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공학

Ein Multi-Cue-Bioreaktor zur Bewertung der entzündlichen und regenerativen Kapazität von Biomaterialien unter Strömung und Dehnung

Published: December 10, 2020
doi:
10.3791/61824
, , , , , , ,
1Department of Biomedical Engineering,Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems (ICMS),Eindhoven University of Technology

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine dynamische Kokultur von menschlichen Makrophagen und Myofibroblasten in röhrenförmigen elektrogesponnenen Gerüsten durchzuführen, um die materialgetriebene Geweberegeneration mit einem Bioreaktor zu untersuchen, der die Entkopplung von Scherspannung und zyklischer Dehnung ermöglicht.

Abstract

Die Verwendung resorbierbarer Biomaterialien zur Induktion der Regeneration direkt im Körper ist aus translationaler Sicht eine attraktive Strategie. Solche Materialien induzieren bei der Implantation eine Entzündungsreaktion, die der Treiber für die anschließende Resorption des Materials und die Regeneration von neuem Gewebe ist. Diese Strategie, auch bekannt als In-situ-Gewebe-Engineering, wird verfolgt, um kardiovaskulären Ersatz wie Gewebe-Engineering-Gefäßtransplantate zu erhalten. Sowohl der entzündungsbedingte als auch der regenerative Prozess wird durch die lokalen biomechanischen Hinweise auf dem Gerüst (d.h. Dehnungs- und Scherstress) bestimmt. Hier beschreiben wir detailliert den Einsatz eines speziell entwickelten Bioreaktors, der auf einzigartige Weise die Entkopplung von Dehnungs- und Scherspannung an einem Rohrgerüst ermöglicht. Dies ermöglicht die systematische und standardisierte Bewertung der Entzündungs- und Regenerationsfähigkeit von Rohrgerüsten unter dem Einfluss gut kontrollierter mechanischer Belastungen, die wir anhand eines dynamischen Kokulturexperiments mit menschlichen Makrophagen und Myofibroblasten demonstrieren. Die wichtigsten praktischen Schritte in diesem Ansatz – der Bau und die Einrichtung des Bioreaktors, die Vorbereitung der Gerüste und die Zellaussaat, die Anwendung und Aufrechterhaltung des Stretch- und Scherflusses sowie die Probenernte für die Analyse – werden ausführlich diskutiert.

Introduction

Kardiovaskuläres Tissue Engineering (TE) wird als alternative Behandlungsoption zu den derzeit verwendeten permanenten Herz-Kreislauf-Prothesen (z.B. Gefäßtransplantate, Herzklappenersatz) verfolgt, die für große Kohorten von Patienten suboptimal sind1,2,3,4. Zu den gefragten Anwendungen gehören Gewebe-Engineering-Gefäßtransplantate (TEVGs)5,6 und Herzklappen (TEHVs)7,8. Meistens verwenden kardiovaskuläre TE-Methoden resorbierbare Biomaterialien (entweder natürliche oder synthetische), die als lehrreiches Gerüst für das neu zu bildende Gewebe dienen. Die Bildung von neuem Gewebe kann entweder vollständig in vitro erfolgen, indem das Gerüst mit Zellen ausgesät und vor der Implantation in einem Bioreaktor (in vitro TE)9,10,11oder direkt in situ, in dem das synthetische Gerüst ohne Vorkultivierung implantiert wird, um die Bildung von neuem Gewebe direkt im Körper (in situ TE) 12 ,13,14zu induzieren . Sowohl bei in vitro als auch bei in situ kardiovaskulären TE-Ansätzen hängt eine erfolgreiche funktionelle Regeneration sowohl von der Immunantwort des Wirts auf das implantierte Konstrukt als auch von der entsprechenden biomechanischen Belastung ab.

Die Bedeutung der biomechanischen Belastung für kardiovaskuläre TE ist anerkannt15. Bei kardiovaskulären Implantaten sind die Zellen, die das Gerüst bevölkern, zyklischen Dehnungs- und Scherspannungen ausgesetzt, die durch die hämodynamische Umgebung entstehen. Zahlreiche Studien haben die stimulierende Wirkung von (zyklischer) Dehnung auf die Bildung von Matrixkomponenten wie Kollagen16 , 17,18,19,Glykosaminoglykanen (GAGs)20und Elastin21,22, durch verschiedene Zelltypen berichtet. Zum Beispiel zeigten Huang et al., dass biaxiale Dehnung die Ablagerung und Organisation von Kollagen und Elastin in in vitro TEVGs erhöhte, indem sie einen vaskulären Bioreaktor23verwendeten. Während der Schwerpunkt typischerweise auf der Dehnung als dominanter Last liegt, verwenden diese Studien oft strömungsgetriebene Bioreaktoren, bei denen die Probe auch dem Scherfluss ausgesetzt ist. Obwohl relativ wenig über den isolierten Einfluss von Scherspannungen auf Gewebebildung und Entzündungen in 3D bekannt ist, liegen einige Daten vor. Zum Beispiel zeigten Hinderer et al. und Eoh et al., dass der Scherfluss neben einer 3D-Gerüstmikrostruktur für die Bildung von reifem Elastin durch menschliche vaskuläre glatte Muskelzellen in einem In-vitro-Modellsystem wichtig ist24,25. Insgesamt veranschaulichen diese Ergebnisse die Relevanz von zyklischer Dehnung und Scherstress für kardiovaskuläre TE.

Eine weitere wichtige Determinante für den Erfolg oder Misserfolg von TE-Implantaten ist die Immunantwort des Wirts auf das implantierte Transplantat26. Dies ist besonders wichtig für materialgetriebene In-situ-TE-Strategien, die tatsächlich auf die akute Entzündungsreaktion auf das Gerüst angewiesen sind, um die nachfolgenden Prozesse des zellulären Zustroms und der endogenen Gewebebildung und -umgestaltung anzukurbeln27. Der Makrophagen ist ein kritischer Initiator der funktionellen Geweberegeneration, was durch mehrere Studien28,29,30gezeigt wurde. Analog zur Wundheilung wird die Regeneration des Gewebes durch parakrine Signalisierung zwischen Makrophagen und gewebeproduzierenden Zellen wie Fibroblasten und Myofibroblastengesteuert 31,32,33. Neben der Koordination neuer Gewebeablagerungen sind Makrophagen an der aktiven Resorption von Fremdgerüstmaterial beteiligt34,35. Als solches wurde die In-vitro-Makrophagenreaktion auf ein Biomaterial als prädiktiver Parameter für den In-vivo-Erfolg von Implantatenidentifiziert 36,37,38.

Die Makrophagenreaktion auf ein implantiertes Gerüst hängt von Gerüstdesignmerkmalen wie Materialzusammensetzung und Mikrostrukturab 35,39,40. Neben den Gerüsteigenschaften wird auch die Makrophagenreaktion auf ein Gerüst und deren Übersprechen mit Myofibroblasten durch hämodynamische Belastungen beeinflusst. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass zyklische Dehnung ein wichtiger Modulator des Makrophagenphänotyps41,42,43,44 und der Sekretion von Zytokinen43,44,45,46 in 3D-Elektrosponngerüsten ist. Battiston et al. zeigten unter Verwendung eines Co-Kultursystems aus Makrophagen und vaskulären glatten Muskelzellen, dass das Vorhandensein von Makrophagen zu erhöhten Elastin- und GAGsspiegeln führte und dass moderate Konzentrationen von zyklischer Dehnung (1,07-1,10) die Ablagerung von Kollagen I und Elastinstimulierten 47. In früheren Arbeiten haben wir gezeigt, dass Scherstress eine wichtige Determinante für die Rekrutierung von Monozyten in 3D-Elektrosponngerüste48,49ist und dass sowohl Scherstress als auch zyklische Dehnung die parakrine Signalübertragung zwischen menschlichen Monozyten und mesenchymalen Stromazellenbeeinflussen 50. Fahy et al. zeigten, dass der Scherfluss die Sekretion von entzündungsfördernden Zytokinen durch menschliche Monozyten erhöhte51.

Zusammengenommen zeigen die oben genannten Beweise, dass ein angemessenes Verständnis und eine angemessene Kontrolle der hämodynamischen Belastungen für die kardiovaskuläre TE von entscheidender Bedeutung sind und dass es wichtig ist, die Entzündungsreaktion zu berücksichtigen, um dies zu erreichen. Zahlreiche Bioreaktoren wurden zuvor für die in vitro 52 ,53,54,55,56,57,58 oder ex vivo59,60,61 Kultur von kardiovaskulären Geweben beschrieben. Alle diese Systeme sind jedoch so konzipiert, dass sie die physiologischen hämodynamischen Belastungsbedingungen so weit wie möglich nachahmen. Während dies für die Herstellung von Kardiovaskulärem Gewebe in vitro oder die Aufrechterhaltung von Ex-vivo-Kulturen sehr wertvoll ist, erlauben solche Systeme keine systematischen Untersuchungen der individuellen Auswirkungen einzelner Hinweise. Dies liegt daran, dass die Anwendung sowohl der zyklischen Dehnung als auch der Scherspannung in diesen Bioreaktoren durch die gleiche Druckströmung angetrieben wird, die sie untrennbar verbindet. Während Mikrosysteme, die eine genaue mechanische Manipulation mit mehreren Cues ermöglichen, für 2D-Substrate62 oder 3D-Hydrogel-Setups63,64beschrieben wurden, erlauben solche Setups nicht die Integration von elastomeren 3D-Biomaterialgerüsten.

Hier stellen wir die Anwendung eines röhrenförmigen Bioreaktorsystems vor, das auf einzigartige Weise die Entkopplung von Scherspannung und zyklischer Dehnung ermöglicht und hilft, ihre individuellen und kombinierten Wirkungen mechanistisch zu untersuchen. Dieses System ermöglicht die Prüfung einer Vielzahl von gewebezüchtigten Gefäßtransplantaten (z. B. synthetischer oder natürlicher Ursprung, unterschiedliche Mikroarchitektur, verschiedene Porositäten). Um die Anwendung von Scherspannung und Dehnung effektiv zu entkoppeln, sind die Schlüsselkonzepte, die der Bioreaktor verwendet, (1) die Trennung der Kontrolle von Scherspannung und Dehnung durch verschiedene Pumpensysteme und (2) die Stimulation der Gerüste in einer “Inside-Out” -Weise mit rechnerisch angetriebenen Abmessungen. Die Strömung wird auf der Außenfläche des Rohrgerüsts durch die Verwendung einer Strömungspumpe angewendet, während die umfangsbespannte Dehnung des Gerüsts durch Die Erweiterung eines Silikonrohrs, auf dem das Gerüst durch die Verwendung einer separaten Dehnungspumpe montiert ist, induziert wird. Die Abmessungen des Silikonrohrs und des Glasrohrs, das das Konstrukt enthält, werden sorgfältig ausgewählt und mit Hilfe von strömungsgestützten Simulationen validiert, um sicherzustellen, dass sich die Scherspannung auf dem Gerüst (aufgrund der Strömung) und die Umfangsdehnung (aufgrund der Rohrausdehnung) nicht signifikant beeinflussen. Dieses Inside-Out-Design hat mehrere praktische Gründe. Wenn die Dehnung durch den Luminalflüssigkeitsdruck (ähnlich der physiologischen Belastung) angelegt wird, muss das Probendesign von Natur aus leckagefrei sein. Darüber hinaus würde der druck, der zum Dehnen der Probe erforderlich ist, vollständig durch die Probensteifigkeit bestimmt, die zwischen den Proben und innerhalb einer Probe im Laufe der Zeit variieren kann, was es schwierig macht, die Dehnung zu kontrollieren. Dieser Bioreaktor montiert das Gewebe-Engineered Graft um einen Silikonschlauch und ermöglicht die Anwendung von Wall Shear Stress (WSS) an der Außenwand des Transplantats und druckt das Transplantat von innen. Auf diese Weise können gleiche Belastungsbedingungen zwischen Proben und innerhalb der Proben im Laufe der Zeit sichergestellt werden, und darüber hinaus dürfen die Proben undicht sein, wie es bei porösen Gefäßgerüsten üblich ist19. Dieser Inside-Out-Bioreaktor ist speziell für systematische Studien über die Auswirkungen von Scherung und / oder Dehnung gedacht, anstatt für die Entwicklung eines nativen Blutgefäßes in vitro, für das traditionelle vaskuläre Bioreaktor-Setups besser geeignet sind. Siehe Abbildung 1A–B für die Konstruktionszeichnungen des Bioreaktors und die entsprechende Tabelle 1 für eine funktionale Beschreibung und Begründung hinter den Hauptkomponenten des Bioreaktors.

Der Einsatz des Bioreaktors wird anhand einer Reihe neuerer Studien unserer Gruppe nachgewiesen, in denen wir die individuellen und kombinierten Einflüsse von Scherstress und zyklischer Dehnung auf Entzündung und Gewebebildung in resorbierbaren elektrosponnen Gerüsten für in situ kardiovaskuläres Gewebe untersucht haben19,43,44. Dazu haben wir menschliche Makrophagen und Myofibroblasten entweder in Mono- oder in Kokultur verwendet, um die verschiedenen Phasen der in situ regenerativen Kaskade zu simulieren. Wir haben gezeigt, dass die Zytokinsekretion durch menschliche Makrophagen sowohl durch zyklische Dehnung als auch durch Scherstress deutlich beeinflusst wird, was die Matrixablagerung und -organisation durch menschliche Myofibroblasten in diesen Gerüsten beeinflusst, sowohl über parakrine Signalisierung als auch durch direkten Kontakt19,43,44. Insbesondere zeigten diese Studien, dass bei kombinierter Anwendung von Scherstress und Dehnung die Auswirkungen auf Gewebebildung und Entzündung entweder von einer der beiden Lasten dominiert werden oder synergistische Effekte beider Lasten auftreten. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Relevanz der Entkopplung beider Lasten, um den Beitrag der mechanischen Umgebung zu TE-Prozessen besser zu verstehen. Dieses Verständnis kann angewendet werden, um Gerüstkonstruktionsparameter in relevanten hämodynamischen Belastungsregimen systematisch zu optimieren. Darüber hinaus können die mechanistischen Daten aus solchen gut kontrollierten Umgebungen als Input für numerische Modelle dienen, die entwickelt werden, um den Verlauf des In-situ-Gewebeumbaus vorherzusagen, wie kürzlich für TEVGs65 oder TEHVs66berichtet, um die Vorhersagefähigkeit weiter zu verbessern.

Protocol

In den in diesem Protokoll beschriebenen Studien wurden primäre menschliche Makrophagen, die aus peripheren Blutschichten isoliert wurden, und menschliche Myofibroblasten, die nach einer koronaren Umgehungsoperation aus der Vena saphena isoliert wurden, verwendet44. Die Buffy-Mäntel wurden von gesunden, anonymisierten Freiwilligen bezogen, die eine schriftliche Einwilligung nach Aufklärung erteilten, die vom Sanquin Research Institutional Medical Ethical Committee genehmigt wurde. Die Verwendun…

Representative Results

Dieser Bioreaktor wurde entwickelt, um die individuellen und kombinierten Auswirkungen von Scherstress und zyklischer Dehnung auf das Wachstum und den Umbau von Gefäßgewebe in 3D-Biomaterialgerüsten zu untersuchen. Das Design des Bioreaktors ermöglicht die Kultivierung von bis zu acht Gefäßkonstrukten unter verschiedenen Belastungsbedingungen (Abbildung 1A). Die Gefäßkonstrukte sind in einer Strömungskulturkammer (Abbildung 1B) positioniert, in der sowo…

Discussion

Der hier beschriebene Bioreaktor ermöglicht die systematische Bewertung der Beiträge der einzelnen und kombinierten Wirkungen von Scherstress und zyklischer Dehnung auf Entzündungen und Geweberegeneration in röhrenförmigen resorbierbaren Gerüsten. Dieser Ansatz ermöglicht auch eine Vielzahl von Analysen an vaskulären Konstrukten, wie im Abschnitt “Repräsentative Ergebnisse” veranschaulicht. Diese Ergebnisse zeigen den unverwechselbaren Einfluss der verschiedenen hämodynamischen Belastungsregime (d.h. verschiede…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wird von ZonMw im Rahmen des LSH 2Treat-Programms (436001003) und der Dutch Kidney Foundation (14a2d507) finanziell unterstützt. N.A.K. würdigt die Unterstützung des Europäischen Forschungsrats (851960). Wir danken dem Gravitationsprogramm “Materials Driven Regeneration”, das von der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung finanziert wird (024.003.013).

Materials

advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM) Gibco 12491-015 cell culture medium for fibroblasts
Aqua Stabil Julabo 8940012 prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir
Bovine fibrinogen Sigma F8630 to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Bovine thrombin Sigma T4648 to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold
Centrifuge Eppendorf 5804 to spin down cells and conditioned medium
Clamp scissor – "kelly forceps" Almedic P-422 clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7)
CO2 cell culture incubators Sanyo MCO-170AIC-PE for cell culturing
Compressed air reservoir Festo CRVZS-5 smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up
Custom Matlab script to calculate the maximum stretches Matlab R2017. The Mathworks, Natick, MA calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold
Data acquisition board National Instruments BNC-2090 data processing in between amplifier system and computer
Ethanol VWR VWRK4096-9005 to keep sterile working conditions
Fetal bovine calf serum (FBS) Greiner 758087 cell culture medium supplement; serum-supplement
Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7)
Glass Pasteur pipet Assistant HE40567002 apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1)
Glass tubes of the flow culture chamber Custon made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technology n.a. part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7)
GlutaMax Gibco 35050061 cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up
High speed camera MotionScope M-5 to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
High speed camera lens – Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 – lens Nikon JAA616AB to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles)
Hose clip ibidi GmbH 10821 block medium flow (autoclave at step 1, step 7)
Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7)
Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads ibidi GmbH 10902 set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied.
Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped) Swann Morton 0301; 0933 to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material
LabVIEW Software National Instruments version 2018 to control the stretch applied to the scaffolds
Laminar flow biosafety cabinet with UV light Labconco 302310001 to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving
Large and small petri dishes Greiner 664-160 for sterile working conditions
L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C) Sigma A8960 cell culture medium supplement, important for collagen production
LED light cold source KL2500 Zeiss Schott AG to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch
Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps ibidi GmbH various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories) to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7)
Measuring amplifier (PICAS) PEEKEL instruments B.V. n.a. to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView
Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders ibidi GmbH 10974 medium reservoir (autoclave at step 1, step 7)
Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter Rubber BV 1805 to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing
Motion Studio Software Idtvision 2.15.00 to make the high speed time lapse images for stretch monitoring
Needle (19G) BD Microlance 301700 together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles
Needle driver Adson 2429218 to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7)
Paper tissues Kleenex 38044001 for cleaning of the equipment with 70% ethanol
Parafilm Sigma P7793-1EA quick fix if leakage occurs
Penicillin/streptomycin (P/S) Lonza DE17-602E cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma P4417-100TAB for storage and washing steps (autoclave at step 1)
Plastic containers (60 mL) with red screw caps Greiner 206202 to prepare the fibrinogen solution
Pneumatic cylinder Festo AEVC-20-10-I-P to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length) SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands n.a. produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details
Pressure conduit without holes (for static control) Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7)
Pressure sensor and transducer BD TC-XX and P 10 EZ the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure
Proportional air pressure control valve and pressure sensor Festo MPPES-3-1/8-2-010, 159596 provides compressed air to the pneumatic actuated pump
Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) Gibco A1049101 cell culture medium for monocyte/macrophage
Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL) Eppendorf 30120086 multiple applications (autoclave at step 1)
Sodium dodecyl sulfate solution 20% Sigma 5030 Used to clean materials, at a concentration of 0.1%.  
Silicone O-rings Technirub 1250S to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7)
Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness) Rubber BV 1805 to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1)
Sterile tube (15 mL) Falcon 352095 multiple applications
Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle Ethicon, Johnson&Johnson EH7404H Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length)
Syringe (24 mL) B. Braun Melsungen AG 2057932 to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber
Syringe filter (0.2 µm) Satorius 17597-K to filter the fibrinogen solution
T150 cell culture flask with filter cap Nunc 178983 to degas culture medium
T75 Cell culture flask with filter cap Nunc 156499 to culture static control samples
Teflon bellow Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology n.a. to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7)
Tray (stainless steel) PolarWare 15-248 for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use)
Tweezers Wironit 4910 sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7)
Ultrapure water Stakpure Omniapure UV 18200002 to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1)
UV light Philips TUV 30W/G30 T8 for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding
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References

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Koch, S. E., van Haaften, E. E., Wissing, T. B., Cuypers, L. A. B., Bulsink, J. A., Bouten, C. V. C., Kurniawan, N. A., Smits, A. I. P. M. A Multi-Cue Bioreactor to Evaluate the Inflammatory and Regenerative Capacity of Biomaterials under Flow and Stretch. J. Vis. Exp. (166), e61824, doi:10.3791/61824 (2020).
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