Dissection et imagerie en direct de la drosophile embryonnaire tardive Gonad

Summary

Ici, nous fournissons un protocole de dissection nécessaire pour représenter en direct la gonade mâle embryonnaire tardive de la drosophile . Ce protocole permettra d’observer des processus cellulaires dynamiques dans des conditions normales ou après manipulation transgénique ou pharmacologique.

Abstract

La gonade embryonnaire mâle Drosophila melanogaster est un modèle avantageux pour étudier divers aspects de la biologie du développement, y compris, mais sans s’y limiter, le développement des cellules germinales, la biologie des piARN et la formation de niches. Ici, nous présentons une technique de dissection pour imager en direct la gonade ex vivo pendant une période où l’imagerie en direct in vivo est très inefficace. Ce protocole décrit comment transférer des embryons dans une boîte d’imagerie, choisir des embryons mâles mis en scène de manière appropriée et disséquer la gonade de ses tissus environnants tout en maintenant son intégrité structurelle. Après dissection, les gonades peuvent être imagées à l’aide d’un microscope confocal pour visualiser les processus cellulaires dynamiques. La procédure de dissection nécessite un timing et une dextérité précis, mais nous fournissons un aperçu de la façon de prévenir les erreurs courantes et de surmonter ces défis. À notre connaissance, il s’agit du premier protocole de dissection pour la gonade embryonnaire de la drosophile et permettra l’imagerie en direct pendant une fenêtre de temps autrement inaccessible. Cette technique peut être combinée avec des manipulations transgéniques pharmacologiques ou spécifiques au type cellulaire pour étudier tout processus dynamique se produisant à l’intérieur ou entre les cellules dans leur environnement gonadique naturel.

Introduction

Le testicule drosophila melanogaster a servi de paradigme pour notre compréhension de nombreux processus cellulaires dynamiques. Les études de ce modèle ont mis en lumière la régulation^de la division des cellules ^{souches 1,2,3}, le développement des cellules germinales ^4,5, la biologie des arnos ^6,7,8 et les événements de signalisation des cellules souches de niche ^{9,10,11,12,13}. Ce modèle est avantageux car il est génétiquement traitable^14,15 et est l’un des rares où l’on peut imager en direct des cellules souches dans leur environnement naturel ^3,16,17,18. Cependant, l’imagerie en direct de ce modèle a été limitée aux tissus adultes et aux premiers stades embryonnaires, laissant une lacune dans notre connaissance de la dynamique gonadique chez l’embryon tardif, le stade précis où la niche se forme et commence à fonctionner.

La gonade embryonnaire à un stade avancé est une sphère, composée de cellules de niche somatiques à l’antérieure et de cellules germinales enkystées par des cellules gonadiques somatiques dans des régions plus postérieures¹⁹. Cet organe peut être imagé en direct in vivo jusqu’au stade embryonnaire précoce 17 17,20,21. Une imagerie supplémentaire est empêchée en raison de l’initiation de contractions musculaires à grande échelle. Ces contractions sont si graves qu’elles poussent la gonade hors du cadre d’imagerie, et un tel mouvement ne peut pas être corrigé avec un logiciel d’imagerie. Notre laboratoire s’intéresse au dévoilement des mécanismes de formation de niches, qui se produit pendant cette période insaisissable pour l’imagerie en direct. Par conséquent, nous avons généré une approche ex vivo pour imager en direct la gonade à partir du stade embryonnaire 16, facilitant l’étude de la dynamique cellulaire pendant cette période cruciale du développement des gonades. Des travaux antérieurs de notre laboratoire montrent que cette imagerie ex vivo récapitule fidèlement le développement in vivo des gonades¹⁷. Cette technique est la première et la seule du genre pour la gonade embryonnaire de la drosophile.

Nous présentons ici le protocole de dissection requis pour l’imagerie en direct ex vivo de la gonade à la fin du stade embryonnaire. Ce protocole peut être combiné avec des traitements pharmacologiques ou une manipulation transgénique de lignées cellulaires spécifiques dans les gonades. En utilisant cette technique, nous avons photographié avec succès les étapes de la formation de niche de cellules souches¹⁷. Cette approche d’imagerie est donc déterminante pour le domaine de la biologie des cellules souches, car elle permettra de visualiser les premières étapes de la formation de niches en temps réel dans son environnement naturel^15,17. Bien que cette méthode soit bénéfique pour le domaine de la biologie des cellules souches, elle est également applicable pour visualiser tous les processus dynamiques se produisant dans les gonades au cours de ce point temporel de développement, y compris les réarrangements cellulaires²², l’adhésion cellulaire ^2,12,23 et la migration cellulaire²³. Ce protocole de dissection améliorera ainsi notre compréhension de nombreux processus biologiques cellulaires fondamentaux.

Protocol

1. Préparation du jour avant la dissection Affûter électrolytiquement une aiguille en tungstène24 de sorte que le diamètre résultant soit d’environ 0,03 mm. Réglez la tension fournie à environ 14 V et utilisez 3,3 M NaOH. L’affûtage ne devrait pas prendre plus de 1 ou 2 min.ATTENTION: Le NaOH est très corrosif et causera des brûlures au contact de la peau. Portez des gants et des lunettes lors de la manipulation et travaillez à l’intérieur d’une hotte aspirante.<…

Representative Results

Nous illustrons la préparation de la boîte d’imagerie à la figure 1, comme décrit dans « Préparation du jour de la dissection ». Ces méthodes devraient finalement aboutir à des embryons bien hydratés collés à une bande de couverture, qui est temporairement fixée au fond du plat et immergée dans la solution de Ringer (Figure 1F). Un couteau à pointe de diamant permet de trancher proprement un couvercle de 22 x 22 mm glissé en trois à quatre ban…

Discussion

Au cours de la gonadogenèse, la gonade embryonnaire, et en particulier la niche de cellules souches dans la gonade^{mâle 15}, subit des changements morphologiques rapides. Les mécanismes de développement qui sous-tendent ces changements dynamiques sont mieux compris par des techniques d’imagerie en direct. Cependant, au stade embryonnaire 17, l’imagerie in vivo de la gonade est rendue impossible par l’apparition de contractions musculaires à grande échelle^17</su…

Materials

Alfa Aesar Tungsten wire	Fisher Scientific	AA10408G6	0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)
D. melanogaster: His2Av::mRFP1	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	FBtp0056035	Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007
D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato	Gift from Ruth Lehmann Lab		Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'
D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin		FBtp0083398	Sano et al., PLoS One, 2012
Diamond-tipped knife
Double-sided tape	Scotch	665
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10082
Imaging dish	MatTek	P35GC-1.5-14-C
Imaging software	Molecular Devices		MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0
Insulin, bovine	Sigma	l0516	Store aliquots at 4 °C
Needle holder	Fisher Scientific	08-955
Nytex basket
Penicillin/streptomycin	Corning	30-002-Cl
Ringer's solution			2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved
Schneider's Insect Media	GIBCO	21720-024