ניצול של גראפיקס לאיתור אינטראקציות חולפות של Saccharomyces cerevisiae Spliceosome subcomplexes
Summary
כאן, אנו מתארים את הניצול של Grafix (קיבוע הדרגתי), צנטריפוגה הדרגתית גליצריול בנוכחות crosslinker, כדי לזהות אינטראקציות בין גורמי שיתוף שנקשרים באופן חולף לקומפלקס spliceosome.
Abstract
שיתוף טרום-mRNA הוא תהליך דינמי מאוד הכולל סידורים מולקולריים רבים של תת-קומפלקסים spliceosome במהלך הרכבה, עיבוד RNA, ושחרור של הרכיבים המורכבים. צנטריפוגציה הדרגתית גליצל שימשה להפרדת חלבונים או מתחמי RNP (RiboNucleoProtein) למחקרים פונקציונליים ומבניים. כאן, אנו מתארים את הניצול של Grafix (קיבוע הדרגתי), אשר פותח לראשונה כדי לטהר ולייצב מתחמים macromolecular עבור מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונים חלקיק יחיד, כדי לזהות אינטראקציות בין גורמי חוג שנקשרים ארעית למתחם spliceosome. שיטה זו מבוססת על צנטריפוגה של דגימות לריכוז הולך וגדל של ריאגנט קיבעון לייצוב מתחמים. לאחר צנטריפוגה של שמרים סה”כ תמציות טעון על שיפועים גליצריול, שברים התאושש מנותחים על ידי כתם נקודה לזיהוי של תת-מתחמים spliceosome וקביעה של נוכחות של גורמי splicing בודדים.
Introduction
שכפול הוא תהליך דינמי ביותר הדורש כריכה ושחרור של מספר רב של גורמים באופן מתואם. גורמי חוג אלה כוללים חלבונים מחייבים RNA, ATPases, helicases, קינאז חלבון ופוספטסות, רצועות בכל מקום, בין היתר1,2,3; ולאפשר את הסידורים המולקולריים להתקיים, חלק מהגורמים האלה נקשרים באופן ארעי מאוד לתת-קומפלקסים של spliceosome, מה שהופך את הבידוד והזיהוי של מתחמי ביניים אלה RNP מאתגרים מאוד.
כאן, השתמשנו בשיטת Grafix4,5 כדי לייצב את האינטראקציה של גורם חיבור שמרים Cwc24 עם קומפלקסB act 6 כדי לאפשר זיהוי של גורמים אחרים הקשורים במקביל לתת-קומפלקס זה ולקבוע אם ligase Ubiquitin Prp19 ממלא תפקיד כלשהו בכריכה או שחרור של Cwc24 למתחם תשע עשרה (NTC) ולסוף 5 ‘ של האינטרון לפני ההפעלה ותגובת הטרנססטרציה הראשונה לוקחת מקום. היתרון של חשיפת macromolecules לריכוז הולך וגדל של crosslinker לאורך שיפוע הגליצריול הוא שהוא נמנע בין מתחמים crosslinks4,5, ולכן, היווצרות של אגרגטים.
שיטה זו שימשה כהשלמה לקוימונופרציפיטציה של חלבון ובדיקות משיכה, שלמרות שאפשרו בידוד של מתחמים גדולים, לא יכול להיות אמין לשמירה על אינטראקציות חולפות בתוך מתחמים דינמיים גדולים7,8. השימוש ריאגנטים קיבעון בשיפוע הגליצריול מייצב את הכריכה של גורמים כאלה, ומאפשר אישור של אינטראקציות של חלבונים ספציפיים עם subcomplexes חוג. מכיוון שהקישור הנבחר היה בלתי הפיך מבחינה כימית, חלבונים שנמצאים בשברים שנמצאו נותחו על ידי כתם נקודה לאחר צנטריפוגת ההדרגה.
Protocol
Representative Results
Discussion
חלבון-חלבון וחומצות ריבונוקלאיות-חלבון אינטראקציות ניתן לייצב באמצעות חומרים crosslinking. חשוב כי המתחם המתקבל יציב לעמוד ultracentrifugation על מעבר צבע גליצריול. בנוסף, תנאי המאגר אמורים לאפשר את האינטראקציה, אך מחמירים מספיק כדי להימנע מאיגוד לא ספציפי. בניסויים המוצגים כאן, השתמשנו בפתרון חיץ שכבר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק FAPESP (15/06477-9).
Materials
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).
- Yan, C., Wan, R., Shi, Y. Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).
- Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases. Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).
- Kastner, B., et al. GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).
- Stark, H. Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).
- Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution. Science. 353 (6302), 895-904 (2016).
- Ohi, M. D., et al. Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs. Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).
- Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes. Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).
- Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. Preparation and fractionation of yeast splicing extract. Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3′ splice site selection. Genes & Development. 9, 855-868 (1995).
- Dunn, E. A., Rader, S. D., Hertel, K. J. Preparation of yeast whole cell splicing extract. Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1126, 123-135 (2014).
- Hill, H. D., Straka, J. G. Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents. Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).
- Cepeda, L. P., et al. The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast. The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).
- Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J. Yeast mRNA splicing in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14780-14792 (1985).
