Her beskriver vi bruken av Grafix (Gradient Fixation), en glyserol gradient sentrifugering i nærvær av en krysskobling, for å identifisere interaksjoner mellom skjøtefaktorer som binder seg forbigående til skjøteosomet.
Pre-mRNA skjøting er en veldig dynamisk prosess som innebærer mange molekylære omorganiseringer av skjøteosomets underkomplekser under montering, RNA-behandling og frigjøring av de komplekse komponentene. Glyserol gradient sentrifugering har blitt brukt til separasjon av protein eller RNP (RiboNucleoProtein) komplekser for funksjonelle og strukturelle studier. Her beskriver vi bruken av Grafix (Gradient Fixation), som først ble utviklet for å rense og stabilisere makromolekylære komplekser for enkeltpartikkelkryo-elektronmikroskopi, for å identifisere interaksjoner mellom skjøtefaktorer som binder seg forbigående til skjøteosomet. Denne metoden er basert på sentrifugering av prøver i en økende konsentrasjon av et fikseringsreagens for å stabilisere komplekser. Etter sentrifugering av gjærtotalekstrakter lastet på glyserolgradienter, analyseres gjenopprettede fraksjoner av dot blot for identifisering av skjøteosomets underkomplekser og bestemmelse av tilstedeværelsen av individuelle skjøtefaktorer.
Skjøting er en svært dynamisk prosess som krever binding og frigjøring av en rekke faktorer på en koordinert måte. Disse skjøtefaktorene inkluderer RNA-bindende proteiner, ATPaser, helikaser, proteinkinaser og fosfater, allestedsnærværende ligaer, blant annet1,2,3; og for å tillate molekylære omorganiseringer å finne sted, binder noen av disse faktorene svært forbigående til skjøteosomets underkomplekser, noe som gjør isolasjonen og identifiseringen av disse RNP-mellomkompleksene svært utfordrende.
Her, vi brukte Grafix-metoden4,5 for å stabilisere samspillet mellom gjærspleisefaktoren Cwc24 medB-aktkomplekset 6 for å tillate identifisering av andre faktorer bundet samtidig til den subcomplexen og avgjøre om ubiquitin ligase Prp19 spiller noen rolle i bindingen eller utgivelsen av Cwc24 til Nitten (NTC) komplekset og til 5 ‘ slutten av intron før aktivering og den første transesterifisering reaksjonen tar sted. Fordelen med å utsette makromolekylene for en økende konsentrasjon av krysskoblingen langs glyserolgradienten er at den unngår interkomplekser krysskoblinger4,5, og derfor dannelsen av aggregater.
Denne metoden ble brukt som en komplementering til proteinkoimmunoprecipitation og pull-down analyser, som til tross for å tillate isolering av store komplekser, kanskje ikke er pålitelig for å opprettholde forbigående interaksjoner i store dynamiske komplekser7,8. Bruken av fikseringsreagenser i glyserolgradienten stabiliserer bindingen av slike faktorer, slik at bekreftelsen av interaksjoner av spesifikke proteiner med skjøtende underkomplekser. Fordi den valgte krysskoblingen var kjemisk irreversibel, ble proteiner tilstede i de gjenvunne fraksjonene analysert av prikkflekk etter gradient sentrifugering.
Proteinprotein- og ribonukleinsyreproteininteraksjoner kan stabiliseres ved hjelp av krysskoblingsmidler. Det er viktig at det resulterende komplekset er stabilt for å tåle ultracentrifugation på glyserol gradient. I tillegg bør bufferbetingelsene tillate samhandlingen, men være strenge nok til å unngå ikke-spesifikk binding. I forsøkene som vises her, brukte vi en bufferløsning som allerede er etablert for in vitro skjøtereaksjoner15.
Hastigheten og tiden for…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et FAPESP-tilskudd (15/06477-9).
Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |