Gebruik van Grafix voor de detectie van transiënte interactoren van Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexen
Summary
Hier beschrijven we het gebruik van Grafix (Gradient Fixation), een glycerol gradiënt centrifugatie in de aanwezigheid van een crosslinker, om interacties te identificeren tussen splicingfactoren die tijdelijk binden aan het spliceosoomcomplex.
Abstract
Pre-mRNA splicing is een zeer dynamisch proces dat veel moleculaire herschikkingen van de spliceosoomsubcomplexen omvat tijdens assemblage, RNA-verwerking en afgifte van de complexe componenten. Glycerol gradiënt centrifugatie is gebruikt voor de scheiding van eiwit of RNP (RiboNucleoProtein) complexen voor functionele en structurele studies. Hier beschrijven we het gebruik van Grafix (Gradient Fixation), dat voor het eerst werd ontwikkeld om macromoleculaire complexen te zuiveren en te stabiliseren voor cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje, om interacties te identificeren tussen splicingfactoren die tijdelijk binden aan het spliceosoomcomplex. Deze methode is gebaseerd op het centrifugeren van monsters in een toenemende concentratie van een fixatiereagens om complexen te stabiliseren. Na centrifugering van gisttotaalextracten geladen op glycerolgradiënten, worden teruggewonnen fracties geanalyseerd door dot blot voor de identificatie van de spliceosoomsubcomplexen en bepaling van de aanwezigheid van individuele splicingfactoren.
Introduction
Splicing is een zeer dynamisch proces dat vereist dat een veelheid aan factoren op een gecoördineerde manier wordt gebonden en vrijgegeven. Deze splicingfactoren omvatten RNA-bindende eiwitten, ATPasen, helicases, eiwitkinasen en fosfatasen, ubiquitine-ligases, onder andere1,2,3; en om de moleculaire herschikkingen mogelijk te maken, binden sommige van deze factoren zeer tijdelijk aan de spliceosoomsubcomplexen, waardoor de isolatie en identificatie van deze RNP-intermediaire complexen zeer uitdagend is.
Hier gebruikten we de Grafix-methode4,5 om de interactie van de gistsplitsingsfactor Cwc24 met hetB-actcomplex 6 te stabiliseren om de identificatie van andere factoren die gelijktijdig aan dat subcomplex gebonden zijn mogelijk te maken en te bepalen of het ubiquitineligase Prp19 een rol speelt bij de binding of afgifte van Cwc24 aan het Nineteen (NTC) -complex en aan het 5′-uiteinde van het intron voordat activering en de eerste transesterificatiereactie plaatsvindt plaats. Het voordeel van het blootstellen van de macromoleculen aan een toenemende concentratie van de crosslinker langs de glycerolgradiënt is dat het inter-complexen crosslinks4,5en dus de vorming van aggregaten vermijdt.
Deze methode werd gebruikt als aanvulling op eiwitcoimmunoprecipitatie en pull-down assays, die, ondanks het feit dat ze de isolatie van grote complexen mogelijk maken, mogelijk niet betrouwbaar zijn voor het handhaven van voorbijgaande interacties binnen grote dynamische complexen7,8. Het gebruik van fixatiereagentia in de glycerolgradiënt stabiliseert de binding van dergelijke factoren, waardoor de bevestiging van interacties van specifieke eiwitten met splicing subcomplexen mogelijk is. Omdat de gekozen crosslinker chemisch onomkeerbaar was, werden eiwitten die aanwezig waren in de teruggewonnen fracties geanalyseerd door dot blot na de gradiëntcentrifugatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eiwit-eiwit en ribonucleïnezuur-eiwit interacties kunnen worden gestabiliseerd met behulp van crosslinking middelen. Het is belangrijk dat het resulterende complex stabiel is om ultracentrifugatie op glycerolgradiënt te weerstaan. Bovendien moeten de buffervoorwaarden de interactie mogelijk maken, maar streng genoeg zijn om niet-specifieke binding te voorkomen. In de hier getoonde experimenten gebruikten we een bufferoplossing die al was vastgesteld voor in vitro splicingreacties15.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een FAPESP-subsidie (15/06477-9).
Materials
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).
- Yan, C., Wan, R., Shi, Y. Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).
- Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases. Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).
- Kastner, B., et al. GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).
- Stark, H. Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).
- Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution. Science. 353 (6302), 895-904 (2016).
- Ohi, M. D., et al. Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs. Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).
- Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes. Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).
- Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. Preparation and fractionation of yeast splicing extract. Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3′ splice site selection. Genes & Development. 9, 855-868 (1995).
- Dunn, E. A., Rader, S. D., Hertel, K. J. Preparation of yeast whole cell splicing extract. Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1126, 123-135 (2014).
- Hill, H. D., Straka, J. G. Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents. Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).
- Cepeda, L. P., et al. The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast. The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).
- Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J. Yeast mRNA splicing in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14780-14792 (1985).
