Dit artikel beschrijft een protocol voor de manipulatie van moleculaire doelen in de hersenschors met behulp van adeno-geassocieerde virussen en voor het monitoren van de effecten van deze manipulatie tijdens wakkerheid en slaap met behulp van elektrocorticografische opnames.
Het gebruik van elektrocorticografische (ECoG) opnames bij knaagdieren is relevant voor slaaponderzoek en voor de studie van een breed scala aan neurologische aandoeningen. Adeno-geassocieerde virussen (AAV’s) worden steeds vaker gebruikt om het begrip van hersencircuits en hun functies te verbeteren. De AAV-gemedieerde manipulatie van specifieke celpopulaties en/of van precieze moleculaire componenten is enorm nuttig geweest om nieuwe slaapregulerende circuits/moleculen en belangrijke eiwitten te identificeren die bijdragen aan de nadelige effecten van slaapverlies. Bijvoorbeeld, remmende activiteit van de filamenteuze actine-scheidende eiwit cofiline met behulp van AAV voorkomt slaaptekort-geïnduceerde geheugenstoornis. Hier wordt een protocol beschreven dat de manipulatie van de cofilinefunctie in een hersenschorsgebied combineert met de registratie van ECoG-activiteit om te onderzoeken of corticale cofiline de wakkerheid en slaap-ECoG-signalen moduleert. AAV-injectie wordt uitgevoerd tijdens dezelfde chirurgische procedure als de implantatie van ECoG- en elektromyografische (EMG)-elektroden bij volwassen mannelijke en vrouwelijke muizen. Muizen worden verdoofd en hun hoofden worden geschoren. Na huidreiniging en incisie worden stereotaxic-coördinaten van de motorische cortex bepaald en wordt de schedel op deze locatie doorboord. Een canule voorgevuld met een AAV die cofilineS3Duitdrukt, een inactieve vorm van cofiline, wordt langzaam in het corticale weefsel geplaatst. Na AAV-infusie worden met goud bedekte schroeven (ECoG-elektroden) door de schedel geschroefd en op de schedel gecementeerd met gouden draden die in de nekspieren zijn ingebracht (EMG-elektroden). De dieren krijgen drie weken de tijd om te herstellen en te zorgen voor voldoende expressie van cofilineS3D. Het geïnfecteerde gebied en celtype worden geverifieerd met behulp van immunohistochie en de ECoG wordt geanalyseerd met behulp van visuele identificatie van waakzaamheidstoestanden en spectrale analyse. Samengevat maakt deze gecombineerde methodologische benadering het mogelijk om de precieze bijdrage van moleculaire componenten te onderzoeken die neuronale morfologie reguleren en connectiviteit met de regulering van gesynchroniseerde hersenschorsactiviteit tijdens wakkerheid en slaap.
Elektro-encefalografische (of over het algemeen elektrocorticografische [ECoG] bij knaagdieren) en elektromyografische (EMG) opnames worden uitgebreid gebruikt in slaaponderzoek en meer in het algemeen in neurowetenschappen, neurologie en psychiatrie. In combinatie maken deze elektrofysiologische signalen het mogelijk waakzaamheidstoestanden te identificeren en de daaropvolgende kwantificering van de toestandsduur en spectrale samenstelling, zowel bij mensen als bij knaagdieren1,2,3,4. Een dergelijke kwantificering is nuttig geweest om te begrijpen hoe slaap wordt gewijzigd in pathologische omstandigheden zoals neurodegeneratieve ziekten en modellen5,6,7 of door genetische modificatie8,9. Bijvoorbeeld, de knock-out (KO) van verschillende genen gekoppeld aan neuronale communicatie bleek de duur van wakkerheid en slaap te veranderen in zowel de muis als fruitvlieg10,11,12,13. Om mogelijke ontwikkelingscompensatie als gevolg van de studie van full-body KO bij knaagdieren aan te pakken en een fijnere controle van genetische manipulatie mogelijk te maken, is een efficiënte manier om genexpressie te manipuleren het gebruik van adeno-geassocieerde virussen (AAV’s). Een AAV-gemedieerde genetische manipulatie kan worden gebruikt om een bepaald moleculair doel te verlagen of te upreguleren en om de manipulatie te beperken tot een specifieke celpopulatie met behulp van verschillende soorten promotors14. AAV ‘s worden ook veel gebruikt als leveringsmethode in de geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR)/Cas9-technologie15,16. Deze methodologieën maken een betere temporele en ruimtelijke controle van genetische manipulatie mogelijk, wat over het algemeen wordt geassocieerd met de expressie van een verslaggever die kwantificering van het geïnfecteerde gebied met behulp van immunofluorescentie toestaat.
AAV ‘s vertegenwoordigen ook de belangrijkste vector voor celtypespecifieke manipulaties van neuronale activiteit via optogenetica en chemogenetica17,18,19, die veel zijn gebruikt in recent onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten, gedrag, cognitie en slaap20,21,22. In slaaponderzoek is de toepassing van optogenetica voor de activering of remming van bepaalde hersengebieden, zoals de basale voorhersenen, hypothalamus en sublaterodorsaal tegmentum, nuttig geweest om hun rol te bepalen bij de controle van opwinding, langzame slaap (ook bekend als niet-snelle oogbewegingsslaap), paradoxale slaap (of snelle oogbewegingsslaap) en kataplexie23, 24,25. Bovendien hebben AAV-gemedieerde manipulaties geholpen bij het ophelderen van belangrijke slaapregulerende circuits en moleculen die bijdragen aan de nadelige effecten van slaapverlies26,27,28. Een eiwit dat bijvoorbeeld betrokken blijkt te zijn bij slaaptekort-geïnduceerde geheugenstoornissen is cofiline29,30. Dit eiwit is een filamenteus actine-scheidend eiwit dat deelneemt aan de reorganisatie van actinefilamenten door zich fysiek te binden aan actine en de demontage van de filamenten op een dynamische manier te bevorderen31. Het remmen van cofiline-activiteit met behulp van een AAV-gemedieerde aanpak bleek wervelkolomverlies te voorkomen, evenals synaptische plasticiteit en geheugentekorten veroorzaakt door slaaptekort bij muizen29. Gezamenlijk benadrukken deze studies het nut en de relevantie van AAV-gemedieerde manipulaties om slaapregulatie en de gevolgen van slaaptekort bij knaagdieren te begrijpen.
Hier wordt een protocol beschreven dat ECoG- en EMG-elektrodeimplantatie en -opname combineert met de manipulatie van de cofilinefunctie in een hersenschorsgebied van wilde muizen (WT) met behulp van een AAV. Meer precies, een AAV (serotype 9) die de coderingssequentie van een fosfomimetische vorm van de muiscofiline (cofilineS3D)uitdrukt, waardoor deze inactief wordt32,33, wordt geïnjecteerd in de motorische cortex (M1 en M2). Een ECoG-elektrode wordt direct op de injectieplaats geïmplanteerd om de gesynchroniseerde corticale activiteit van de geïnfecteerde cellen te registreren. De ECoG/EMG-opname wordt drie weken na de operatie gedurende 24 uur onder ongestoorde omstandigheden uitgevoerd om herstel, aanpassing en hoge cofilineS3D-expressie mogelijk te maken. De registratie wordt vervolgens gebruikt voor de identificatie van waakzaamheidstoestanden en ECoG-spectrale analyse , zoals beschreven in eerdere studies11,34. Deze methodologie kan specifiek onthullen hoe corticale cofiline wakkerheid en slaap ECoG-signalen bij muizen moduleert. Deze combinatie van elektrofysiologische opnames en AAV-gemedieerde genetische manipulatie is bijzonder relevant om de rol van verschillende moleculaire elementen in specifieke hersenfuncties te onderzoeken en kan worden toegepast op corticale (en subcorticale) hersenruimte(s) die van belang zijn voor WT en genetisch gemodificeerde muizen van beide geslachten en zelfs andere soorten.
Dit protocol beschrijft een nauwkeurige en eenvoudige methode om de ECoG- en EMG-activiteit te monitoren tijdens de manipulatie van moleculaire doelen met behulp van AAV’s. Voor een adequate vergelijking tussen de groepen wordt ten zeerste aanbevolen om chirurgische procedures (AAV-injectie en elektrodeimplantatie) altijd op dezelfde dag te plannen voor test- en controledieren en hun elektrofysiologische signalen tegelijkertijd op te nemen. Om een vergelijkbare virale expressie tussen de test- en controledieren te verkrijgen, is het injecteren van dezelfde virale titer wenselijk. In het onderhavige geval was de virale Titer van controle-AAV teruggebracht tot de helft van de test-AAV om een vergelijkbare virale expressie te garanderen. Experimenteerders moeten zeer voorzichtig zijn met metingen van stereotaxic coördinaten om te zorgen voor een lage variabiliteit tussen dieren in hersengebied / corticale laagtargeting. Aangezien de injectiediepte wordt berekend vanaf het schedeloppervlak en de schedeldikte varieert afhankelijk van leeftijd en geslacht, moet de plaatsing van de canule altijd worden gecontroleerd met behulp van postprotocol histologie of immunohistochemie (bijv. figuur 2) om een adequate positionering/diepte van de injectie te garanderen, en de stereotaxic-coördinaten moeten indien nodig worden aangepast. Gedurende de 40 minuten durende AAV-injectie is het erg belangrijk om de injectiesnelheid te controleren om mogelijke problemen zoals pompblokkades snel te detecteren en te corrigeren. Sommige experimentele stappen zijn ook cruciaal om optimale elektrofysiologische signalen te verkrijgen. Draai bijvoorbeeld niet te veel tijdens elektrodeimplantatie; schroeven moeten minstens 2,5 mm uit de schedel steken om schade aan de hersenschors en de vorming van een glialitteken te minimaliseren. Daarna is het ook enorm belangrijk om i) te voorkomen dat cement op de uiteinden van de elektroden wordt aangebracht, ii) ervoor te zorgen dat de elektroden snel aan de connector worden gesoldeerd, en iii) ervoor te zorgen dat er geen contact is tussen de elektroden.
De hier gepresenteerde procedure voor ECoG- en EMG-opname is uiterst goed ingeburgerd, eenvoudig en wordt veel gebruikt om wakkerheid en slaap bij muizen2,11,13,34te controleren. Continue ECoG- en EMG-opnamen kunnen meerdere opeenvolgende dagen (en zelfs weken) worden uitgevoerd en genereren een zeer rijke dataset die kan worden gebruikt om verschillende analyselijnen uit te voeren, bestaande uit variabelen met betrekking tot wakkerheid en slaaphoeveelheid en architectuur2,11,12 (bijv. tijd doorgebracht in verschillende toestanden per lichte en donkere periode, aantal afleveringen van elke toestand, 24-h verdeling van de slaap), wakkerheid en slaapspectraal gehalte34,41 (bijv. vermogen in verschillende frequentiebanden [vergelijkbaar met figuur 3],schaalvrije activiteit) en kenmerken van individuele golven42,43,44 (bijv. langzame golfamplitude en helling). Bij gebruik in combinatie met AAV-gemedieerde moleculaire manipulaties is een bijkomend voordeel het vermijden van potentiële ontwikkelingscompensatie die kan optreden bij transgene dieren. Met de praktijk kan de hele procedure, inclusief de 40-min AAV-injectie, in ongeveer 90 minuten worden uitgevoerd. Het sterftecijfer moet (zeer) laag zijn omdat de operatie minimaal invasief is.
Het gelijktijdige gebruik van ECoG/EMG-opname en gerichte manipulatie met AAV biedt een verscheidenheid aan andere voordelen en toepassingen. De precisie van stereotaxic targeting, wanneer adequaat uitgevoerd, is bijvoorbeeld zeer hoog en reproduceerbaar en is nuttig om de specifieke rol van een bepaald hersengebied (en/of een celtype of een moleculair element binnen de regio) in de regulering van slaap of andere fysiologische processen te bepalen. Verschillende corticale gebieden kunnen dus gemakkelijk worden gericht met behulp van aanpassingen van het huidige protocol. Bovendien kunnen doelmanipulaties met behulp van AAV’s worden gericht op een corticale / subcorticale gebied dat verschilt van de ECoG-opnamelocaties. In dergelijke gevallen kan het braamgat voor AAV-injectie worden bedekt met een kleine glazen afdeklip die is bevestigd met tandcement (of botwas). Voor verbeterde specificiteit bevat de AAV-constructie vaak een promotor die gerichte infectie van een nauwkeurig celtype14mogelijk maakt. Een CamKIIα promotor werd in het huidige protocol gebruikt om specifiek excitatory piramidale cellen14,29,45van de motorische cortex te richten. Deze strategie heeft de inactivatie van cofiline mogelijk gemaakt (met behulp van cofilineS3D)32,33 in excitatory neuronen van de motorische cortex en de observatie van staatsspecifieke veranderingen in ECoG-activiteit ( Figuur3). Om de effectiviteit van infectie/transductie te beoordelen, konden toekomstige protocolgebruikers het gepresenteerde AAV-ECoG-protocol combineren met een van co-kleuring door immunofluorescentie, en hoge vergrotingsafbeeldingen gebruiken om het aantal cellen te berekenen dat dubbel labeling toont van het totale aantal cellen met single-labeling van het doel (hier CaMKIIα-expresserende neuronen). In een recente studie werd een AAV-ECoG-methode vergelijkbaar met de hier beschreven methode gebruikt om fragiele X mentale retardatie syndroom-gerelateerde eiwit 1 (FXR1) in alle neuronen van de motorische cortex uit te expressie te brengen met behulp van een AAV met een synapspromotor en onthulde een effect van deze manipulatie op de verdeling van de waakzaamheidstoestand en spectrale inhoud28. Deze bevindingen illustreren hoe het manipuleren van een bepaald molecuul in een doelhersengebied met behulp van AAV’s rollen kan onthullen in de regulering van specifieke wakkerheids-/slaapparameters.
Een beperking van het beschreven protocol is de kleine laesie van hersenweefsel die optreedt met canuleplaatsing voordat de AAV-injectie wordt uitgevoerd, wat ook gepaard kan gaan met een ontstekingsreactie. Dit kan met name van belang zijn bij het uitvoeren van AAV-injecties in subcorticale gebieden en moet altijd worden aangepakt met behulp van adequate controles. Als alternatief zou het huidige protocol kunnen worden gevolgd door de kwantificering van reactieve gliose en/of microgliale activering (bv. met behulp van immunofluorescentie) om vergelijkbare niveaus in controle- en testgroepen te garanderen, en dus op de ECoG-uitlezing. Een tweede beperking heeft betrekking op het risico van een slechte verbinding tussen een elektrode en de connector, wat kan leiden tot een continu of soms slecht elektrofysiologisch signaal. Stevig geschroefde, gesoldeerde en gecementeerde elektroden minimaliseren de incidentie van dit probleem. Een derde beperking houdt verband met dieren die tijdens de opname via de hoofdmontage worden vastgebonden, wat de voortbeweging en ander gedrag, althans tot op zekere hoogte, kan beperken en af en toe kan leiden tot bekabelingsschade en signaalverlies. Ten slotte is het gepresenteerde protocol meer geschikt voor volwassen muizen, aangezien de schedelgrootte van jongere dieren problemen kan veroorzaken bij het installeren van de afgebeelde hoofdmontage, zoals eerder beschreven2.
Gecombineerde ECoG/EMG-opname en AAV-gemedieerde manipulatie van een nauwkeurig doel is ook van toepassing op andere onderzoeksgebieden dan de neurowetenschappen van slaap. Het kan onder andere worden gebruikt om epileptische gebeurtenissen in diermodellen van epileptische aanvallen te bestuderen en te manipuleren en is een krachtig hulpmiddel om hersenschommelingen te moduleren die betrokken zijn bij geheugencodering en consolidatie46,47. Dienovereenkomstig omvatten potentiële toepassingen zeker de gebieden van fundamenteel onderzoek in de psychiatrie en neurologie, waaronder neurodegeneratieve ziekten. Naast het vermogen om een inactieve vorm van een molecuul uit te drukken, kunnen en zijn AAV’s gebruikt om te overexpresseren of te downreguleren (bijv. klein interfererend RNA, CRISPR/Cas9) of om de expressie van een molecuul in een full-body KO te redden. Belangrijk is dat de dubbele methodologie van het huidige protocol ook van toepassing is op andere zoogdiersoorten zoals ratten en dag knaagdieren die interessante modellen vertegenwoordigen om zowel slaap als neurodegeneratie te begrijpen48,49.
The authors have nothing to disclose.
Het werk werd gefinancierd door de Canada Research Chair in Sleep Molecular Physiology. De auteurs zijn Chloé Provost en Caroline Bouchard dankbaar voor de technische hulp.
Surgery peparation | |||
21 G needle | Terumo | NN-2125R | |
6-channel connector | ENA AG | BPHF2-O6S-E-3.2 | Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below |
Distrelec | 300-93-672 | Potential replacement for discontinued connector above | |
C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | 000664 | B6 | Animals bred on site |
Pluronic F-68 | Non-ionic surfactant | ||
Gold wire 0.2 mm diameter | Delta scientific | 920-862-41 | Non-insulated |
Hamilton syringe (10 μL) | Fisher Scientific | 14815279 | |
Infusion syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
Injection cannula 28 G | Plastics one | C313l-SPCL | |
Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
Ketamine (10 mg/mL) | SANDOZ | 4550 | |
Lead-free solder | AIM | SN100C | |
Lubricating ophthalmic ointment | ALLERGAN | 210889 | |
PE 50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
Flat fillister head self tapping screws | MORRIS | FF00CE125 | ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length |
Soldering iron | Weller | WES51 | |
Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
Trimmer | Harvard Apparatus | 72-9063 | |
Xylazine (20 mg/mL) | Bayer | 2169592 | |
Intracortical AAV injection with syringe pump | |||
0.7 mm drill bit | Dremel | 628 | |
AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA | UPenn Viral Core | ||
AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP | UPenn Viral Core | ||
Cotton tippped applicators | Medicom | 806 | |
Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
Extra-fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
Stereotaxic arm | Stoelting | 51604U | |
Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
Surgical clamps | Fine science tools | 18050-28 | |
Tissue scissor | Magna Stainless | M4-124 | |
ECoG/EMG electrode implantation | |||
Buprenorphine (0.3 mg/mL) | CEVA | 57133-02 | |
Curved forceps | Fine science tools | 11001-12 | |
Delicate task wipers | Kimtech | 34120 | |
Dental acrylic cement | Yates Motloid | 44115 | |
Dumont #5 forceps | Fine science tools | 91150-20 | |
Extra fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
Kelly forceps | Fine science tools | 13002-10 | |
Liquid acrylic | Yates Motloid | 44119 | |
Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting | Ethicon | MCP494 | |
Providone-iodine 10% | Triad disposables | 10-8208 | |
RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2 | 3M | 56849 | |
Immunofluorescence and ECoG recording | |||
36-Channel EEG Wearable Headbox | LaMONT Medical | 832-000350 | |
CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2) | Invitrogen | 13-7300 | Dilution 1:500 |
Conductors Awg PVC Insulation Cable | Calmont Wire & Cables | HC-0819075R0 | |
Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilution 1:1000 |
Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Dilution 1:500 |
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb | Cell signaling | 3724 | Dilution 1:800 |
Programmable Amplifier | LaMONT Medical | 815-000002-S2 | |
Stellate Harmonie | Natus | HSYS-REC-LT2 | |
Swivel connector | Crist Instrument Company Inc. | 4-TBC-9-S |