サッカロミセス・セレビシエ・スプライセソソーム・サブコンプレックスの過渡性インターアクター検出のためのグラフィックスの利用
Summary
ここでは、架橋器の存在下でのグリセロール勾配遠心分離であるグラフィックス(勾配固定)の利用について、一過性にスプライセソーム複合体に結合するスプライシング因子間の相互作用を同定する。
Abstract
プレmRNAスプライシングは、組立、RNA処理、および複合成分の放出中に、多くの分子再構成を伴う非常に動的なプロセスです。グリセリン勾配遠心分離は、機能および構造研究のためのタンパク質またはRNP(RiboNucleoProtein)複合体の分離のために使用されています。ここでは、単一粒子の凍結電子顕微鏡用の高分子複合体を精製・安定化するために最初に開発されたGrafix(勾配固定)の利用について述べ、一過性のスプライセソー複合体と結合するスプライシング因子間の相互作用を同定する。この方法は、複合体を安定化させる固定化試薬の濃度の増加にサンプルの遠心分離に基づいています。グリセロール勾配にロードされた酵母総抽出物の遠心分離後、回収された分率は、個々のスプライシング因子の存在の決定およびスプライセソームサブ複合体の同定のためにドットブロットによって分析される。
Introduction
スプライシングは、多数の因子の結合と解放を必要とする非常に動的なプロセスです。これらのスプライシング因子は、RNA結合タンパク質、ATPAses、ヘリカーゼ、タンパク質キナーゼおよびホスファターゼ、ユビキチンリガーゼ、とりわけ1、2、3を含む。また、分子の再調整を可能にするために、これらの要因のいくつかは、スプライセソームサブコンプレックスに非常に一時的に結合し、これらのRNP中間複合体の単離および同定を非常に困難にする。
ここでは、Grafix法4,5を使用して、酵母スプライシング因子Cwc24とBアクトコンプレックス6との相互作用を安定させ、そのサブ複合体に付随して結合する他の因子を同定し、ユビキチンリガーゼPrp19がCwc24の結合または放出に何らかの役割を果たしているかどうかを判断しました。場所。グリセロール勾配に沿って架橋剤の濃度を増加させる高分子を暴露する利点は、複合体間架橋4、5、したがって、凝集体の形成を回避することです。
この方法は、タンパク質共免疫沈降およびプルダウンアッセイの補完として使用されたが、これは、大きな複合体の単離を可能にするにもかかわらず、大きな動的複合体7,8内の一過性相互作用を維持するために信頼できない可能性がある。グリセロール勾配における固定化試薬の使用は、このような因子の結合を安定化させ、特定のタンパク質とスプライシングサブコンプレックスとの相互作用を確認することを可能にする。選択した架橋剤は化学的に不可逆的であったため、回収された画分に存在するタンパク質を、勾配遠心分離後のドットブロットで分析した。
Protocol
Representative Results
Discussion
タンパク質とリボ核酸-タンパク質相互作用は、架橋剤を使用して安定化することができます。得られた複合体は、グリセロール勾配に対する超遠心化に耐える安定であることが重要である。さらに、バッファー条件では、相互作用を許可する必要がありますが、非特異的なバインドを回避するのに十分な厳格な必要があります。ここに示す実験では、インビトロスプライシング反応<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、FAPESP 認可 (15/06477-9) によってサポートされました。
Materials
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
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