استخدام Grafix للكشف عن المتفاعلات العابرة من Saccharomyces cerevisiae التشبيكليسومات الفرعية
Summary
هنا، ونحن نصف استخدام Grafix (تثبيت التدرج)، والطرد المركزي التدرج الجلسرين في وجود crosslinker، لتحديد التفاعلات بين عوامل الربط التي تربط عابرا إلى مجمع اللصق.
Abstract
الربط قبل مرنا هي عملية ديناميكية للغاية التي تنطوي على العديد من الإعادة ترتيب الجزيئية من الربط الفرعي اللصقات أثناء التجميع، وتجهيز الحمض النووي الريبي، والإفراج عن المكونات المعقدة. وقد استخدم الطرد المركزي التدرج الجلسرين لفصل البروتين أو RNP (ريبونوكليوبروتين) مجمعات للدراسات الوظيفية والهيكلية. هنا ، ونحن نصف استخدام Grafix (تثبيت التدرج) ، والتي وضعت لأول مرة لتنقية واستقرار المجمعات الجزيئية الكلية للجسيم واحد المجهر الكريكترون المبرد ، لتحديد التفاعلات بين عوامل الربط التي تربط عابرة لمجمع الربط. وتستند هذه الطريقة إلى الطرد المركزي للعينات في تركيز متزايد من كاشف التثبيت لتحقيق الاستقرار في المجمعات. بعد الطرد المركزي من خلاصات الخميرة الإجمالية المحملة على تدرجات الجلسرين ، يتم تحليل الكسور المستردة بواسطة نقطة لطخة لتحديد المجمعات الفرعية اللصق وتحديد وجود عوامل الربط الفردية.
Introduction
الربط هو عملية ديناميكية للغاية تتطلب ربط وإطلاق العديد من العوامل بطريقة منسقة. وتشمل هذه العوامل الربط البروتينات ملزمة الجيش الملكي النيبالي, ATPases, هيليكيس, كيناس البروتين وفوسفاتاسيس, ليغاسي في كل مكان, من بين أمور أخرى1,2,3; وللسماح لإعادة ترتيب الجزيئية أن يحدث، بعض هذه العوامل ربط عابر جدا إلى الربط الفرعي، مما يجعل عزل وتحديد هذه المجمعات المتوسطة RNP صعبة للغاية.
هنا، استخدمنا طريقة Grafix4،5 لتحقيق الاستقرار في التفاعل بين عامل الربط الخميرة Cwc24 معB act complex6 للسماح بتحديد العوامل الأخرى المرتبطة بيكوبليكس وتحديد ما إذا كان وpp19 ubiquitin ligase يلعب أي دور في ربط أو الافراج عن Cwc24 إلى تسعة عشر (NTC) المعقدة و إلى نهاية 5 ‘من intron قبل التنشيط وأول رد فعل عبر الترانس يأخذ مكان. ميزة تعريض الجزيئات الكلية لتركيز متزايد من crosslinker على طول التدرج الجلسرين هو أنه يتجنب الوصلات المتقاطعة بين المجمعات4،5، وبالتالي ، تشكيل المجاميع.
وقد استخدمت هذه الطريقة كتكميل للبروتين coimmunoprecipitation والانسحاب إلى أسفل المقايسات، والتي، على الرغم من السماح لعزل المجمعات الكبيرة، قد لا تكون موثوقة للحفاظ على التفاعلات العابرة داخل المجمعات الديناميكية الكبيرة7،8. استخدام الكواشف التثبيت في التدرج الجلسرين يستقر الربط من هذه العوامل، مما يسمح لتأكيد التفاعلات من بروتينات محددة مع الربط subcomplexes. ولأن الوصلة المتقاطعة المختارة لا رجعة فيها كيميائيا، فقد تم تحليل البروتينات الموجودة في الكسور المستردة بواسطة لطخة نقطة بعد الطرد المركزي المتدرجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتين البروتين والريبونوكليك الأحماض البروتين التفاعلات يمكن استقرت باستخدام عوامل الربط المتبادل. من المهم أن يكون المركب الناتج مستقرا لتحمل الطرد المركزي الفائق على تدرج الجلسرين. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تسمح شروط المخزن المؤقت التفاعل ولكن تكون صارمة بما يكفي لتجنب الربط غير مح…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحة FAPESP (15/06477-9).
Materials
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).
- Yan, C., Wan, R., Shi, Y. Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).
- Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases. Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).
- Kastner, B., et al. GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).
- Stark, H. Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).
- Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution. Science. 353 (6302), 895-904 (2016).
- Ohi, M. D., et al. Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs. Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).
- Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes. Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).
- Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. Preparation and fractionation of yeast splicing extract. Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3′ splice site selection. Genes & Development. 9, 855-868 (1995).
- Dunn, E. A., Rader, S. D., Hertel, K. J. Preparation of yeast whole cell splicing extract. Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1126, 123-135 (2014).
- Hill, H. D., Straka, J. G. Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents. Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).
- Cepeda, L. P., et al. The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast. The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).
- Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J. Yeast mRNA splicing in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14780-14792 (1985).
