Использование Grafix для обнаружения переходных интеракторов Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes
Summary
Здесь мы описываем использование Grafix (Gradient Fixation), центрифугирования градиента глицерина в присутствии сшивающего фактора, для выявления взаимодействий между факторами сплайсинга, которые временно связываются со сплайсеосомным комплексом.
Abstract
Сплайсинг премрнК является очень динамичным процессом, который включает в себя множество молекулярных перестроек подкомплексов сплайсеосом во время сборки, обработки РНК и высвобождения сложных компонентов. Градиентное центрифугирование глицерина было использовано для разделения белковых или RNP (RiboNucleoProtein) комплексов для функциональных и структурных исследований. Здесь мы описываем использование Grafix (Градиентная фиксация), который был впервые разработан для очистки и стабилизации макромолекулярных комплексов для криоэлектроно-микроскопии одиночных частиц, для выявления взаимодействий между факторами сплайсинга, которые временно связываются со сплайсеосомным комплексом. Этот метод основан на центрифугирование образцов в возрастающую концентрацию фиксирующим реагентом для стабилизации комплексов. После центрифугирования дрожжевых общих экстрактов, нагруженных на градиенты глицерина, восстановленные фракции анализируют точечным пятном для выявления подкомплексов сплайсеосом и определения наличия отдельных факторов сплайсинга.
Introduction
Сплайсинг является очень динамичным процессом, который требует скоординированного связывания и высвобождения множества факторов. Эти сплайсинговые факторы включают РНК-связывающие белки, АТФазы, геликазы, протеинкиназы и фосфатазы, убиквитиновые лигазы, среди прочих1,2,3; и чтобы обеспечить молекулярные перестройки, некоторые из этих факторов очень временно связываются с подкомплексами сплайсеосом, что делает выделение и идентификацию этих промежуточных комплексов RNP очень сложной.
Здесь мы использовали методGrafix 4,5 для стабилизации взаимодействия фактора сращивания дрожжей Cwc24 с комплексом 6акта B, чтобы позволитьидентифицировать другие факторы, связанные одновременно с этим подкомплексом, и определить, играет ли убиквитин-лигаза Prp19 какую-либо роль в связывании или высвобождении Cwc24 с комплексом Nineteen (NTC) и с 5′ концом интрона до активации и первой реакции трансетерификации место. Преимущество воздействия макромолекул на возрастающую концентрацию сшивки вдоль градиента глицерина заключается в том, что оно позволяет избежать межкомплексных сшивок4,5,а значит, и образования агрегатов.
Этот метод был использован в качестве дополнения к белкам коиммунопреципитации и вытягивания анализов, которые, несмотря на возможность выделения крупных комплексов, могут быть ненадежными для поддержания переходных взаимодействий в больших динамических комплексах7,8. Применение реагентов фиксации в градиенте глицерина стабилизирует связывание таких факторов, позволяя подтвердить взаимодействие специфических белков со сплайсинговыми подкомплексами. Поскольку выбранный сшиватель был химически необратимым, белки, присутствующие в восстановленных фракциях, анализировали методом точечного пятна после градиентного центрифугирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Взаимодействие белка с белком и рибонуклеиновой кислотой и белком может быть стабилизировано с помощью сшивающих агентов. Важно, чтобы полученный комплекс был стабилен, чтобы выдерживать ультрацентрифугирование на градиенте глицерина. Кроме того, условия буфера должны допускать вза?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом FAPESP (15/06477-9).
Materials
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).
- Yan, C., Wan, R., Shi, Y. Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).
- Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases. Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).
- Kastner, B., et al. GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).
- Stark, H. Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).
- Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution. Science. 353 (6302), 895-904 (2016).
- Ohi, M. D., et al. Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs. Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).
- Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes. Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).
- Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. Preparation and fractionation of yeast splicing extract. Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3′ splice site selection. Genes & Development. 9, 855-868 (1995).
- Dunn, E. A., Rader, S. D., Hertel, K. J. Preparation of yeast whole cell splicing extract. Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1126, 123-135 (2014).
- Hill, H. D., Straka, J. G. Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents. Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).
- Cepeda, L. P., et al. The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast. The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).
- Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J. Yeast mRNA splicing in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14780-14792 (1985).
