Summary
여기에 제시된 것은 단백질과 마이크로 RNA 발현을 조절하기 위해 성숙한 아디포사이클로 작은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA 모방(miRs), 또는 항마이크로RNA(anti-miR)와 같은 올리고뉴클레오티드를 전달하는 프로토콜이다.
Abstract
adipocyte 기능의 변경은 타입-2 당뇨병및 인슐린 저항을 포함하여 신진 대사 질병의 병발생에 기여합니다. 이것은 비만 관련 질병에 대하여 새로운 치료를 개발하기 위하여 안증 기능 장애에 관련시킨 분자 기계장치를 더 잘 이해하는 필요를 강조합니다. 지방세포에서 단백질과 마이크로 RNA의 발현을 조절하는 것은 여전히 매우 어려운 일입니다. 이 논문은 소염성 RNA(siRNA) 및 마이크로 RNA 모방(miR 모방) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 후색 성 전환체에서 단백질과 마이크로 RNA의 발현을 조절하고, 소염포 세포로 소명 섬유아세포를 분화시키는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 역형 형질 프로토콜은 성숙한 송신세포가 첨가되는 세포 배양판에서 복합체를 형성하기 위해 트랜스페션 시약및 올리고뉴클레오티드의 배양을 포함한다. 그런 다음 고뉴클레오티드/트랜스페트 시약 복합체가 있는 경우 부착판 표면에 다시 부착할 수 있다. 인슐린 신호, 포도당 섭취, 리포발생 및 lipolypolysis의 연구와 같은 기능성 분석은 단백질 또는 마이크로 RNA 조작이 백혈구 기능에 미치는 영향을 연구하기 위해 트랜스페드 3T3-L1 성숙한 지방세포에서 수행될 수 있다.
Introduction
비만은 인슐린 저항성 (IR), 타입-2 당뇨병 (T2D), 및 심장 혈관 질병을 포함하여 수많은 신진 대사 질병을 위한 중요한 위험 요소로 간주됩니다1. 현재 치료는 이 질병의 끊임없이 상승 보급을 중단하는 것을 실패하고, 비만과 당뇨병 환자의 IR의 관리는 중요한 임상 문제점 남아 있습니다. 지방 조직은 에너지 항상성의 제어에 중요한 역할을하며, 비만 중 병리학적 확장은 IR 및 T2D2,3의개발에 기여한다. 이것은 비만 관련 질병에 대하여 새로운 치료를 개발하기 위하여 안증 기능 장애에 관련시킨 분자 기계장치를 더 잘 이해하는 필요를 강조합니다. 많은 연구 결과는 지방 세포 생리학에 있는 단백질 코딩 RNA의 역할 및 비만과의 그들의 협회를 조사했습니다.
최근에는 비코딩 RNA(ncRNA), 특히 마이크로 RNA(miRs)의 발견은 유전자 발현 프로그램의 조절 메커니즘과 관련된 새로운 개념을 위조했다. 연구 결과는 ncRNA가 adipocyte 기능의 중요한 레귤레이터이고, 그들의 dysregulation는 신진 대사 질병4에중요한 역할을 한다는 것을 보여주었습니다. 따라서, 백심세포에서 단백질과 ncRNA의 조작은 백혈구 기능에서 그들의 역할및 T2D와 같은 병리에 그들의 충격을 해독하기 위하여 결정적입니다. 그러나, 생체 내뿐만 아니라 1 차 성 구도에서 단백질과 ncRNAs의 발현을 조작하는 것은 시험관 내 분비 세포의 사용을 선호, 매우 도전 남아있다.
Murine 3T3-L1 섬유아세포는 성숙하고 기능적이며 인슐린 반응성 세포세포로 쉽게 분화되며, 이는 세포세포를 연구하는 데 사용되는 잘 특징적인 세포주(예를 들어, 인슐린 신호, 포도당 섭취, lipolysis 및 adipokines 분비)5,6,7,8,9,10. 이러한 특성은 3T3-L1 아디포사이클을 단백질 코딩 및 NC-RNA의 발현을 조절하여 안도 세포 기능에서의 역할과 비만 관련 질환에서의 잠재적 역할을 해독하는 매력적인 모델입니다. 불행히도, 3T3-L1 섬유아세포는 시판기 시약을 사용하여 쉽게 트랜스펙트를 할 수 있지만, 분화된 3T3-L1 세포세포는 트랜스펙트에 가장 어려운 세포주 중 하나입니다. 이것이 3T3-L1 세포에서 유전자 발현을 조작하는 수많은 연구가 교포세포 기능보다는 지방세포 분화에 초점을 맞춘 이유입니다.
장시간, 선포세포를 경화시키는 유일한 효율적인 기술은전기기공5였으며,이는 지루하고 비용이 많이 들며 세포 손상을 일으킬 수 있다. 이 논문은 일반적인 트랜스펙트 시약을 사용하여 역경 질염 기술을 보고하여, 이는 트랜스펙트에 대한 실습 시간을 줄이고, 세포 생존에 영향을 미치지 않으며, 전기기보다 훨씬 저렴합니다. 이 프로토콜은 siRNA 및 마이크로 RNA 모방 (miR 모방) 및 항 miR와 같은 그밖 올리고뉴클레오티드의 질입에 완벽하게 적합합니다. 역형 형질 프로토콜의 원리는 세포 배양판에 복합체를 형성하기 위해 트랜스페트 시약및 올리고뉴클레오티드를 배양한 다음 성숙한 지방세포를 우물로 시드하는 것이다. 이어서, 송신세포는 올리고뉴클레오티드/트랜스페트 시약 복합체의 존재에서 부착판 표면에 재부착한다. 이 간단하고 효율적이며 저렴한 방법론은 지방 세포 기능에서 단백질 코딩 RNA 및 miRs의 역할과 비만 관련 질병에 대한 잠재적 역할에 대한 연구를 허용합니다.
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Protocol
참고: 멸균 기술을 사용하여 라미나르 유동 세포 배양 후드에서 프로토콜의 모든 단계를 수행합니다. 모든 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 뮤린 3T3-L1 섬유아세포를 지방세포로 분화
- 3T3-L1 섬유아세포는 피루바테 없이 배양 배지-DMEM, 25mM 포도당, 10% 신생아 종아리 혈청, 1% 페니실린 및 연쇄절제술(도1A)으로 3T3-L1섬유아세포를 성장시한다. 조직 배양 인큐베이터(7% CO2 및 37°C)에 접시를 놓습니다.
- 인플루언서 후 이틀, 배양 배지를 변경, 피루바테, 25mM 포도당, 10% 태아 종아리 혈청(FCS), 1% 페니실린 및 연쇄상 구균신으로 대체하여 0.25mM 3-이소부틸-1-메틸산틴(IBMX), 0.25 μM dexamethasone, 5 μg/mL
참고: 세포가 100mm 접시당 300,000개의 세포에서 종자될 때 합의에 도달하는 데 5일이 걸립니다. - 이틀 후, 배양 배지를 피루바테, 25mM 포도당, 10% FCS, 1% 페니실린 및 연쇄상 구균시(1% 페니실린 및 연쇄상 구균)로 대체하여 5 μg/mL 인슐린과 10μM 로시글리타존을 2일 동안 배양한다. 이어서, 피루바테, 25mM포도당, 10% FCS, 1% 페니실린 및 연쇄상 구균(도1B)없이DMEM으로 2일마다 세포를 공급한다.
- 3T3-L1 분화는 분화 프로토콜의 시작 후 7-8 일 트랜스펙트.
참고: 트랜스펙트 후 남은 섬유아세포의 확산을 피하기 위해 과잉 변환 전에 높은 수준의 분화(>80%)에 도달하는 것이 중요하며, 이는 결과를 편향시킬 수 있는 세포의 혼합된 집단으로 이어질 것이다.
2. 프리코트 플레이트 준비
- 전 또는 몇 시간 전에, 1 mg/mL의 스톡 용액에서 30% 에탄올에 100 μg/mL에서 콜라겐 타입 I의 용액을 준비한다. 12웰 플레이트의 웰당 250 μL, 24웰 플레이트의 웰당 125 μL을 추가하고 용액을 우물 표면에 퍼놓습니다.
- 콜라겐이 건조 될 때까지 배양 후드 아래에 뚜껑없이 접시를 둡니다. 덜벡코의 인산염 완충식식염(D-PBS)으로 두 번 씻으시다.
참고: 프리코트 플레이트를 구매할 수 있습니다.
3. 형질 전환 믹스의 준비
참고: siRNA의 최종 농도는 1과 100 nM (12 웰 플레이트의 웰 당 siRNA의 1 ~ 100 pmol)사이입니다. miR 모방의 최종 농도는 10 nM (10 pmol /well)입니다. 오프 타겟 효과를 피하기 위해 실험을 시작하기 전에 각 siRNA, miR 모방 또는 기타 올리고뉴클레오티드의 최상의 농도를 결정한다. 결과의 통계 분석을 용이하게하기 위해 삼중에서 형질 전환 실험을 수행합니다. 파이펫팅 중 정상적인 손실을 고려하여 모든 시약을 초과하여 준비합니다.
- 파이펫팅(부피/부피)을 개선된 최소 필수매체(표 1)와함께 siRNA(또는 기타 올리고뉴클레오티드)로 혼합한다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.
- 회광 시약과 개선된 최소 필수 매체를 siRNA에 추가하고 파이펫을 혼합한다(표1). 실온에서 20분 동안 배양하십시오(이 기간 동안 4절로 진행). 콜라겐 코팅 플레이트의 각 웰에 트랜스펙트 믹스를 추가합니다.
4. 3T3-L1 분리구 준비
- D-PBS로 100mm 페트리 접시에 셀을 두 번 씻으시면 됩니다. 5배 트립신을 셀에 추가합니다(100mm 접시당 1mL)를 추가하여 트립신으로 모든 표면을 덮습니다. 30 s를 기다렸다 조심스럽게 트립신을 제거합니다.
- 인큐베이터에서 37°C에서 5-10분 동안 페트리 접시를 배양합니다. 100mm 접시를 탭하여 세포를 분리합니다.
- 피루바테, 25mM 포도당, 10% FCS, 1% 페니실린 및 연쇄절제술없이 DMEM 10ml를 추가하여 트립신을 중화시합니다. 배지를 위아래로 조심스럽게 파이프하여 세포를 분리하고 세포 현탁액을 균질화합니다.
- 말라세즈 카운팅 챔버 또는 자동 세포 카운터를 사용하여 세포를 계산하고 세포의 농도를 6.25 x 105 세포/mL로 조정한다. 종자 800 μL의 셀 서스펜션/웰의 12웰 플레이트(5 x 105 셀) 또는 24웰 플레이트(2.5 x 105 셀)의 셀 서스펜션/웰의 400 μl이 형질 혼합을 함유하고 있다.
참고: 100mm 페트리 접시 1개에 12웰 플레이트 또는 24웰 플레이트 1개를 준비할 수 있습니다. 100mm 접시에는 보통 6-7 x 106 개의 교포세포가 포함되어 있으며, 이는 12 웰 플레이트의 웰 당 5 x 105 교포구에 해당합니다. - 세포 배양 인큐베이터(7% CO2 및 37°C)에서 플레이트를 배양하고 24시간 동안 세포를 방해하지 않는다. 다음 날, 조심스럽게 피루바테, 25 mM 포도당, 10 % FCS, 1 % 페니실린과 연쇄 절제술없이 신선한 DMEM으로 상체를 교체하십시오.
참고: 세포를 콜라겐 전코팅 된 48- 및 96 웰 플레이트로 시드할 수도 있지만, 분포세포의 분리를 피하기 위해 미디어를 교체할 때 더 많은 예방 조치를 취할 수 있습니다.
5. 감염된 3T3-L1 선포세포의 기능분석
- 연구 대상 녹다운 24-48 h 및 48-96 h siRNA 또는 miR 모방 후 mRNA와 단백질에 대 한 전달, 각각.
- 인슐린 신호, 포도당 섭취, 아디포핀 분비, lipolysis 및 리포발생을 연구하기 위해 감염된 지방세포의 기능적 분석을 수행합니다.
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Representative Results
3T3-L1 분광구에서 단백질 또는 마이크로 RNA의 발현을 조절하기 위해 여기에 설명된 역형 형질의 절차를 사용하여, 형포세포는 트랜스펙션 후 그들의 형태를 보존하는 것으로나타났다(도 1B,C). 실제로, 2일 후, 대포세포는 잘 퍼지고 접시에 부착되어 성숙한 3T3-L1 의 특징인 다중 지질 방울을 제시했다. 지질 함량은 전과 감염및 비과감염형(도1D,E)과다르지 않았다. 더욱이, 퍼록시소 증식활성 수용체 감마2(Pparγ2),아디포넥틴(Adipoq), 포도당 수송기 4 또는 솔루트 캐리어 패밀리 2 멤버와 같은 분화 마커의 mRNA 발현 4(Slc2a4),인슐린 수용체 기판 1(Irs1),perilipin-1(Plin1)은비 과감염 된 지방 세포(도 1F)에비해 전과 된 세포에서 변경되지 않았습니다. 이러한 역형 형질 프로토콜은 >70%의 선도체가 전염됨에 따라 효율적입니다(도1G,H).
Perilipin-1은 지질 방울 형성을 촉진하고 lipolysis를 억제하는 것으로 알려진 지방 세포 별 단백질입니다. 여기서, 3T3-L1 분광세포는 Plin1(si-PLIN1)에 대하여 스크램블된 siRNA(si-SCR) 또는 siRNA로 전감염되었다. si-PLIN1을 가진 transfection 후 3 일, Plin1의 mRNA 수준은 70% 감소했습니다(그림 2A)및 단백질 수준은 63%(도 2B,C). PLIN1 발현은 또한 형광 현미경 검사법에 의해 4일 후에 분석되었고, 대조군 비도(도2D-F)에서의발현에 비해 92% 감소한 것으로 나타났으며, 따라서 트랜스페션 프로토콜과 si-PLIN1 모두의 효능을 입증하였다.
이 프로토콜은 또한 miR-34a(도3A)의발현을 조절하기 위해 마이크로 RNA 모방(miR 모방) 올리고뉴클레오티드를 이용한 대포세포의 역경전을 수행하는 데 사용되었다. miR-34a의 과발현은 VAMP2 단백질 발현의 감소를 50%(도3B,C),miR-34a11,12의확인된 표적으로 이끌었다. 마지막으로, 이 연구는 3T3-L1 선포세포의 역형 질이 인슐린 자극에 그들의 기능 및 반응성을 보존한다는 것을 보여줍니다. 실제로 3T3-L1 아디포사이클로 Plin1의 낙하로 인해 기저 리폴리시스(그림4A)가증가했습니다. 더욱이, 3T3-L1 아디포사이클로 miR-34a의 과발현은 인슐린 유도 단백질 키나아제 B 인산화(도4B,C)및 포도당섭취량(도 4D)의억제로 이어졌다.
그림 1: 3T3-L1 섬유아세포의 분화는 성숙한 지방세포로 분화한다. (A)3T3-L1 섬유아세포는 100mm 접시당 3 x 105 세포의 밀도로 종자하였다. 대표 10 x 브라이트 필드 이미지 3T3-L1 섬유 아 세포 2 일 후. (B)3T3-L1 섬유아세포는 4일(4일까지) 분화 칵테일 믹스를 사용하여 교포세포로 분화하였다. 3T3-L1 섬유아세포의 대표적인 10x 브라이트필드 이미지는 아디포세포로 분화(7일). 다중 알로큘러 지질 방울이있는 지방 세포는 쉽게 식별 할 수 있습니다. (C)3T3-L1 분리구는 7일째에 si-SCR에 감염되었다. 전형적인 10x 브라이트필드 영상의 트랜스폴트 3T3-L1(9일). 상기 형포세포의 형태는 비감염된 대포세포의 형태와 비슷하며, 이는 형질전환 방법이 부드럽고 대포세포에 독성이 없다는 것을 암시한다. 스케일 바: 50 μm.(D-E)3T3-L1 교반구는 7일째(상부 패널)에 si-SCR으로 감염되었다. 비감염 된 세포 (낮은 패널). 이틀 후, 세포는 기름 레드 O로 배양되어 지질을 더럽히게했습니다. (D)플레이트 내의 스테인드 셀의 대표적인 이미지와 대표 10배 의 브라이트필드 이미지가 표시됩니다. 스케일 바: 50 μm.(E)세포에 통합된 오일 레드 오는 2-프로판올로 용출되고 분광계를 사용하여 정량화하였다. 데이터는 비트랜스감염 된 세포의 흡수도가 1로 정규화되어 임의 단위로 표현됩니다. 결과는 세 가지 독립적 인 실험의 평균 + SEM으로 표현됩니다. 통계 분석은 학생의 t-시험에의해 수행되었다. (F)3T3-L1 선포세포는 si-SCR으로 감염되었다. 전멸 후 3일 후, 세포는 총 RNA를 분리하기 위해 수확되었다. adipocyte 분화 마커의 발현은 qRT-PCR에 의해 측정되고 36B4 RNA 수준을 사용하여 정규화되었다. 데이터는 비트랜스감염 된 세포 (1로 정규화되고 점선으로 표현)에 비해 전감염된 세포에서 mRNA 발현을 나타내며 3 개의 독립적 인 실험의 평균 + SEM으로 표현됩니다. 통계 분석은 학생의 t-시험에의해 수행되었다. (G-H) 3T3-L1 선포세포는 si-SCR 또는 형광염(FAM)-표지된 si-RNA로 전염되고 커버립에 도금되었다. 3T3-L1 선포세포는 형광 현미경 검사법에 의해 8시간 후에 분석되었다. (G)전염된 3T3-L1 세포의 대표적인 단일 평면 이미지가 도시된다. (H)총 세포 수에 비해 FAM 양성 세포의 정량화. 데이터는 형광 시-RNA를 포함하는 세포의 백분율로 표현된다. 통계 분석은 Mann-Whitney 시험, ****p < 0.0001을 사용하여 수행되었습니다. 약어: si-SCR = 스크램블 siRNA; SEM = 평균의 표준 오류; qRT-PCR = 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응; FAM = 형광신 아미디테; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌; si-FAM = FAM 라벨 si-RNA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 3T3-L1 선도에서 단백질 침묵. 3T3-L1 아디포사이클은 Plin1(si-PLIN1)에 대한 스크램블 시-RNA(si-SCR) 또는 si-RNA로 전감염되었다. (A) 플린1의 mRNA 발현은 혈전 후 3일 후 qRT-PCR에 의해 측정되었다. mRNA 발현은 36B4 RNA 수준을 사용하여 정규화되고 임의 단위로 발현되었으며, si-SCR 처리된 세포가 1로 정규화되었다. 결과는 4개의 독립적인 실험의 평균 + SEM으로 표현됩니다. 통계 분석은 학생의 t-test, **p < 0.01을 사용하여 수행되었다. (B-C) 트랜스펙트 후 3일 후, 단백질 리스는 PLIN1 및 HSP90(로딩 제어)에 대한 항체로 서부 블로팅을 실시하였다. 대표적인 면역블롯이 표시됩니다. (C)PLIN1의 양은 밀도 검사 분석에 의해 정량화되고 HSP90의 양을 사용하여 정규화하였다. 데이터는 임의 단위로 표현되며, si-SCR 처리된 세포는 1로 정규화된다. 결과는 4개의 독립적인 실험의 평균 + SEM으로 표현됩니다. 통계 분석은 학생의 t-test, *p < 0.05를 사용하여 수행되었습니다. (D-F) 3T3-L1 선포세포는 si-SCR 또는 si-PLIN1로 전감염되어 커버립에 도금되었습니다. PLIN1의 발현은 형광 현미경 검사법에 의해 96h 나중에 분석되었다. (D)항페리핀 항체와 항토끼-Alexa647-공주 항체로 염색된 3T3-L1 아디포사이클의 대표적인 단일 평면 이미지가 나타났다. 스케일 바 = 10 μm.(E)상업용 소프트웨어를 사용하여 3D로 분할된 3T3-L1 분리형의 3차원(3D) 볼륨 렌더링. 스케일 바 = 10 μm.(F)총 셀 수에 비해 PLIN1 신호 강도의 정량화. 데이터는 임의 단위로 표현되며, si-SCR 처리된 세포는 100%로 정규화됩니다. 통계 분석은 Mann-Whitney 시험, ****p < 0.0001을 사용하여 수행되었습니다. 약어: si-SCR = 스크램블 siRNA; si-PLIN1 = Plin1에 대한 siRNA; 플린1 = 페리핀-1; HSP90 = 열 충격 단백질 90; SEM = 평균의 표준 오류; qRT-PCR = 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응; FAM = 형광신 아미디테; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌; IB = 면역 블로팅. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 3T3-L1 선포세포에서 마이크로 RNA 과발현. 3T3-L1 선포세포는 대조마이크로RNA 모방(miR-control) 또는 마이크로 RNA 34a 모방(miR-34a)으로 전감염되었다. 3일 후, 세포는(A)RNA 추출 또는(B)단백질 용해제제를 위해 수확하였다. (A)miR-34a의 발현은 qRT-PCR에 의해 측정되었다. miR 발현은 U6 의 작은 RNA 수준을 사용하여 정규화되고 임의 단위로 표현되었으며, miR 대조군 처리 된 세포가 1로 정규화되었다. 결과는 세 가지 독립적 인 실험의 평균 + SEM으로 표현됩니다. 통계 분석은 학생의 t-test, *p < 0.05를 사용하여 수행되었습니다. (B)단백질 용액은 VAMP2 및 TUBulIN(로딩 제어)에 대하여 지시된 항체로 서쪽 블로팅을 실시하였다. 3개의 독립적인 실험의 대표적인 면역blot가 표시됩니다. (C)VAMP2의 양은 밀도 검사 분석에 의해 정량화되고 TUBulIN의 양을 사용하여 정규화되었다. 데이터는 miR 대조군 세포가 1로 정규화되어 임의 단위로 표현됩니다. 결과는 세 가지 독립적 인 실험의 평균 + SEM으로 표현됩니다. 통계 분석은 학생의 t-테스트,*p < 0.05에 의해 수행되었다. 약어: SEM = 평균의 표준 오류; qRT-PCR = 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응; VAMP2 = 소포 관련 막 단백질 2; IB = 면역 블로팅. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 3T3-L1 아디포사이클 기능에서 단백질 또는 마이크로 RNA 변조의 효과. (A)3T3-L1 선포세포는 si-SCR 또는 si-PLIN1로 형편화되었다. 배지는 형질 전환 후 24h를 변경한 다음 48시간 후에 수집하여 기저 lipolysis를 측정하였다. 결과는 매체(μg/mL)에서 방출되는 글리세롤로 표현되며, 4개의 독립적인 실험의 평균 + SEM으로 표현된다. 통계 분석은 학생의 t-test, ***p < 0.001을 사용하여 수행되었습니다. (B)3T3-L1 선포세포는 miR-대조군 또는 miR-34a로 전감염되었다. 배지는 경질 후 24시간 변경되었고, 48시간 후, 배지는 고갈 배지(pyruvate 없이 DMEM, 25mM 포도당, 1% 페니실린 및 연쇄절제술, 및 0.5% BSA)로 변경되었다. 이어서, 세포는 5분 동안 0.5nM 인슐린으로 치료하였다. 세포는 인-PKB 및 PKB(로딩 제어)에 대한 항체로 서양 블로팅을 위한 단백질 용액을 준비하기 위해 수확하였다. 3개의 독립적인 실험의 대표적인 면역blot가 표시됩니다. (C)인계-PKB의 양은 밀도 검사 분석에 의해 정량화되고 총 PKB양을 사용하여 정규화하였다. 데이터는 인슐린으로 치료된 miR 대조세포와 함께 임의 단위로 1로 정규화된다. 결과는 세 가지 독립적 인 실험의 평균 + SEM으로 표현됩니다. 통계 분석은 인슐린으로 치료된 miR 대조군 세포에 비해 양방향 ANOVA 시험, *p < 0.05를 사용하여 수행하였다. (D)3T3-L1 세포는 miR-대조군 또는 miR-34a로 전감염되었다. 배지는 경질 후 24시간 변경되었고, 48시간 후, 배지는 6h의 고갈 매체로 변경되었다. 이어서, 세포는 20분 동안 0.5nM 인슐린으로 치료하였다. (2-3H)의 섭취는 3분 이상 측정하였다. 데이터는 임의 단위로 표현되며, miR 대조군 처리 된 세포에서 기저 포도당 섭취가 1로 정규화된다. 결과는 세 가지 독립적 인 실험의 평균 + SEM으로 표현됩니다. 통계 분석은 인슐린으로 치료된 miR 대조군 세포에 비해 양방향 ANOVA 시험, *p < 0.05를 사용하여 수행하였다. 약어: si-SCR = 스크램블 siRNA; si-PLIN1 = Plin1에 대한 siRNA; SEM = 평균의 표준 오류; PKB = 단백질 키나아제 B; p-PKB = 인광-PKB; miR-CTL = miR 제어; DMEM = 덜벡코의 수정된 독수리 매체; BSA = 소 세럼 알부민; ANOVA = 분산 분석; IB = 면역 블로팅. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 웰 당 (12 웰 플레이트) | 웰 당 (24 웰 플레이트) | |
| 올리고뉴클레드 | 20 μL | 10 μL |
| (si-RNA, miR...) | ||
| 개선된 최소 필수 매체 | 20 μL | 10 μL |
| 경질 시약 | 5.6 μL | 2.8 μL |
| 개선된 최소 필수 매체 | 154.4 μL | 77.2 μL |
| 총 형질량의 형질 전환 믹스 | 200 μL | 100 μL |
표 1: 12웰 및 24웰 플레이트 형식에 필요한 트랜스펙션 시약.
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Discussion
이 논문은 성숙한 지방세포의 분화 및 트랜스포션을 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 역형 형질 방법은 시나, 마이크로 RNA 모방, 항마이크로 RNA 모방, 항마이크로RNA 와 같은 올리고뉴클레오티드를 트랜스펙트하는 가장 어려운 세포주 중 하나인 3T3-L1 아디포사이클로 전환하는 간단하고 경제적이며 매우 효율적인 방법입니다. 이 메서드에는 고려해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이 프로토콜은 플라스미드 DNA를 가진 형질 전환에 대 한 효율적이 지 않습니다., 기능의 이득 연구에 대 한이 기술의 유용성을 제한 하는. 3T3-L1 세포주를 포함하는 뮤린 세포주, 전형적으로 체외에서 반포세포 기능을 연구하는 데 사용되었지만, 미세 RNA 발현 패턴 및 뮤린 조직에서의 활동은 종종 인간에서 관찰된 것과 다르다. 이것은 또한 1 차적인 세포 및 세포주를 가진 케이스입니다. 더욱이, 3T3-L1 섬유아세포의 분화에 사용되는 배지는 비생리성 호르몬 칵테일(인슐린, 덱사메타손, IBMX 및 로시글리타존)을 필요로 하며, 분화세포는 생체내 성숙한 지방세포와 형태적으로 구별된다: 그들은 외측 지질 방울 대신 다중 로큘러 지질 방울을 제시한다. 이것은 시험관 내및 생체 내 연구 사이 유전자 발현 그리고 세포 반응에 있는 몇몇 다름을 설명할 수 있었습니다.
전기 기화에 비해이 역 형질 프로토콜을 사용하는 한 가지 이점은이 방법이 저렴하다는 것입니다. 실제로, 시약은 덜 비싸고, 역형의 고효율은 필요한 올리고뉴클레오티드의 양을 감소시키고, 전기포레이터와 같은 고가의 장비가 필요하지 않다. 또한, siRNA의 낮은 농도를 사용 하 여 그것은 오프 타겟 효과 방지 하기 때문에 도움이. 또한, 이 역형 형질은 세포수를 줄이고 전기기화에 비해 우수한 세포 생존력과 더 강력한 데이터를 보장하는 쉽고 빠르며 부드러우며 간단한 형질 전환 방법입니다. 상세절차는 마우스 3T3-L1 세포의 분화 및 역형 에 최적화되어 있지만, 인간 프리디포세포는 또한 adipocytes5로 분화될 수 있고 이 프로토콜을 사용하여 역형 전멸을 용이하게 할 수 있다. 이 보고서는 비 리포소포피 양피 양용 삼피성 경피 시약의 새로운 세대를 사용하여 역형 전환 후 세포가 실행 가능하고 건강하며 인슐린에 반응한다는 것을 보여줍니다. 역형 은 다른 인기있는 형질 시약을 사용하여 수행 될 수 있습니다. 그러나, 올리고뉴클레오티드 및 경질 시약의 양은 발현의 좋은 변조와 세포 생존에 대한 부작용을 보장하기 위해 최적화될 필요가 있을 것이다.
이 프로토콜은 아디포시스 기능에서 단백질 및 마이크로 RNA의 역할에 대한 연구를 용이하게하지만, 또한 lnc-RNA, Y-RNA 또는 eRNA와 같은 다른 비 코딩 RNA를 조절하는 데 사용될 수 있습니다. 프로토콜에는 프로시저의 효율성에 영향을 미칠 수 있는 중요한 단계가 있습니다. 3T3-L1 섬유아세포의 분화는 주의 깊게 모니터링되어야 한다. 실험의 결과를 편향시킬 수 있는 과잉 이식 후 남은 섬유아세포의 확산을 피하기 위해 높은 수준의 분화에 도달하는 것이 중요합니다. 또 다른 중요한 점은 새로 차별화 된 성숙한 지방세포에 대한 형질 전환을 수행하는 것입니다. 가장 좋은 타이밍은 분화 칵테일을 제거 한 후 3-4 일에 해당하는 분화 프로토콜의 시작 후 7-8 일입니다. 이것은 강력한 형질 작용 효험을 보장하고 접시에 대한 선포세포의 좋은 재부착을 선호합니다. 마지막으로, 트립신과 지방 세포의 치료는 세포를 손상시키지 않고 지방 세포의 분리를 보장하기 위해 주의 깊게 모니터링되어야한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 INSERM, 유니버시테 코트 다쥐르, 프랑스 국립 연구기관(ANR)이 향후 우수 연구소(Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01)와 우수 이니셔티브(Idexex UCAJEDI ANR-15-IDEX)를 통해 지원되었습니다. J.J.는 소시에테 프랑코폰 뒤 디아베테(SFD), 협회 프랑수아즈 데 에뛰드 에 드 레베시테(AFERO), 인스티투트 테마티크 멀티 유기체 테크놀로지스 부어 라 산테(ITMO), 벤자민-데레서트의 보조금으로 지원된다. J.G.는 ANR-18-CE14-0035-01에 의해 지원됩니다. J-F.T.는 ANR 보조금 ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01및 퐁당 부어 라 레체르체 메디칼 (Equipe FRM, DEQ20180839587)에 의해 지원됩니다. 또한 GIS IBISA 현미경 검사법과 이미징 플랫폼 코트 다쥐르(MICA)가 지원하는 콘세일 데파르테멘탈 데 알프스-마리타임스와 레지온 PACA가 지원하는 C3M의 이미징 코어 시설에 도 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
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