Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61884
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6, 2, 7, 8
1Research Division, Instituto Nacional de Perinatologia, 2Department of Immunobiochemistry, Instituto Nacional de Perinatologia, 3Department of Obstetrics, Instituto Nacional de Perinatologia, 4Department of Academic Programs and Continuing Education, Instituto Nacional de Perinatologia, 5Department of Infectology and Immunology, Instituto Nacional de Perinatologia, 6Clinical Research Branch, Instituto Nacional de Perinatologia, 7Department of Nutrition and Bioprogramming, Instituto Nacional de Perinatologia, 8Department of Human Genetics and Genomics, Instituto Nacional de Perinatologia, Mexico City, Mexico

Summary

Bu protokol, adipositlerden yüksek kaliteli RNA elde etme metodolojisi ve akış sitometrisi ile analiz için çoklu membrana bağlı belirteçlerin boyanması yoluyla SVF-makrofajların fenotipleştirilmesi dahil olmak üzere, canlı adipositlerin ve stromal vasküler fraksiyon-SVF hücrelerinin insan viseral yağından tek bir işlemde izolasyonu için etkili bir kollajenaz sindirim yöntemi sağlar.

Abstract

Viseral yağ dokusu (VAT), metabolik, hormonal ve immün süreçleri kontrol eden farklı biyoaktif molekülleri serbest bırakan, esas olarak olgun adipositler ve stromal vasküler fraksiyon (SVF) hücrelerinden oluşan aktif bir metabolik organdır; Şu anda, bu süreçlerin yağ dokusu içinde nasıl düzenlendiği belirsizdir. Bu nedenle, her hücre popülasyonunun yağ dokusunun patofizyolojisine katkısını değerlendiren yöntemlerin geliştirilmesi çok önemlidir. Bu protokol, izolasyon adımlarını açıklar ve bir kollajenaz enzimatik sindirim tekniği kullanılarak insan KDV biyopsilerinden canlı olgun adipositlerin ve SVF'nin tek bir işlemde verimli bir şekilde izole edilmesi için gerekli sorun giderme yönergelerini sağlar. Ayrıca, protokol ayrıca makrofaj alt kümelerini tanımlamak ve gen ekspresyonu çalışmaları için olgun adiposit RNA izolasyonu gerçekleştirmek için optimize edilmiştir, bu da bu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimi inceleyen çalışmaların yapılmasına izin verir. Kısaca, KDV biyopsileri yıkanır, mekanik olarak kıyılır ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için sindirilir. Santrifüjlemeden sonra, olgun adipositler, SVF peletinden yüzdürme yoluyla izole edilir. RNA ekstraksiyon protokolü, aşağı akış ekspresyon deneyleri için adipositlerden yüksek miktarda toplam RNA (miRNA'lar dahil) verimi sağlar. Aynı zamanda, SVF hücreleri, akış sitometrisi analizi yoluyla makrofaj alt kümelerini (pro- ve anti-inflamatuar fenotip) karakterize etmek için kullanılır.

Introduction

Beyaz yağ dokusu sadece yağ hücrelerinden veya adipositlerden değil, aynı zamanda makrofajlardan, düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) olarak diğer bağışıklık hücrelerinden ve eozinofillerden, preadipositlerden ve fibroblastlardan oluşan heterojen bir hücre popülasyonu içeren stromal vasküler fraksiyon (SVF) olarak bilinen yağsız bir hücre fraksiyonundan oluşurve vasküler ve bağ dokusu ile çevrilidir 1,2. Yağ dokusu (AT) artık otokrin, parakrin ve endokrin etkileri ile farklı hücreler tarafından üretilen ve dokuya salınan adipokinler, sitokinler ve mikroRNA'lar aracılığıyla metabolizma ve iltihaplanma ile ilgili fizyolojik süreçleri düzenleyen bir organ olarak kabul edilmektedir 3,4. İnsanlarda beyaz yağ dokusu, deri altı yağ dokusu (SAT) ve viseral yağ dokusunu (VAT) içerir ve aralarında önemli anatomik, moleküler, hücresel ve fizyolojik farklılıklar vardır 2,5. SAT, insan AT'sinin %80'ini temsil ederken, VAT karın boşluğunda, özellikle mezenter ve omentumda bulunur ve metabolik olarak daha aktiftir6. Ayrıca VAT, vücut ağırlığı, insülin duyarlılığı, lipid metabolizması ve inflamasyon üzerinde önemli etkisi olan aracıları salgılayan bir endokrin organdır. Sonuç olarak, KDV birikimi abdominal obeziteye ve tip-2 diyabet, metabolik sendrom, hipertansiyon ve kardiyovasküler hastalık riski gibi obezite ile ilişkili hastalıklara yol açar ve obezite ile ilişkili mortalitenin daha iyi bir yordayıcısını temsil eder 6,7,8,9.

Homeostatik koşullarda, adipositler, makrofajlar ve diğer bağışıklık hücreleri, anti-enflamatuar mediatörlerin salgılanması yoluyla KDV metabolizmasını sürdürmek için işbirliği yapar10. Bununla birlikte, aşırı KDV genişlemesi, aktive edilmiş T hücrelerinin, NK hücrelerinin ve makrofajların alımını teşvik eder. Nitekim yağsız KDV'de makrofajların oranı %5 iken, obezitede bu oran %50'ye kadar yükselmekte, makrofaj polarizasyonu ile anti-inflamatuardan pro-inflamatuar fenotipe doğru kronik inflamatuar bir ortam oluşturmaktadır10,11.

Obezite pandemisinin bir sonucu olarak, diğerlerinin yanı sıra adiposit biyolojisi, epigenetik, inflamasyon, endokrin özellikler ve hücre dışı veziküller olarak ortaya çıkan alanlar dahil olmak üzere farklı KDV araştırma konularını ele alan şaşırtıcı sayıda rapor ortaya çıkmıştır 8,10,12,13. Bununla birlikte, KDV ortamı, adipositler ile yerleşik veya gelen makrofajlar arasındaki karışma ile tanımlansa da, çoğu çalışma yalnızca bir hücre popülasyonuna odaklanmıştır ve bu hücrelerin KDV'deki etkileşimi ve patofizyolojik sonuçları hakkında çok az bilgi vardır11,14. Ayrıca, AT'de adiposit-makrofaj etkileşimini ele alan değerli çalışmalar, in vivo hazırlama koşullarından yoksun hücre hatları kullanılarak gerçekleştirilmiştir 11,14,15. Bu hücrelerin KDV'deki etkileşimini veya özel katkısını incelemek için uygun bir strateji, KDV metabolizmasını düzenleyen in vivo özellikleri mümkün olduğunca benzer şekilde yansıtan in vitro tahliller gerçekleştirmek için her iki hücre tipinin de aynı yağ biyopsisinden izole edilmesini gerektirir.

AT'yi kırmak için mekanik kuvvetlere dayanan enzimatik olmayan ayrışma yöntemleri minimum manipülasyon sağlasa da, enzimatik yöntemlere kıyasla hücre geri kazanımında daha düşük etkinliğe ve düşük hücre canlılığına sahip olduklarından ve daha büyük bir doku hacmine ihtiyaç duyulduğundan, amaç SVF hücrelerini incelemek ise bu yöntemler kullanılamaz16,17. Kollajenaz kullanılarak enzimatik sindirim, WAT18 gibi fibröz dokuların kollajen ve hücre dışı matriks proteinlerinin yeterli sindirimine izin veren nazik bir yöntemdir ve tripsin etkisiz veya zararlı olduğundasıklıkla kullanılır 19. Protokol, bir kollajenaz enzimatik sindirim tekniği kullanarak, insan KDV biyopsilerinden canlı olgun adipositlerin ve SVF hücrelerinin tek bir işlemde verimli bir şekilde izole edilmesi için temel sorun giderme yönergeleri sağlar ve aşağı akış ekspresyon uygulamaları için mikroRNA'lar da dahil olmak üzere olgun adipositlerden toplam RNA'nın yüksek verimini (miktar, saflık ve bütünlük) sağlamak için bilgi verir. Eşzamanlı olarak, protokol, akış sitometrisi20 ile daha fazla analiz için çoklu zara bağlı belirteçlerin boyanması yoluyla SVF hücrelerinden makrofaj alt kümelerini tanımlamak için optimize edilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokol, Instituto Nacional de Perinatologia'nın IRB'si (212250-3210-21002-06-15) tarafından onaylanmıştır. Katılım gönüllülük esasına dayalıydı ve kayıtlı tüm kadınlar bilgilendirilmiş onam formunu imzaladı.

1. Viseral yağ dokusu toplanması

  1. Doğum sancısı olmadan tekil gebelikleri olan sağlıklı yetişkin kadınlardan sezaryen sırasında kısmi omentektomi yoluyla KDV biyopsileri alın.
  2. Rahim kapanması ve hemostaz yapıldıktan sonra, daha büyük omentum tanımlamaya devam edin ve ıslak bir kompres üzerinde uzatın. Maruz kalan AT KDV'dir.
  3. En büyük kan damarını bulun ve daha büyük omentum tabanına 7 x 5 cm'lik hayali bir çizgi izleyin.
  4. Bir avasküler bölge belirleyin ve KDV'nin dış tarafını delmek için Kelly forseps kullanın.
  5. KDV'nin delindiği bölgede proksimal ve distal tarafı sıkıştırmak için Ochsner forseps kullanın ve dokuyu kesmek için Metzenbaum makası kullanın.
  6. Daha büyük omentumu 1 numaralı siyah ipek ile bağlayın.
  7. Ochsner forsepslerini çıkarın ve hemostazı değerlendirin.
  8. KDV biyopsisini steril bir kaba koyun ve hemen laboratuvara taşıyın.

2. Viseral yağ dokusunun enzimatik sindirimi ve olgun adipositlerin ve stromal vasküler fraksiyon hücrelerinin izolasyonu

  1. KDV biyopsisini tartın ve 1x PBS pH 7.4 ile durulayın.
  2. 4 g KDV'yi kesin ve dokuyu bir diseksiyon tepsisinde küçük parçalara ayırmak için makas kullanın.
  3. Kıyılmış KDV'yi steril bir 50 mL santrifüj tüpüne aktarın, 20 mL PBS ekleyin ve kırmızı kan hücrelerinin fazlalığını gidermek için hafifçe çalkalayın.
  4. PBS'yi atın ve prosedürü iki kez tekrarlayın.
  5. KDV'yi yeni bir steril 50 mL santrifüj tüpüne aktarın ve 25 mL sindirim solüsyonu ekleyin (% 0.25 kollajenaz tip II, 5 mM glikoz, PBS'de% 1.5 albümin).
  6. 37 °C'de 60 dakika boyunca 125 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin.
  7. Sindirilmiş dokuyu üç kat gazlı bezden geçirerek yeni bir steril 50 mL santrifüj tüpüne süzün.
  8. 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
  9. SFV hücreleri pelette kalırken, olgun adipositlere karşılık gelen bir üst faz olan iki faz elde edilir. Olgun adipositleri bir transfer pipeti kullanarak yeni bir steril 50 mL santrifüj tüpüne nazikçe aktarın.
  10. 20 mL soğuk PBS ekleyin, hafifçe çalkalayın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
  11. PBS'yi atın ve prosedürü iki kez tekrarlayın.
  12. Olgun adipositleri 1.5 mL DNase-RNaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpüne nazikçe aktarmak için bir transfer pipeti kullanın.
  13. 4 °C'de 1 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin ve bir P200 mikropipet kullanarak fazla PBS'yi çıkarın. Gerekirse bu adımı tekrarlayın.
  14. 300 μL olgun adiposit süspansiyonunu 1.5 mL DNase-RNaz içermeyen mikrosantrifüj tüplerine yavaşça aktarın. Olgun adipositleri RNA ekstraksiyonuna kadar -80 °C'de saklayın.
    NOT: Adipositler bir pelet oluşturmaz.
  15. Adipositler ayrıldıktan sonra (adım 2.9), SVF peletini tüpün dibinde tutarak sindirim solüsyonunun çoğunu bir transfer pipeti ile aspire edin.
  16. SVF hücreli peleti, bir transfer pipeti kullanarak 50 mL'lik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
  17. Hücre peletini nazikçe yıkayın, yukarı ve aşağı pipetleyerek 20 mL soğuk 1x PBS'de yeniden süspanse edin.
  18. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı dekantasyon yoluyla hızla atın.
  19. 2.17 ve 2.18 adımlarını tekrarlayarak ikinci bir yıkama gerçekleştirin.
  20. SVF peletine oda sıcaklığına (RT) dengelenmiş, 5 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin ve tekrarlanan pipetleme ile askıya alın. Girdap yapmayın.
  21. RT'de 5 dakika inkübe edin ve 800 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Bir transfer pipeti kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın ve uygun şekilde atın.
  22. Lizis tamponunu nötralize etmek için 10 mL soğuk 1x PBS ekleyin ve hücre peleti ayrılana kadar hafifçe karıştırın.
  23. SVF peleti elde etmek ve PBS'yi atmak için 800 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. Tüpün dibinde beyaz bir pelet görünmelidir.
  24. Tekrarlanan pipetleme ile RT'de 5 mL 1x PBS'deki hücreleri yeniden süspanse edin ve üç kat gazlı bezden yeni bir 50 mL konik tüpe süzülün. Daha sonra, bu hücreler akış sitometrisi ile makrofaj alt popülasyon karakterizasyonu için kullanılacaktır.

3. Olgun adipositlerden RNA ekstraksiyonu

  1. RNA bozulmasını önlemek için RNase dekontaminasyon spreyi kullanarak temiz bir alan hazırlayın. RNA prosedürleri için ayrılmış bir pipet seti kullanın. Kullanılan tüm tüpler ve uçlar RNaz içermemelidir.
  2. Olgun adiposit süspansiyonunu (bölüm 2.14) -80 °C'ye kadar saklanmışsa 4 °C'de çözün.
    NOT: Birden fazla donma-çözülme döngüsünden kaçının.
  3. 1.000 μL asit-guanidinyum-fenol bazlı reaktif ekleyerek hücreleri parçalayın ve homojenize etmek için bir P1000 mikropipet ile iyice karıştırın.
  4. Nükleoprotein komplekslerinin ayrışmasını artırmak için RT'de 5 dakika inkübe edin.
  5. RT'de 12.000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj hücresi lizatı. Üç faz elde edilecektir: adiposit lipidlerine karşılık gelen bir üst faz (sarı), nükleik asitlere karşılık gelen bir orta faz (pembe) ve bir pelet (hücresel kalıntı).
  6. Bir P200 mikropipet kullanarak lipit tabakasını dikkatlice çıkarın.
  7. Orta fazı 2 mL'lik yeni bir tüpe aktarın, lipid kalıntısı ve pelet bozulmasından kaçının (yaklaşık 700 μL).

4. MikroRNA'lar dahil toplam RNA'nın saflaştırılması

NOT: Yüksek kaliteli toplam RNA elde etmek için kolon tabanlı bir toplam RNA saflaştırma yöntemi kullanılır.

  1. Bölüm 3.7'den numuneye eşit hacimde etanol (%95-100), yaklaşık 700 μL ekleyin ve tüpü 10 saniye ters çevirerek elle karıştırın.
  2. Karışımın 700 μL'sini bir toplama tüpüne yerleştirilmiş bir kolona aktarın, santrifüjleyin ve akışı atın.
  3. Sütunu yeniden yükleyin ve 4.2 adımını tekrarlayın.
  4. Kolonu yeni bir toplama tüpüne aktarın.
  5. Kolona ve santrifüje 400 μL ön yıkama tamponu ekleyin. Akışı atın ve bu adımı tekrarlayın.
  6. Kolona 700 μL yıkama tamponu ekleyin ve 2 dakika santrifüjleyin.
  7. Kolonu dikkatlice nükleaz içermeyen bir tüpe aktarın.
  8. Doğrudan kolon matrisine 50 μL nükleaz içermeyen su ekleyin ve RNA'yı santrifüjleme yoluyla elüte edin. 200 μL'lik mikrofüj tüpleri kullanarak 10 μL'lik alikotlar hazırlayın.
  9. Hemen buza alikotlar koyun ve RNA konsantrasyonunu ve saflığını belirlemek için bunlardan birini kullanın.
  10. RNA bütünlüğünü ve mikroRNA konsantrasyonunu ölçmek için 100 ng/μL'ye ayarlanmış 5 μL toplam RNA'dan oluşan bir alikot hazırlayın.
  11. Kullanana kadar -80 °C'de saklayın.

5. Olgun adiposit RNA konsantrasyonunun, saflığının ve bütünlüğünün belirlenmesi; mikroRNA miktar tayini testi

NOT: RNA konsantrasyonu ve saflık tayinleri bir UV-Vis spektrofotometresi kullanılarak gerçekleştirilir; RNA bütünlüğü ve miRNA nicelemesi, bir RNA kalite kontrol analizörü kullanılarak gerçekleştirilir.

  1. Numune okuyucuyu moleküler dereceli suyla yıkayın ve silin.
  2. 2 μL elüsyon suyu (boş) yükleyin, ayarı RNA olarak değiştirin ve Boş düğmesine tıklayın.
  3. 2 μL numune yükleyin ve Ölç düğmesine tıklayın.
  4. Okuma tamamlandıktan sonra, A260/A280 ve A260/A230 oranlarının yanı sıra RNA miktarını (ng/μL) kaydedin (Şekil 1A).
    NOT: OD260/OD280 ve OD260/OD230 oranı 2.0 civarında olan RNA saf kabul edilir.
  5. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir RNA bütünlük kiti kullanarak RNA bütünlük numarasını (RIN) ölçün (Şekil 1B).
    NOT: BIR RIN =10, bozulmamış RNA'ya karşılık gelirken, bir RIN ≤ 3.0, güçlü bir şekilde bozulmuş bir RNA'yı gösterir. İfade mikrodizileri veya RT-qPCR için RIN ≥ 6.0 ile RNA kullanın.
  6. Üreticinin talimatlarını izleyerek mikroRNA'ların konsantrasyonunu ve yüzdesini belirlemek için küçük bir RNA kiti kullanın (Şekil 1C).
    NOT: Küçük ve mikro RNA'ların fazla tahmin edilmesini önlemek için, RIN ≥ 6.0 ile RNA örneklerini kullanın.

6. Stromal vasküler fraksiyon hücrelerinin sayısı ve canlılığı

  1. 10 μL SVF hücre süspansiyonunu (bölüm 2.24) 90 μL %0.4 Tripan Mavisi Çözeltisine (son seyreltme 1:10) seyreltin ve standart bir hemositometreye 10 μL uygulayın.
  2. Canlı hücreleri, ölü hücreler hariç, sayım odasının köşesindeki dört karede dikkatlice sayın.
  3. Orijinal süspansiyonda bulunan hücre konsantrasyonunu belirleyin: Hücre konsantrasyonu = Toplam hücre sayısı/4 x seyreltme faktörü (10) x 10.000 = Hücreler/mL
  4. Elde edilen hücresel verimi (doku gramı başına hücre) hesaplamak için, hücresel konsantrasyonu orijinal toplam numune hacmi (mL cinsinden) ile çarpın ve sindirilen dokunun ağırlığına (gram cinsinden) bölün.
  5. Hücre canlılığını canlı hücrelerin yüzdesi olarak şu şekilde değerlendirin: % Canlılık = (Canlı hücre sayısı / Toplam hücre sayısı) x 100.

7. Stromal vasküler fraksiyondan makrofaj alt gruplarının karakterizasyonu

  1. 4 °C'de 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme yoluyla akış sitometrisi ve pelet hücreleri için toplam 1 x 106 SVF hücresi/mL'yi 5 mL yuvarlak tabanlı polipropilen test tüpüne aktarın.
  2. Peleti gevşetmek için dikkatlice vorteksleyin ve hücreleri RT'de 100 μL 1x PBS'de yeniden süspanse edin.
  3. Bir hücre yüzeyi antijeni için spesifik olan her bir florokrom konjuge monoklonal antikorun önceden titre edilmiş optimal konsantrasyonunu ekleyin; hafifçe karıştırın ve RT'de karanlıkta 15 dakika inkübe edin.
  4. Fazla soğuk 1x PBS (≈ 1 mL) ekleyin ve SVF'yi 400 x g'de 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  5. Süpernatantları dekantasyon ile hızla atın. Peletleri rahatsız etmemeye dikkat edin.
  6. 500 μL 1x parçalama çözeltisi ekleyin ve tüpleri doğrudan ışıktan koruyarak RT'de 15 dakika inkübe edin.
  7. 400 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjledikten sonra çözeltiyi çıkarın ve veri alınana kadar karanlıkta 2-8 °C'de saklayın.
  8. Elde etmeden önce agregasyonu azaltmak için hücreleri düşük hızda iyice vorteksleyin.
  9. SVF peletini RT'de 5 mL kılıf sıvısı içinde yeniden süspanse edin ve ardından hücre ayırıcı hatlarının tıkanmasını azaltmak için akış sitometrisi ile analizden önce üç kat gazlı bezden yeni bir 5 mL yuvarlak tabanlı polipropilen test tüpüne süzün.
  10. Analizden önce her tüpü kısaca vorteksleyin.
  11. İlgilenilen örneklerden veri elde edin. Akış analizi için en az 10.000 olay sayın.
    NOT: Bir hücre sıralama akış sitometresi kullanıyorsanız, sonraki çalışmalarda uygulama için makrofajları ayırın.

8. Geçit stratejisi

  1. Singlet popülasyonunu belirlemek için İleri Dağılım (FSC) alanına göre yüksekliği veya genişliği çizin (Şekil 2A).
  2. Hücresel kalıntıları atarak FSC'ye karşı Yan Dağılım (SSC) alanını çizen hücreleri seçin (Şekil 2B).
  3. Seçilen hücrelerden, CD45'i hematopoietik hücreler olarak ifade eden popülasyonları tanımlayın (Şekil 2C) ve CD45 / CD14 çift pozitif hücreleri makrofajlar olarak tanımlayın (Şekil 2D).
  4. CD45+/CD14+ makrofajlarından negatif ve pozitif HLA-DR hücrelerini tespit edin (Şekil 2E).
    NOT: Antikor paneli için kompanzasyon kontrollerini dahil edin ve panel için yeterli olan çok renkli bir akış sitometresinde spektral örtüşmeyi ayarlayın. Üç lazerle (405 nm mor lazer, 488 nm mavi lazer ve 640 nm kırmızı lazer) donatılmış bir sitometre ve belirtilen florokromlar için dedektörler kullanarak akış sitometrisi analizi yapıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokol, parsiyel omentektomi sonrası sağlıklı gebe kadınlardan elde edilen KDV biyopsilerinden canlı olgun adipositleri ve SVF hücrelerini tek bir işlemde izole etmek için kollajenaz sindirimi ve ardından diferansiyel santrifüjleme kullanan enzimatik bir yöntemi açıklar. Bu durumda, RNA ekstraksiyonu için adipositleri ve makrofaj fenotiplemesi için SVF'yi kullanıyoruz.

RNA ekstraksiyon protokolü, yeterli saflıkta, yüksek bütünlükte RNA ve olgun adipositlerden mikroRNA'lar elde edilmesini sağladı (Şekil 1). Bir RNA kalite kontrol analizörü tarafından değerlendirilen RNA bütünlüğü, protokol ile izole edilen adiposit örnekleri için mükemmel değerlerle sonuçlandı (RIN = 9.7).

VAT-SVF'de bulunan çekirdekli hücrelerin toplamı yaklaşık 2.8 x 106 hücre/gram KDV (2.8 x 106 ± 1.7 x 106) idi ve tripan mavisi dışlama testi kullanılarak %64 canlılık (63.9 ± 2.0) idi. SVF hücreleri, floresanla aktive olan hücre sıralama analizi ile AT makrofajlarını tanımlamak ve karakterize etmek için floroforla konjuge primer antikorlarla etiketlendi. Akış sitometrisi analizi, hücresel belirteçlere dayalı olarak farklı hücre popülasyonlarını gösteren grafikler oluşturur (Şekil 2). Başlangıçta, İleri Saçılma alanı (FSC-A) ve İleri Saçılma yüksekliği (FSC-H) çizilerek, hücre agregaları analizden kolayca çıkarıldı (Şekil 2A). Daha sonra, İleri Saçılma alanı (FSC-A) ve Yan Saçılma alanı (SSC-A) kullanılarak hücrelerin doğru boyut ve karmaşıklığa dayalı olarak geçitlenmesiyle hücresel kalıntılar hariç tutuldu (Şekil 2B). Daha sonra, makrofajları analiz etmek için diğer bağışıklık hücrelerini dışlamak gerekli değildi. İlk olarak, CD45 ve CD14 belirteçleri kullanılarak monosit/makrofaj soy hücreleri seçildi (Şekil 2C,D). Daha sonra, CD45/CD14 çift pozitif hücreleri, makrofaj belirteci HLA-DR ekspresyonuna göre ayrıldı ve burada iki alt grup makrofaj tanımlandı: HLA-DR- ve HLA-DR+ (Şekil 2E).

Figure 1
Şekil 1: Olgun adipositlerden RNA kalite kontrolü. (A) RNA konsantrasyonu, 260/280 ve 260/230 oranı; (B) Bütünlük analizi. Elektroferogram, jel görüntüsü ve RNA bütünlük sayısı, bir RNA kalite kontrol analizörü ve bir RNA analizör kiti kullanılarak elde edildi; (C) mikroRNA miktar tayini. Elektroferogram, jel görüntüsü ve mikroRNA yüzdesi, bir RNA kalite kontrol analizörü ve küçük bir RNA kiti kullanılarak elde edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Viseral yağ dokusundan makrofajların tanımlanması. Kollajenaz sindirimi kullanılarak sezaryen sırasında toplanan viseral yağ dokusundan izole edilen stromal vasküler fraksiyon makrofajlarının temsili akış sitometrisi grafikleri. (A) Çiftleri çıkarmak için ilk İleri Saçılma alanı (FSC-A) ve FSC-yüksekliği (FSC-H) kapısı kullanılarak tekillerin tanımlanması. (B) Boyut ve yoğunluğa bağlı olarak döküntüleri ortadan kaldırmak için ikinci bir İleri Saçılma alanı (FSC-A) ve Yan Saçılma alanı (SSC-A) kapısı kullanıldı. (C,D) SSC-A vs CD45 kapısı hematopoietik orijinli hücreleri tanımladı ve SSC-A vs CD14 kapısı makrofajları tanımladı. (E) Toplam CD45+/CD14+ makrofajları HLA-DR markörüne göre kapılandı ve iki makrofaj alt grubu tanımlandı: HLA-DR- ve HLA-DR+. Grafikler, bireysel konulardan temsili verileri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

KDV, metabolik düzenleme ve inflamasyonda çok önemli bir rol oynar. Obezite ile ilişkili kronik inflamasyonda adipositlerin ve immün hücrelerin rolüne olan ilginin artması, AT'de bulunan SVF ve yağ hücrelerini ayırmak için farklı tekniklerin geliştirilmesine yol açmıştır. Bununla birlikte, çoğu teknik, adipositler ve SVF hücreleri arasındaki etkileşimlerle ilgili çalışmalar için çok önemli olabilecek tek bir prosedürde aynı KDV biyopsisinden aşağı akış uygulamaları için uygun olan bu iki farklı hücre setinin elde edilmesine izin vermez. Bu nedenle, bir KDV biyopsisinde bulunan canlı olgun adipositleri ve SVF hücrelerini izole etmek için ayrıntılı bir açıklama sağlayan bu protokolü uyguladık. Doku sindirimi ve kollajenaz konsantrasyonunun yanı sıra hücre ayrımı için santrifüjleme süresi ve hızı açısından önceki raporlardan farklıdır ve yeterli adiposit RNA verimini ve ayrıntılı makrofaj alt küme karakterizasyonunu sağlar.

İzole hücrelerin biyolojik özellikleri ve fonksiyonel özellikleri üzerinde farklı etkileri olan AT türevli hücreler için çok sayıda enzimatik ve enzimatik olmayan izolasyon tekniği önerilmiştir 17,21,22,23,24, bu nedenle izlenen hedefe göre en uygun stratejiyi seçmek gerekir. Sıklıkla, doku ayrışma enzimleri25,26,27 kullanılarak yağ dokusundan olgun adipositler ve SVF izolasyonu sağlanır. AT'yi ayrıştırmak için farklı enzimler kullanılabilse de, kollajenaz ile enzimatik sindirim bu dokuyu sindirmek için altın standart olarak kalır27,28. VAT yumuşak bir matristen oluştuğu için Kollajenaz Tip II ile kolayca sindirilebilir. Bu prosedür, uygun olmayan doku ayrışmasını önler, çünkü bu enzim hücre dışı matriks doğal kollajenini bozar, fibröz stromadan çok daha fazla hücreyi serbest bırakır ve hücre canlılığı, hücre verimi ve küme farklılaşma ekspresyonu üzerinde ihmal edilebilir bir etki yaratır 19,27,28,29.

Enzimatik sindirim açısından, olgun adiposit ve KDV'den SVF hücre izolasyonu için uygun bir protokol tasarlamak için enzim konsantrasyonunu, sindirim süresini ve santrifüj parametrelerini dikkate almak da önemlidir, çünkü bu faktörler hücre fenotipini, geri kazanımını ve son hücre süspansiyonundaki canlılığı etkileyebilir27,29. Kollajenazın proteolitik bir enzim olarak kullanımı, 2 saatten daha kısa bir inkübasyon süresi ile düşük konsantrasyonda [aralık% 0.075 ve% 0.3 (a / h)] idealdir, bu nedenle proliferasyon hızı, farklılaşma kapasitesi ve spesifik hücresel soyların sıklığı gibi fenotipik ve fonksiyonel SVF özellikleri değişmeden kalır30,31. Maksimum 60 dakikalık bir sindirim süresi ve% 0.25 kollajenaz kullanıyoruz, hücresel canlılık ve SVF hücrelerinin yüzey belirteçleri ekspresyonu üzerinde ihmal edilebilir bir etki elde etmek için kollajenaz maruziyetinin konsantrasyonunu ve uzunluğunu azaltarak, akış sitometrisi analizinde çarpık sonuçlardan kaçınıyoruz. Ayrıca, yağ hücresi ayrımı sırasında hücre geri kazanımını iyileştirmek için nazik santrifüj adımları ve 200 g/5 dk'lık daha kısa santrifüj süreleri de dahil ediyoruz, bu da protokol için bir avantaj sağlıyor, çünkü uzun ve yoğun santrifüj süreleri [400 g/1 dk'nın üzerinde] adipositlerin ölümünü artırarak hücresel verimi sınırlıyor 32,33,34. Kollajenaz bazlı sindirim protokolü ile elde edilen SVF hücresel geri kazanımı, literatürde bildirilen 2-6 x 106 hücre/g AT'nin tipik verimlerine benzerken, 63.9 ± 2.0'lık SVF canlılığı, bu tip hücreler için önerilen minimum eşik olan %70-80'den orta derecede düşüktür 35,36,37,38. Bunun nedeni, makrofaj popülasyonunu yüzey belirteçleri aracılığıyla karakterize ettiğimiz için, SVF hücrelerini standart protokoller olarak yeniden süspanse etmek için kültür ortamını kullanmamamızdır ve bu hücrelerin çevresel koşullara yanıt olarak dikkate değer bir plastisite sergilediği, hatta fenotiplerinideğiştirdiği bildirilmiştir 39,40,41.

Ek olarak, KDV bağışçısı olarak bu protokole dahil edilen gebelerin sağlıklı olduklarını, metabolik komorbiditeleri klinik kanıtı olmayan, gebelikte normal kilo alımı, ortalama yaş 20-25 yıl ve normal gebelik öncesi Vücut Kitle İndeksi (VKİ 18.5–24.9 kg/m2; n = 7), çünkü bazı yazarlar farklı donörlerin, yaşların, BMI'nin ve cinsiyet veya etnik kökenin hücre sayısı ve SFV yüzey belirteçlerinin ekspresyonu42,43,44 üzerinde bir etkisi olduğunu açıklamışlardır.

Öte yandan, gen ekspresyon profili analizi makul miktarlarda bozulmamış RNA gerektirir, ancak olgun adipositlerden izolasyonu özellikle zordur çünkü bu hücreler daha yüksek bir lipit içeriğine sahiptir ve bazı durumlarda hücre sayısı düşüktür 45,46,47,48. Standart bir guanidin izotiyosiyanat/fenol yöntemi 49,50'ye dayalı olarak olgun adipositlerden bir RNA izolasyon prosedürünü optimize ettik ve lipitleri ve hücresel kalıntıları ortadan kaldırmayı sağlayan kolay adımlar uyguladık. Numune hazırlığından sonra, kolon bazlı RNA ekstraksiyonu, AT numuneleri için oldukça sıra dışı olan mikroRNA'lar da dahil olmak üzere yüksek kaliteli DNA içermeyen bir RNA elde etmemizi sağlar. Bu RNA'ların saflığının ve bütünlüğünün mikroakışkan tabanlı bir RNA kalite kontrol analizörü aracılığıyla doğrulanması, izole edilmiş RNA kalitesinin RT-qPCR testleri ve ekspresyon mikrodizileri gibi aşağı akış uygulamaları için uygun olmasını sağlar.

Daha önce bahsedilen avantajların yanı sıra, kollajenaz kullanılarak AT sindirimi, hücre yüzeyi reseptörlerinin bütünlüğünü koruyarak adipositlerin ve yerleşik bağışıklık hücrelerinin aynı anda serbest bırakılmasına izin verir; bu, SVF hücre izolasyonu sırasında güvenilir ve yorumlanabilir akış sitometrisi verileri elde etmek için önemli bir gerçektir27. Ek olarak, KDV gibi lipid yüklü dokulardan izole edilen hücreler, agregasyona daha yatkın olma eğilimindedir, bu da sıralanan hücre verimini azaltır ve otofloresansı arttırır51. Protokolde, bu hücre agregatlarının tasniften önce üç kat gazlı bezden süzülerek ortadan kaldırılması ve açıklanan geçit stratejisi ile dışlanması, arka plan floresansını en aza indirerek hücre tasnifi için numune kalitesini iyileştirir.

SVF'de bulunan hücreleri, bu hücreler için karakteristikolan tek bir CD markörü seti kullanarak tanımlamak için önceki çalışmalar yapılmıştır: 52,53,54,55,56,57,58,59. VAT SVF'deki makrofaj alt tiplerinin daha derinlemesine karakterizasyonu için, bu hücreleri spesifik hücre yüzeyi belirteçlerinin ifadesine göre kategorize ettik. VAT60'da monosit/makrofaj linaj hücrelerini tanımlamak için kullanılan CD45 ve CD14 marker ekspresyonuna göre, bu dokunun hematopoetik kökenli tipik bir CD45+CD14+ makrofaj popülasyonundan oluştuğunu bulduk. Aynı protokolü kullanarak, önceki bir çalışmada M1 (CD11c) ve M2 (CD163 ve CD206) makrofaj popülasyonlarını karakterize edebildik20.

AT içindeki makrofaj fenotiplemesi, yüzeyinde farklı aktivasyon belirteçlerinin varlığına göre proinflamatuar makrofajlardan (klasik olarak aktif-M1) anti-inflamatuar makrofajlara (alternatif olarak aktif-M2) kadar bir spektrum olarak kategorize edilmiştir61,62. HLA-DR makrofaj belirteci, makrofaj aktivasyon derecesi63,64'ü yansıtır ve M1 veya M2 fenotipini oluşturmak için protokole dahil edilmiştir: HLA-DR+ eksprese eden makrofaj popülasyonları inflamatuardır ve HLA-DR- inflamatuar olmayan makrofajları temsil eder. Bu nedenle, HLA-DR belirteç ekspresyonuna dayalı olarak, iki makrofaj alt grubu tanımlandı: CD45+CD14+HLA-DR- ve CD45+CD14+HLA-DR+, dolaşımdaki monositlerden köken alan ve daha çok yağ dokusu içinde monosit kaynaklı makrofajlar olarak bilinir 65,66.

Ek olarak, her makrofaj alt tipinde CD11c'yi (M1 markörü) ve CD163 ve CD206'yı (M2 markörü) ölçtük ve AT makrofajlarının membran yüzeylerinde değerlendirilen tüm aktivasyon belirteçlerini gösterdiğini belirledik, bu da hamile kadınlardan alınan KDV'de bulunan makrofajların M1 ve M2 makrofaj popülasyonlarının aşırı basitleştirilmiş sınıflandırmaları için açıklananlardan daha karmaşık özelliklere sahip olduğunu gösterdi. Bu nedenle, çok renkli antikor paneli ve sıkı hücre geçitleri ile temel akış sitometrisinin uygulanması, SVF'deki heterojen hücre havuzundan makrofajların tanımlanmasını ve karakterize edilmesini mümkün kılar. Protokol ile elde edilen rafine makrofaj fenotiplemesi, AT'deki makrofaj popülasyonlarının AT homeostazında bozukluğa yol açan dinamik değişikliklerini aydınlatmak için yapılan çalışmalarda yararlı olabilir.

Bu protokol KDV makrofajlarını karakterize etmek için tasarlanmış olsa da, antikor panelinde yapılan ayarlamalar, farklı soyların spesifik belirteçlerini tanımlamak için çok sayıda floresan antikor mevcut olduğundan, AT'de bulunan diğer bağışıklık hücrelerinin sınıflandırılmasını kolaylaştırmak için uygulamalarını genişletebilir. Ayrıca yöntem, hücre ayıklama ile saflaştırılan hücre popülasyonlarının, DNA/RNA/protein ekstraksiyonu veya ex vivo tedaviler gibi sıralama sonrası analizler için kullanılabilmesine ve hücrelerin sterilite teknikleriyle doğrudan uygun bir ortama elde edilmesine olanak tanır.

Özetle, burada detaylandırılan protokolün, yağ hücrelerinden RNA ve miRNA ekstraksiyonu ve AT'deki makrofaj popülasyonunun karakterizasyonu için oldukça verimli olmasının yanı sıra, zaman, kaynaklar, hücresel verim ve hücre canlılığı arasındaki en verimli dengeyi temsil ettiğini düşünüyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma Instituto Nacional de Perinatologia (hibe numaraları: 3300-11402-01-575-17 ve 212250-3210-21002-06-15) ve CONACyT, Fondo Sectorial de Investigacion en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (hibe numarası 2015-3-2-61661) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02-C RNase, DNase free and nonpyrogenic
1.5 mL microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 mL serological pipettes Corning CLS4101-50EA Individually plastic wrapped
10 µL universal pipet tip Axygen T-300-L-R RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 µL universal pipet tip Axygen T-300-R-S RNase, DNase free and nonpyrogenic
1000 µL universal pipet tip Axygen T-1000-B-R RNase, DNase free and nonpyrogenic
2.0 mL microcentrifuge tube Axygen MCT-200-C RNase, DNase free and nonpyrogenic
200 µL universal pipet tip Axygen T-200-Y-R RNase, DNase free and nonpyrogenic
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA -
2101 Bioanalyzer PC Agilent G2953CA 2100 Expert Software pre-installed in PC
5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube Corning 352003  Snap cap, sterile
50 mL centrifuge tubes Corning CLS430828-100EA Polipropilene, conical bottom and sterile
Acid-guanidinium-phenol based reagent Zymo Research R2050-1-200 TRI Reagent or similar
Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent 5067-1511 -
Agilent Small RNA Kit Agilent 5067-1548 -
APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody BioLegend 325620 0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14
Baker - - 250 ml, non sterile
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3912-100G Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96%
Chip priming station Agilent 5065-9951 -
Collagenase type II Gibco 17101-015 Powder
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270-100G Powder
Direct-zol RNA Miniprep Zymo Research R2051 Supplied with 50 mL TRI reagen
Dissecting forceps - - Steel, serrated jaws and round ends
Dissection tray - - Stainless steel
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023-500ML 200 proof, for molecular biology
FACS Flow Sheath Fluid BD Biosciences 342003 -
FACS Lysing Solution BD Biosciences 349202 -
FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter BD Biosciences 648282 -
FASCDiva Software BD Biosciences 642868 Software v6.0 pre-installed
Hemacytometer Sigma Z359629-1EA -
Manual cell counter - - -
Mayo dissecting scisors - - Stainless steel
Microcentrifuge - - Adjustable temperature
Nanodrop spectrophotometer Thermo Scientific ND2000LAPTOP -
Orbital shaker - - Adjustable temperature and speed
P10 variable volume micropipette  Thermo Scientific-Finnpipette 4642040 1 to 10 μL
P1000 variable volume micropipette  Thermo Scientific-Finnpipette 4642090 100 to 1000 μL
P2 variable volume micropipette  Thermo Scientific-Finnpipette 4642010 0.2 to 2 μL
P200 variable volume micropipette  Thermo Scientific-Finnpipette 4642080 20 to 200 μL
PCR tube storage rack Axygen R96PCRFSP -
PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody BioLegend 307608 0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243
PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody BioLegend 304016 0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P3813-10PAK Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Pipette controller - - -
Red Blood Cells Lysis Buffer Roche 11 814 389 001 For preferential lysis of red blood cells from human whole blood
Refrigerated centrifuge - - Whit adapter for 50 mL conical tubes
Sterile Specimen container - - -
Transfer pipette Thermo Scientific-Samco 204-1S Sterile
Trypan Blue Gibco 15250-061 0.4% Solution
Tube racks - - For different tube sizes
Vortex Mini Shaker Cientifica SENNA BV101 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
  2. Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).
  3. Barchetta, I., Cimini, F. A., Ciccarelli, G., Baroni, M. G., Cavallo, M. G. Sick fat: the good and the bad of old and new circulating markers of adipose tissue inflammation. Journal of Endocrinological Investigation. 42 (11), 1257-1272 (2019).
  4. Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
  5. Ronquillo, M. D., et al. Different gene expression profiles in subcutaneous and visceral adipose tissues from Mexican patients with obesity. Indian Journal of Medical Research. 149 (5), 616-626 (2019).
  6. Mittal, B. Subcutaneous adipose tissue and visceral adipose tissue. Indian Journal of Medical Research. 149 (5), 571-573 (2019).
  7. West-Eberhard, M. J. Nutrition, the visceral immune system, and the evolutionary origins of pathogenic obesity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (3), 723-731 (2019).
  8. Kaminski, D. A., Randall, T. D. Adaptive immunity and adipose tissue biology. Trends in Immunology. 31 (10), 384-390 (2010).
  9. Elffers, T. W., et al. Body fat distribution, in particular visceral fat, is associated with cardiometabolic risk factors in obese women. PLoS One. 12 (9), 0185403 (2017).
  10. Macdougall, C. E., et al. Visceral adipose tissue immune homeostasis is regulated by the crosstalk between adipocytes and dendritic cell subsets. Cell Metabolism. 27 (3), 588-601 (2018).
  11. Sarvari, A. K., et al. Interaction of differentiated human adipocytes with macrophages leads to trogocytosis and selective IL-6 secretion. Cell Death & Disease. 6 (1), 1613 (2015).
  12. Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. Extracellular vesicles from adipose tissue-A potential role in obesity and type 2 diabetes. Frontiers in Endocrinology. 8 (1), Lausanne. 202 (2017).
  13. Crujeiras, A. B., et al. Genome-wide DNA methylation pattern in visceral adipose tissue differentiates insulin-resistant from insulin-sensitive obese subjects. Translational Research. 178 (1), 13-24 (2016).
  14. Surmi, B. K., Hasty, A. H. Macrophage infiltration into adipose tissue: initiation, propagation and remodeling. Future Lipidology. 3 (5), 545-556 (2008).
  15. Suganami, T., Nishida, J., Ogawa, Y. A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 25 (10), 2062-2068 (2005).
  16. Bellei, B., Migliano, E., Tedesco, M., Caputo, S., Picardo, M. Maximizing non-enzymatic methods for harvesting adipose-derived stem from lipoaspirate: technical considerations and clinical implications for regenerative surgery. Scientific Reports. 7 (1), 10015 (2017).
  17. Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (1), 88 (2019).
  18. Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plastic and Reconstructive Surgery. 136 (2), 189-199 (2015).
  19. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2016).
  20. Bravo-Flores, E., et al. Macrophage populations in visceral adipose tissue from pregnant women: potential role of obesity in maternal inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 1074 (2018).
  21. Conde-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 4 (9), 1017 (2016).
  22. Oberbauer, E., et al. Enzymatic and non-enzymatic isolation systems for adipose tissue-derived cells: current state of the art. Cell Regeneration. 4 (7), London, England. 1-14 (2015).
  23. van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
  24. Winnier, G. E., et al. Isolation of adipose tissue derived regenerative cells from human subcutaneous tissue with or without the use of an enzymatic reagent. PLoS One. 14 (9), 0221457 (2019).
  25. Gentile, P., Piccinno, M. S., Calabrese, C. Characteristics and potentiality of human adipose-derived stem cells (hASCs) obtained from enzymatic digestion of fat graft. Cells. 8 (3), 282 (2019).
  26. Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386 (1-2), 50-59 (2012).
  27. Lockhart, R., Hakakian, C., Aronowitz, J. Tissue dissociation enzymes for adipose stromal vascular fraction cell isolation: a review. Journal of Stem Cell Research & Therapy. 5 (12), 1000321 (2015).
  28. Condé-Green, A., et al. Comparison between stromal vascular cells' isolation with enzymatic digestion and mechanical processing of aspirated adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 134 (4), 54 (2014).
  29. Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
  30. Aguena, M., et al. Optimization of parameters for a more efficient use of adipose-derived stem cells in regenerative medicine therapies. Stem cells international. 2012 (1), 303610 (2012).
  31. Yang, X. F., et al. High efficient isolation and systematic identification of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Science. 18 (1), 59 (2011).
  32. Conde-Green, A., et al. Effects of centrifugation on cell composition and viability of aspirated adipose tissue processed for transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 30 (2), 249-255 (2010).
  33. Hoareau, L., et al. Effect of centrifugation and washing on adipose graft viability: a new method to improve graft efficiency. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (5), 712-719 (2013).
  34. Xie, Y., et al. The effect of centrifugation on viability of fat grafts: an evaluation with the glucose transport test. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (3), 482-487 (2010).
  35. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  36. Kanneganti, T. D., Dixit, V. D. Immunological complications of obesity. Nature Immunology. 13 (8), 707-712 (2012).
  37. Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. Adipose tissue heterogeneity: implication of depot differences in adipose tissue for obesity complications. Molecular Aspects of Medicine. 34 (1), 1-11 (2013).
  38. Raajendiran, A., Tsiloulis, T., Watt, M. J. Adipose tissue development and the molecular regulation of lipid metabolism. Essays in Biochemistry. 60 (5), 437-450 (2016).
  39. Rostam, H. M., et al. The impact of surface chemistry modification on macrophage polarisation. Immunobiology. 221 (11), 1237-1246 (2016).
  40. Chamberlain, L. M., Holt-Casper, D., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Extended culture of macrophages from different sources and maturation results in a common M2 phenotype. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (9), 2864-2874 (2015).
  41. Williams, M. R., Cauvi, D. M., Rivera, I., Hawisher, D., De Maio, A. Changes in macrophage function modulated by the lipid environment. Innate Immunity. 22 (3), 141-151 (2016).
  42. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012 (1), 812693 (2012).
  43. Bajek, A., et al. Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells. Bioscience Reports. 35 (3), 00212 (2015).
  44. van Harmelen, V., et al. Effect of BMI and age on adipose tissue cellularity and differentiation capacity in women. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders. 27 (8), 889-895 (2003).
  45. Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA isolation from adipose tissue: an optimized procedure for high RNA yield and integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
  46. Mendez, V., et al. A rapid protocol for purification of total RNA for tissues collected from pigs at a slaughterhouse. Genetics and Molecular Research. 10 (4), 3251-3255 (2011).
  47. Pena, R. N., Canovas, A., Estany, J. Technical note: Efficient protocol for isolation of total ribonucleic acid from lyophilized fat and muscle pig samples. Journal of Animal Science. 88 (2), 442-445 (2010).
  48. Pratt, S. L., Burns, T. A., Owens, M. D., Duckett, S. K. Isolation of total RNA and detection procedures for miRNA present in bovine-cultured adipocytes and adipose tissues. Methods in Molecular Biology. 936 (1), 181-194 (2013).
  49. Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Research Notes. 6 (1), 472 (2013).
  50. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
  51. Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow cytometry analyses of adipose tissue macrophages. Methods in Enzymology. 537 (1), 297-314 (2014).
  52. Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
  53. Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 51 (2), 142-150 (2015).
  54. Nicoletti, G. F., De Francesco, F., D'Andrea, F., Ferraro, G. A. Methods and procedures in adipose stem cells: state of the art and perspective for translation medicine. Journal of Cellular Physiology. 230 (3), 489-495 (2015).
  55. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): an overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
  56. Raposio, E., Bertozzi, N. How to isolate a ready-to-use adipose-derived stem cells pellet for clinical application. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 21 (18), 4252-4260 (2017).
  57. Silva, K. R., et al. Characterization of stromal vascular fraction and adipose stem cells from subcutaneous, preperitoneal and visceral morbidly obese human adipose tissue depots. PLoS One. 12 (3), 0174115 (2017).
  58. Wankhade, U. D., Shen, M., Kolhe, R., Fulzele, S. Advances in adipose-derived stem cells isolation, characterization, and application in regenerative tissue engineering. Stem Cells International. 2016 (1), 3206807 (2016).
  59. Zavan, B., et al. Persistence of CD34 stem marker in human lipoma: searching for cancer stem cells. International Journal of Biological Sciences. 11 (10), 1127-1139 (2015).
  60. Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Frontiers in Immunology. 5 (1), 683 (2014).
  61. Liddiard, K., Taylor, P. R. Understanding local macrophage phenotypes in disease: shape-shifting macrophages. Nature Medicine. 21 (2), 119-120 (2015).
  62. Prieur, X., et al. Differential lipid partitioning between adipocytes and tissue macrophages modulates macrophage lipotoxicity and M2/M1 polarization in obese mice. Diabetes. 60 (3), 797-809 (2011).
  63. Wang, H., et al. CD68(+)HLA-DR(+) M1-like macrophages promote motility of HCC cells via NF-kappaB/FAK pathway. Cancer Letters. 345 (1), 91-99 (2014).
  64. Yamamoto, Y., et al. Decreased human leukocyte antigen-DR expression in the lipid raft by peritoneal macrophages from women with endometriosis. Fertility and Sterility. 89 (1), 52-59 (2008).
  65. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: phenotypical vs. functional differentiation. Frontiers in Immunology. 5 (1), 514 (2014).
  66. Perdiguero, E. G., Geissmann, F. The development and maintenance of resident macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 2-8 (2016).

Tags

Canlı Adipositlerin İzole Edilmesi Stromal Vasküler Fraksiyon RNA Analizi Makrofaj Fenotiplemesi Viseral Yağ Dokusu Metabolik Organ Matür Adipositler Biyoaktif Moleküller İmmün Süreçler Yağ Dokusu Patofizyolojisi İzolasyon Adımları Sorun Giderme Kılavuzları Kollajenaz Enzimatik Sindirim Tekniği Makrofaj Alt Kümeleri Gen Ekspresyon Çalışmaları Tek Hücreli Süspansiyon Matür Adiposit RNA İzolasyonu
İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Estrada-Gutierrez, G., Bravo-Flores, … More

Estrada-Gutierrez, G., Bravo-Flores, E., Ortega-Castillo, V., Flores-Rueda, V., Mancilla-Herrera, I., Espino Y Sosa, S., Sánchez-Martínez, M., Perichart-Perera, O., Solis-Paredes, M. Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping. J. Vis. Exp. (164), e61884, doi:10.3791/61884 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter