Cet article décrit un protocole pour la manipulation de cibles moléculaires dans le cortex cérébral à l’aide de virus adéno-associés et pour surveiller les effets de cette manipulation pendant l’éveil et le sommeil à l’aide d’enregistrements électrocorticographiques.
L’utilisation d’enregistrements électrocorticographiques (ECoG) chez les rongeurs est pertinente pour la recherche sur le sommeil et pour l’étude d’un large éventail de maladies neurologiques. Les virus adéno-associés (AAV) sont de plus en plus utilisés pour améliorer la compréhension des circuits cérébraux et de leurs fonctions. La manipulation médiée par l’AAV de populations cellulaires spécifiques et/ ou de composants moléculaires précis a été extrêmement utile pour identifier de nouveaux circuits/molécules régulateurs du sommeil et des protéines clés contribuant aux effets néfastes de la perte de sommeil. Par exemple, l’inhibition de l’activité de la cofiline, une protéine filamenteuse coupant l’actine, à l’aide d’AAV, prévient les troubles de la mémoire induits par la privation de sommeil. Ici, un protocole est décrit qui combine la manipulation de la fonction de cofiline dans une zone du cortex cérébral avec l’enregistrement de l’activité ECoG pour examiner si la cofiline corticale module les signaux ECoG d’éveil et de sommeil. L’injection d’AAV est effectuée au cours de la même intervention chirurgicale que l’implantation d’électrodes ECoG et électromyographiques (EMG) chez des souris mâles et femelles adultes. Les souris sont anesthésisées et leur tête est rasée. Après le nettoyage de la peau et l’incision, les coordonnées stéréotaxiques du cortex moteur sont déterminées et le crâne est percé à cet endroit. Une canule préremplie avec un AAV exprimant la cofilineS3D,une forme inactive de cofiline, est lentement positionnée dans le tissu cortical. Après l’infusion d’AAV, des vis recouvertes d’or (électrodes ECoG) sont vissées à travers le crâne et cimentées au crâne avec des fils d’or insérés dans les muscles du cou (électrodes EMG). Les animaux ont droit à trois semaines pour récupérer et assurer une expression suffisante de la cofilineS3D. La zone infectée et le type de cellule sont vérifiés à l’aide de l’immunohistochimie, et l’ECoG est analysé à l’aide de l’identification visuelle des états de vigilance et de l’analyse spectrale. En résumé, cette approche méthodologique combinée permet d’enquêter sur la contribution précise des composants moléculaires régulant la morphologie neuronale et la connectivité à la régulation de l’activité synchronisée du cortex cérébral pendant l’éveil et le sommeil.
Les enregistrements électroencéphalographiques (ou généralement électrocorticographiques [ECoG] chez les rongeurs) et électromyographiques (EMG) sont largement utilisés dans la recherche sur le sommeil ainsi que plus largement dans les neurosciences, la neurologie et la psychiatrie. En combinaison, ces signaux électrophysiologiques permettent l’identification des états de vigilance et la quantification ultérieure de la durée de l’état et de la composition spectrale, tant chez l’homme que chez les rongeurs1,2,3,4. Une telle quantification a été utile pour comprendre comment le sommeil est modifié dans des conditions pathologiques telles que les maladies neurodégénératives et les modèles5,6,7 ou par modification génétique8,9. Par exemple, il a été démontré que le knockout (KO) de différents gènes liés à la communication neuronale modifiait la durée de l’éveil et du sommeil chez la souris et la mouche des fruits10,11,12,13. Pour s’attaquer à la compensation développementale potentielle découlant de l’étude de l’KO du corps entier chez les rongeurs et pour permettre un contrôle plus fin de la manipulation génétique, un moyen efficace de manipuler l’expression des gènes consiste à utiliser des virus adéno-associés (AAV). Une manipulation génétique médiée par l’AAV peut être utilisée pour régularier à la baisse ou à la hausse une cible moléculaire donnée et pour limiter la manipulation à une population cellulaire spécifique en utilisant différents types de promoteurs14. Les AAV sont également largement utilisés comme méthode d’administration dans la technologie CRISPR (Clustered Regularly Interspaced short palindromic repeats)/Cas915,16. Ces méthodologies permettent un meilleur contrôle temporel et spatial de la manipulation génétique, qui est généralement associée à l’expression d’un rapporteur permettant la quantification de la zone infectée par immunofluorescence.
Les AAV représentent également le principal vecteur de manipulations spécifiques au type cellulaire de l’activité neuronale via l’optogénétique et la chimiogénétique17,18,19, qui ont été largement utilisées dans des recherches récentes sur les maladies neurodégénératives, le comportement, la cognition et le sommeil20,21,22. Dans la recherche sur le sommeil, l’application de l’optogénétique pour l’activation ou l’inhibition de certaines régions du cerveau, telles que le cerveau antérieur basal, l’hypothalamus et le tegmentum sous-latéral, a été utile pour déterminer leurs rôles dans le contrôle de l’excitation, du sommeil à ondes lentes (également connu sous le nom de sommeil à mouvement oculaire non rapide), du sommeil paradoxal (ou sommeil à mouvement oculaire rapide) et de la cataplexie23, 24,25. En outre, les manipulations médiées par l’AAV ont permis d’élucider d’importants circuits de régulation du sommeil et des molécules contribuant aux effets néfastes de la perte de sommeil26,27,28. Par exemple, une protéine qui s’est avérée impliquée dans les troubles de la mémoire induits par la privation de sommeil est la cofiline29,30. Cette protéine est une protéine filamenteuse coupant l’actine qui participe à la réorganisation des filaments d’actine en se liant physiquement à l’actine et en favorisant le désassemblage des filaments de manière dynamique31. Il a été démontré que l’inhibition de l’activité de la cofiline à l’aide d’une approche médiée par l’AAV prévient la perte de colonne vertébrale ainsi que la plasticité synaptique et les déficits de mémoire induits par la privation de sommeil chez la souris29. Collectivement, ces études soulignent l’utilité et la pertinence des manipulations médiées par l’AAV pour comprendre la régulation du sommeil et les conséquences de la privation de sommeil chez les rongeurs.
Ici, un protocole est décrit qui combine l’implantation et l’enregistrement d’électrodes ECoG et EMG avec la manipulation de la fonction cofiline dans une zone du cortex cérébral de souris de type sauvage (WT) à l’aide d’un AAV. Plus précisément, un AAV (sérotype 9) exprimant la séquence codante d’une forme phosphomimétique de la cofiline de souris (cofilineS3D),la rendant inactive32,33,est injecté dans le cortex moteur (M1 et M2). Une électrode ECoG est implantée directement sur le site d’injection pour assurer l’enregistrement de l’activité corticale synchronisée des cellules infectées. L’enregistrement ECoG/EMG est effectué pendant 24 heures dans des conditions non perturbées trois semaines après la chirurgie pour permettre la récupération, l’adaptation et l’expression élevée de cofilineS3D. L’enregistrement est ensuite utilisé pour l’identification des états de vigilance et l’analyse spectrale ECoG, comme décrit dans les études précédentes11,34. Cette méthodologie peut révéler spécifiquement comment la cofiline corticale module les signaux ECoG de l’éveil et du sommeil chez la souris. Cette combinaison d’enregistrements électrophysiologiques et de manipulation génétique médiée par l’AAV est particulièrement pertinente pour étudier les rôles de divers éléments moléculaires dans des fonctions cérébrales spécifiques et pourrait être appliquée à des zones cérébrales corticales (et sous-corticales) d’intérêt chez les souris WT et génétiquement modifiées des deux sexes et même d’autres espèces.
Ce protocole décrit une méthode précise et simple pour surveiller l’activité ECoG et EMG lors de la manipulation de cibles moléculaires à l’aide d’AAV. Pour une comparaison adéquate entre les groupes, il est fortement recommandé de toujours planifier les interventions chirurgicales (injection d’AAV et implantation d’électrodes) le même jour pour les animaux d’essai et de contrôle, et d’enregistrer simultanément leurs signaux électrophysiologiques. Pour obtenir une expression virale similaire entre les animaux d’essai et les animaux témoins, l’injection du même titre viral est souhaitable. En l’espèce, le titre viral de l’AAV témoin avait été réduit à la moitié de l’AAV testé pour assurer une expression virale similaire. Les expérimentateurs doivent être très prudents avec les mesures des coordonnées stéréotaxiques pour assurer une faible variabilité entre les animaux dans le ciblage de la zone cérébrale / couche corticale. De plus, étant donné que la profondeur d’injection est calculée à partir de la surface du crâne et que l’épaisseur du crâne varie selon l’âge et le sexe, l’emplacement de la canule doit toujours être vérifié à l’aide de l’histologie ou de l’immunohistochimie post-protocole (p. ex., la figure 2)pour assurer un positionnement et une profondeur d’injection adéquats, et les coordonnées stéréotaxiques doivent être ajustées si nécessaire. Tout au long de l’injection d’AAV de 40 minutes, il est très important de surveiller la vitesse d’injection pour détecter et corriger rapidement les problèmes potentiels tels que le blocage de la pompe. Certaines étapes expérimentales sont également cruciales pour obtenir des signaux électrophysiologiques optimaux. Par exemple, ne pas trop visser pendant l’implantation de l’électrode; les vis doivent sortir du crâne d’au moins 2,5 mm pour minimiser les dommages au cortex cérébral et la formation d’une cicatrice gliale. Par la suite, il est également extrêmement important de i) éviter d’appliquer du ciment aux extrémités des électrodes, ii) assurer une soudure rapide des électrodes au connecteur et iii) s’assurer qu’il n’y a pas de contact entre les électrodes.
La procédure présentée ici pour l’enregistrement ECoG et EMG est extrêmement bien établie, simple et largement utilisée pour surveiller l’éveil et le sommeil chez les souris2,11,13,34. Les enregistrements ECoG et EMG continus peuvent être effectués pendant plusieurs jours consécutifs (et même des semaines) et générer un ensemble de données très riche qui peut être utilisé pour effectuer plusieurs lignes d’analyse comprenant des variables liées à l’éveil et à la quantité de sommeil et à l’architecture2,11,12 (par exemple, le temps passé dans différents états par période de lumière et d’obscurité, le nombre d’épisodes de chaque état, Distribution du sommeil sur 24 heures), l’éveil et le contenu spectral du sommeil34,41 (par exemple, puissance dans différentes bandes de fréquences [similaire à la figure 3], activité sans échelle) et caractéristiques des ondes individuelles42,43,44 (par exemple, amplitude et pente des ondes lentes). Lorsqu’il est utilisé en combinaison avec des manipulations moléculaires médiées par l’AAV, un avantage supplémentaire est d’éviter la compensation développementale potentielle qui peut se produire chez les animaux transgéniques. Avec la pratique, toute la procédure, y compris l’injection d’AAV de 40 minutes, peut être effectuée en environ 90 minutes. Le taux de mortalité devrait être (très) faible car la chirurgie est peu invasive.
L’utilisation simultanée de l’enregistrement ECoG/EMG et de la manipulation ciblée avec AAV offre une variété d’autres avantages et applications. Par exemple, la précision du ciblage stéréotaxique, lorsqu’il est correctement effectué, est très élevée et reproductible et est utile pour déterminer le rôle spécifique d’une région cérébrale donnée (et / ou d’un type cellulaire ou d’un élément moléculaire dans la région) dans la régulation du sommeil ou d’autres processus physiologiques. Plusieurs zones corticales différentes peuvent ainsi être facilement ciblées en utilisant des adaptations du protocole actuel. De plus, les manipulations de cibles à l’aide d’AAV pourraient être dirigées vers une zone corticale/sous-corticale différente des sites d’enregistrement ECoG. Dans de tels cas, le trou de bavure pour l’injection d’AAV pourrait être recouvert d’un petit couvercle en verre fixé à l’aide de ciment dentaire (ou de cire d’os). Pour une spécificité accrue, la construction AAV comprend souvent un promoteur qui permet une infection ciblée d’un type cellulaire précis14. Un promoteur CamKIIα a été utilisé dans le présent protocole pour cibler spécifiquement les cellules pyramidales excitatrices14,29,45du cortex moteur. Cette stratégie a permis l’inactivation de la cofiline (en utilisant la cofilineS3D)32,33 dans les neurones excitateurs du cortex moteur et l’observation de changements spécifiques à l’état dans l’activité ECoG (Figure 3). Pour évaluer l’efficacité de l’infection / transduction, les futurs utilisateurs du protocole pourraient combiner le protocole AAV-ECoG présenté avec celui de la co-coloration par immunofluorescence, et utiliser des images à fort grossissement pour calculer le nombre de cellules montrant un double étiquetage du nombre total de cellules montrant un seul étiquetage de la cible (ici, neurones exprimant CaMKIIα). Dans une étude récente, une méthode AAV-ECoG similaire à celle décrite ici a été utilisée pour surexprimer la protéine 1 liée au syndrome de retard mental de l’X fragile (FXR1) dans tous les neurones du cortex moteur à l’aide d’un AAV contenant un promoteur de synapsine et a révélé un effet de cette manipulation sur la distribution de l’état de vigilance et le contenu spectral28. Ces résultats illustrent comment la manipulation d’une molécule donnée dans une région cérébrale cible à l’aide d’AAV peut révéler des rôles dans la régulation de paramètres spécifiques d’éveil / sommeil.
Une limitation du protocole décrit est la petite lésion du tissu cérébral survenant avec la mise en place de la canule avant d’effectuer l’injection d’AAV, qui pourrait également être accompagnée d’une réponse inflammatoire. Cela pourrait être particulièrement préoccupant lors de l’injection d’AAV dans les zones sous-corticales et devrait toujours être abordé en utilisant des contrôles adéquats. Alternativement, le protocole actuel pourrait être suivi par la quantification de la gliose réactive et/ou de l’activation microgliale (par exemple, en utilisant l’immunofluorescence) pour assurer des niveaux similaires dans les groupes témoins et d’essai et, par conséquent, sur la lecture ECoG. Une deuxième limitation concerne le risque de mauvaise connexion entre une électrode et le connecteur, ce qui pourrait entraîner un signal électrophysiologique continu ou parfois mauvais. Des électrodes solidement vissées, soudées et cimentées minimiseront l’incidence de ce problème. Une troisième limitation est liée au fait que les animaux sont attachés via le montage de la tête pendant l’enregistrement, ce qui pourrait limiter la locomotion et d’autres comportements, au moins dans une certaine mesure, et entraîner parfois des dommages au câblage et une perte de signal. Enfin, le protocole présenté est plus approprié pour les souris adultes, étant donné que la taille du crâne des animaux plus jeunes peut entraîner des difficultés dans l’installation du montage de tête représenté, comme décrit précédemment2.
L’enregistrement combiné ECoG/EMG et la manipulation médiée par AAV d’une cible précise sont également applicables à des domaines de recherche autres que les neurosciences du sommeil. Entre autres, il pourrait être utilisé pour étudier et manipuler les événements épileptiques dans des modèles animaux de crise et est un outil puissant pour moduler les oscillations cérébrales impliquées dans le codage et la consolidation de la mémoire46,47. En conséquence, les applications potentielles englobent certainement les domaines de la recherche fondamentale en psychiatrie et en neurologie, y compris les maladies neurodégénératives. En plus de la capacité d’exprimer une forme inactive d’une molécule, les AAV peuvent et ont été utilisés pour surexprimer ou réduire la normale (par exemple, l’ARN interférent petit, CRISPR / Cas9) ou pour sauver l’expression d’une molécule dans un KO du corps entier. Il est important de noter que la double méthodologie du protocole actuel est également applicable à d’autres espèces de mammifères telles que les rats et les rongeurs diurnes qui représentent des modèles intéressants pour comprendre à la fois le sommeil et la neurodégénérescence48,49.
The authors have nothing to disclose.
Les travaux ont été financés par la Chaire de recherche du Canada en physiologie moléculaire du sommeil. Les auteurs remercient Chloé Provost et Caroline Bouchard pour leur aide technique.
Surgery peparation | |||
21 G needle | Terumo | NN-2125R | |
6-channel connector | ENA AG | BPHF2-O6S-E-3.2 | Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below |
Distrelec | 300-93-672 | Potential replacement for discontinued connector above | |
C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | 000664 | B6 | Animals bred on site |
Pluronic F-68 | Non-ionic surfactant | ||
Gold wire 0.2 mm diameter | Delta scientific | 920-862-41 | Non-insulated |
Hamilton syringe (10 μL) | Fisher Scientific | 14815279 | |
Infusion syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
Injection cannula 28 G | Plastics one | C313l-SPCL | |
Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
Ketamine (10 mg/mL) | SANDOZ | 4550 | |
Lead-free solder | AIM | SN100C | |
Lubricating ophthalmic ointment | ALLERGAN | 210889 | |
PE 50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
Flat fillister head self tapping screws | MORRIS | FF00CE125 | ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length |
Soldering iron | Weller | WES51 | |
Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
Trimmer | Harvard Apparatus | 72-9063 | |
Xylazine (20 mg/mL) | Bayer | 2169592 | |
Intracortical AAV injection with syringe pump | |||
0.7 mm drill bit | Dremel | 628 | |
AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA | UPenn Viral Core | ||
AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP | UPenn Viral Core | ||
Cotton tippped applicators | Medicom | 806 | |
Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
Extra-fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
Stereotaxic arm | Stoelting | 51604U | |
Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
Surgical clamps | Fine science tools | 18050-28 | |
Tissue scissor | Magna Stainless | M4-124 | |
ECoG/EMG electrode implantation | |||
Buprenorphine (0.3 mg/mL) | CEVA | 57133-02 | |
Curved forceps | Fine science tools | 11001-12 | |
Delicate task wipers | Kimtech | 34120 | |
Dental acrylic cement | Yates Motloid | 44115 | |
Dumont #5 forceps | Fine science tools | 91150-20 | |
Extra fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
Kelly forceps | Fine science tools | 13002-10 | |
Liquid acrylic | Yates Motloid | 44119 | |
Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting | Ethicon | MCP494 | |
Providone-iodine 10% | Triad disposables | 10-8208 | |
RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2 | 3M | 56849 | |
Immunofluorescence and ECoG recording | |||
36-Channel EEG Wearable Headbox | LaMONT Medical | 832-000350 | |
CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2) | Invitrogen | 13-7300 | Dilution 1:500 |
Conductors Awg PVC Insulation Cable | Calmont Wire & Cables | HC-0819075R0 | |
Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilution 1:1000 |
Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Dilution 1:500 |
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb | Cell signaling | 3724 | Dilution 1:800 |
Programmable Amplifier | LaMONT Medical | 815-000002-S2 | |
Stellate Harmonie | Natus | HSYS-REC-LT2 | |
Swivel connector | Crist Instrument Company Inc. | 4-TBC-9-S |