विच्छेदन और देर से भ्रूण ड्रोसोफिला गोनाड के लाइव-इमेजिंग

Summary

यहां, हम देर से भ्रूण ड्रोसोफिला पुरुष गोनाड को लाइव-इमेज करने के लिए आवश्यक एक विच्छेदन प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल सामान्य परिस्थितियों में या ट्रांसजेनिक या औषधीय हेरफेर के बाद गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं के अवलोकन की अनुमति देगा।

Abstract

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर पुरुष भ्रूण गोनाड विकासात्मक जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक लाभप्रद मॉडल है, जिसमें रोगाणु कोशिका विकास, पीआईआरएनए जीव विज्ञान और आला गठन शामिल हैं, लेकिन सीमित नहीं हैं। यहां, हम एक विच्छेदन तकनीक पेश करते हैं ताकि एक अवधि के दौरान गोनाड पूर्व वीवो को लाइव-इमेजिंग की लाइव-इमेजिंग अत्यधिक अप्रभावी हो। यह प्रोटोकॉल रेखांकित करता है कि भ्रूण को इमेजिंग डिश में कैसे स्थानांतरित किया जाए, उचित रूप से मंचित पुरुष भ्रूण का चयन करें, और अभी भी अपनी संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखते हुए अपने आसपास के ऊतकों से गोनाड को विच्छेदित करें। विच्छेदन के बाद, गोनाड्स को गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं की कल्पना करने के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया जा सकता है। विच्छेदन प्रक्रिया के लिए सटीक समय और निपुणता की आवश्यकता होती है, लेकिन हम आम गलतियों को रोकने और इन चुनौतियों को दूर करने के तरीके के बारे में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। हमारे ज्ञान के लिए यह ड्रोसोफिला भ्रूण गोनाड के लिए पहला विच्छेदन प्रोटोकॉल है, और समय की अन्यथा दुर्गम खिड़की के दौरान लाइव-इमेजिंग की अनुमति देगा। इस तकनीक को औषधीय या सेल-प्रकार के विशिष्ट ट्रांसजेनिक जोड़तोड़ के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि उनके प्राकृतिक गोनाडल वातावरण में कोशिकाओं के भीतर या बीच में होने वाली किसी भी गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन किया जा सके।

Introduction

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर वृषण ने कई गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं की हमारी समझ के लिए एक प्रतिमान के रूप में कार्य किया है। इस मॉडल के अध्ययन ने स्टेम सेल डिवीजन विनियमन ^1,2,3, रोगाणु कोशिका विकास ^4,5, पीआरएनए जीव विज्ञान ^6,7,8, और आला-स्टेम सेल सिग्नलिंग घटनाओं ^{9,10,11,12,13} पर प्रकाश डाला ^है। यह मॉडल लाभप्रद है क्योंकि यह आनुवंशिक रूप से^14,15 तक चलने योग्य है और उन कुछ लोगों में से एक है जहां हम अपने प्राकृतिक वातावरण ^3,16,17,18 में स्टेम कोशिकाओं को जीवित कर सकते हैं। हालांकि, इस मॉडल की लाइव-इमेजिंग वयस्क ऊतक और प्रारंभिक भ्रूण चरणों तक सीमित है, जिससे देर से भ्रूण में गोनाडल गतिशीलता के हमारे ज्ञान में अंतर छोड़ दिया गया है, सटीक चरण जब आला पहली बार बन रहा है और कार्य करना शुरू कर रहा है।

देर से चरण भ्रूण गोनाड एक गोला है, जिसमें पूर्वकाल में दैहिक आला कोशिकाएं होती हैं, और रोगाणु कोशिकाएं अधिक पीछे के क्षेत्रों में दैहिक गोनाडल कोशिकाओं द्वारा एनिस्टेड होती^हैं। इस अंग को प्रारंभिक भ्रूण चरण 17 ^17,20,21 तक विवो में लाइव चित्रित किया जा सकता ^है। बड़े पैमाने पर मांसपेशियों के संकुचन की दीक्षा के कारण आगे की इमेजिंग को रोका जाता है। ये संकुचन इतने गंभीर हैं कि वे गोनाड को इमेजिंग फ्रेम से बाहर धकेलते हैं, और इस तरह के आंदोलन को इमेजिंग सॉफ़्टवेयर के साथ ठीक नहीं किया जा सकता है। हमारी प्रयोगशाला आला गठन के तंत्र का अनावरण करने में रुचि रखती है, जो लाइव-इमेजिंग के लिए इस मायावी अवधि के दौरान होती है। इसलिए, हमने भ्रूण चरण 16 पर शुरू होने वाले गोनाड को लाइव छवि के लिए एक पूर्व विवो दृष्टिकोण उत्पन्न किया, जिससे गोनाड विकास की इस महत्वपूर्ण अवधि के दौरान सेल गतिशीलता के अध्ययन की सुविधा मिलती है। हमारी प्रयोगशाला से पिछले काम से पता चलता है कि यह पूर्व विवो इमेजिंग ईमानदारी से vivo gonad विकास¹⁷ में recapitulates. यह तकनीक ड्रोसोफिला भ्रूण गोनाड के लिए अपनी तरह की पहली और एकमात्र तकनीक है।

यहां, हम देर से भ्रूण चरणों के दौरान गोनाड के पूर्व विवो लाइव-इमेजिंग के लिए आवश्यक विच्छेदन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल को औषधीय उपचार, या गोनाड के भीतर विशिष्ट सेल वंशों के ट्रांसजेनिक हेरफेर के साथ जोड़ा जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग करते हुए, हमने स्टेम सेल आला गठन¹⁷ के चरणों को सफलतापूर्वक चित्रित किया है। यह इमेजिंग दृष्टिकोण इस प्रकार स्टेम सेल जीव विज्ञान के क्षेत्र के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह अपने प्राकृतिक वातावरण^15,17 के भीतर वास्तविक समय में आला गठन के प्रारंभिक चरणों के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करेगा। हालांकि यह विधि स्टेम सेल जीव विज्ञान के क्षेत्र के लिए फायदेमंद है, यह इस विकासात्मक टाइमपॉइंट के दौरान गोनाड में होने वाली किसी भी गतिशील प्रक्रियाओं को देखने के लिए अतिरिक्त रूप से लागू होती है, जिसमें सेलुलर पुनर्व्यवस्था²², सेल आसंजन ^2,12,23 और सेल माइग्रेशन^{23 शामिल हैं}। यह विच्छेदन प्रोटोकॉल इस प्रकार कई मौलिक सेल जैविक प्रक्रियाओं की हमारी समझ को बढ़ाएगा।

Protocol

1. दिन से पहले विच्छेदन तैयारी इलेक्ट्रोलाइटिक रूप से एक टंगस्टन सुई24 को तेज करें ताकि परिणामी व्यास लगभग 0.03 मिमी हो। लगभग 14 V को आपूर्ति किए गए वोल्टेज को समायोजित करें, और 3.3 M NaOH का उपयोग करें। …

Representative Results

हम चित्रा 1 में इमेजिंग डिश की तैयारी का वर्णन करते हैं, जैसा कि “डे-ऑफ-विच्छेदन तैयारी” में वर्णित है। इन तरीकों के परिणामस्वरूप अंततः अच्छी तरह से हाइड्रेटेड भ्रूण एक कवर स्लिप स्ट्रिप का पा…

Discussion

गोनाडोजेनेसिस के दौरान, भ्रूण गोनाड, और विशेष रूप से पुरुष गोनाड¹⁵ के भीतर स्टेम सेल आला, तेजी से रूपात्मक परिवर्तनों से गुजरता है। विकासात्मक तंत्र जो इन गतिशील परिवर्तनों को रेखांकित करते है…

Materials

Alfa Aesar Tungsten wire	Fisher Scientific	AA10408G6	0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)
D. melanogaster: His2Av::mRFP1	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	FBtp0056035	Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007
D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato	Gift from Ruth Lehmann Lab		Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'
D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin		FBtp0083398	Sano et al., PLoS One, 2012
Diamond-tipped knife
Double-sided tape	Scotch	665
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10082
Imaging dish	MatTek	P35GC-1.5-14-C
Imaging software	Molecular Devices		MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0
Insulin, bovine	Sigma	l0516	Store aliquots at 4 °C
Needle holder	Fisher Scientific	08-955
Nytex basket
Penicillin/streptomycin	Corning	30-002-Cl
Ringer's solution			2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved
Schneider's Insect Media	GIBCO	21720-024