166), e61824, doi:10.3791/61824 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image